转化生长因子-beta基因疫苗预防糖尿病肾病制剂 本发明涉及预防糖尿病合并肾脏病变的保护性新型疫苗，本发明特别涉及新的用于防止糖尿病合并症的基因疫苗，该疫苗能提供抗糖尿病肾脏病变的保护作用。
随着我国改革开放和人民生活水平的提高，糖尿病已成为主要严重危害人民身体健康的疾病，临床流行病学调查结果显示，在中国糖尿病的发病人口近12,000,000，同时发现糖尿病肾脏病变已经成为糖尿病患者致死、致残的主要原因之一。在许多发达国家糖尿病肾脏病变已经成为终末期肾病的主要原因，占透析和肾移植病人的1/3。因此，了解糖尿病肾脏病变的发生机制和防治糖尿病肾脏病变的发生是当前糖尿病研究的重点课题之一。
目前科研工作者们仍然未能明确糖尿病引起肾脏病变的机制。提出糖尿病引起肾脏病变的学说涉及各个领域。其中主要有以下几个：1、与糖尿病发病有关 1)胰岛素基因区胰岛素Ⅰ类等位基因纯合子患糖尿病肾脏病变的危险性为其它类型胰岛素基因类型的2倍。2)人白细胞相关抗原(HLA)HLA-DR3是糖尿病肾脏病变的候选基因。2、与血压调节相关 从目前来看研究的重点集中在肾素-血管紧张素系统Marre等检测62例糖尿病肾脏病变患者，其中37例为早期糖尿病肾病，25例为临床糖尿病肾病。早期肾病组与临床肾病组患者血浆血管紧张素水平无显著性差异，血浆血管紧张素水平与基因型明显相关。3、糖尿病非酶性糖化 糖尿病患者存在糖代谢异常，高血糖可以诱发机体组织与葡萄糖发生非酶性糖化。4、激肽系统 Mayfield等发现糖尿病大鼠尿中激肽释放酶排量低于对照组。5、肾小球组成成分 如Ⅳ型胶原、硫酸肝素等基因编码异常与糖尿病肾病地发病率增高明显相关。尽管对糖尿病肾脏病变的发病机制进行了广泛的研究，然而目前关于糖尿病肾脏病变的所有治疗措施均不能阻止其发生。
现在，临床上所应用于有关糖尿病肾脏病变的治疗主要包括以下几个方面：1、控制血糖 糖尿病血糖水平与糖尿病肾脏病变相关性仍有争论，但是抑制糖尿病血糖长期紊乱有助于延缓糖尿病肾脏病变的发生。2、血压的控制 现在认为糖尿病肾脏病变的发生与高血压控制情况明显相关。世界高血压联盟提出了较高的血压控制水平，在24小时尿蛋白小于1克，血压维持应低于130/80mmHg，并指出血压控制的情况，决定着终末期肾脏病变到达的时间。3、禁止吸烟 吸烟可导致肾血流改变，加重肾脏的负担。这些治疗措施明显延缓糖尿病肾脏病变发生的时间，但不能阻止其发生。因此，预防和治疗糖尿病肾脏病变发生是一个具有普遍性的难题。
有很多资料报道了转化生长因子-beta在糖尿病肾脏病变发病机制中的中心作用。转化生长因子-beta是转化生长因子-beta超家族中的一员，它具有三种同功异构体，其作用在靶细胞的作用位点不同。转化生长因子-beta主要通过自分泌和旁分泌机制发挥其生物功能。在糖尿病肾脏病变动物模型中，转化生长因子-beta mRNA高表达是长期持续存在的，到糖尿病肾脏病变晚期，转化生长因子-beta的表达方呈下降的趋势。Takashi等应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术发现，转化生长因子-beta mRNA的表达在正常大鼠肾脏各个部位均可以检测到。转化生长因子-beta对于维持肾脏结构和功能的稳定起重要作用。但是糖尿病合并肾脏病变时，转化生长因子-beta cDNA明显增高可以导致肾小球硬化，其病理结构表现在肾小球基底膜增厚、肾小球膜基质扩张和细胞外基质的重构。
本发明的目的在于提供一种转化生长因子-beta基因疫苗预防糖尿病肾病制剂，该制剂能有效地预防糖尿病肾脏病变的发生。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案在于采用了一种转化生长因子-beta基因疫苗预防糖尿病肾病制剂，其含有转化生长因子-beta、质粒DNA。
该转化生长因子-beta基因疫苗预防糖尿病肾病制剂为可以直接作为基因疫苗的特别优选的重组DNA质粒以及编码转化生长因子-beta片段的基因。
转化生长因子-beta基因是研究工作者们认识较早的一个功能基因，在本实施例中应用转化生长因子的序列信息设计寡核苷酸引物，用于从机体中用聚合酶链反应(PCR)扩增该基因，新设计的引物两端含有两个特异限制性内切酶识别位点，使扩增的质粒可以通过相出的限制性内切酶切后直接克隆到一个质粒载体上。
在本发明中所使用的优选DNA构建物优点在于允许该构建物在微生物中进行繁殖，如大肠杆菌，通过这种方法构建成功的DNA构建物可进行大量结构相同的繁殖。
当新克隆出的转化生长因子-beta基因以直接方式插入质粒DNA而直接整合出一个完整的表达基因，即在机体内表达出转化生长因子-beta，这种肽段可以通过机体的抗原递呈细胞在体内发挥作用。
本发明特别有利之处在于，以非常低剂量的抗原，该疫苗组合物也能诱导机体出现有效的保护作用。
该新型疫苗可以根据动物个体、种属、免疫特征的不同而不同，但是在对下面的小鼠动物模型进行接种时，我们发现，应用该新型疫苗剂量20～100μg时，按免疫程序能有效地提供保护作用。
本发明所提供的新型疫苗为非口服载剂，可用微滴或其它微束体形式进行接种，它们可以有效地将免疫反应物运送到细胞，从而引发免疫反应，并可以有效地降低或抑制转化生长因子-beta在糖尿病肾脏病变的表达。
以下具体说明了本发明的实质内容及其优点。
一、转化生长因子-beta基因疫苗的制备
本发明拟采用以下手段构建转化生长因子-beta基因疫苗，以防止糖尿病肾脏病变的发生：
1、按基因文库报道的转化生长因子-beta基因序列。应用多聚酶链反应扩增转化生长因子-beta mRNA片段，并且进行测序以检验所得到的多核苷酸片段为转化生长因子-beta片段。特别需要明确的一点是：在合成转化生长因子-beta片段时，该片段的两端带有特异性限制性内切酶，用以保证所克隆出转化生长因子-beta能有效地以合理的序列连接到DNA质粒中。
2、在以合成的转化生长因子-beta片段在与适当的限制性内切酶酶切后的质粒DNA连接，导入到大肠杆菌中扩增，并进行适当地鉴定。
二、转化生长因子-beta基因疫苗对糖尿病肾脏病变的抑制作用糖尿病肾脏病变发生时，转化生长因子-beta具有重要地位，对转化生长因子-beta与糖尿病肾脏病变关系的研究可能为诊治糖尿病肾脏病变提供新的途径。
转化生长因子-beta在糖尿病肾脏病变发病中的中心作用主要表现在以下几个方面：
1、转化生长因子-beta在糖尿病时对肾小球的影响
近年来研究发现，糖尿病发病时，高血糖、肾小球囊内压升高和糖化血红蛋白均有助于转化生长因子-beta在肾脏中的表达升高，而转化生长因子-beta的升高可以有效地刺激细胞外基质成分，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型胶原、层粘连蛋白mRNA表达增加，导致硫酸乙酰肝素/Ⅳ型胶原比率相对降低，破坏肾小球滤过膜的电荷屏障以及分子屏障，并且与白蛋白尿的排泄呈正相关。
除此以外，转化生长因子-beta能提高细胞外基质细胞受体，如细胞粘附蛋白受体的表达，增加细胞外基质的聚集性。肾脏肥大可能与转化生长因子-beta表达增加有关。
2、转化生长因子-beta在糖尿病时对肾小管及间质病变的作用
糖尿病肾脏病变中，肾脏间质纤维化与肾小球系膜扩张、肾小球滤过率下降以及蛋白尿的增加有较强的相关性。体外实验显示，高糖可以刺激肾脏近曲小管细胞合成胶原和转化生长因子-beta基因转录。
Gilbert等发现糖尿病小鼠肾小管内皮细胞以及周围间质细胞中存在着弥散性的转化生长因子-beta以及Ⅳ型胶原mRNA表达增强，而且在局部扩张性的肾小管表达尤为显著。以上基因改变与其相应的免疫组织化学改变是一致的。
综上所述，研究工作者们推测：转化生长因子-beta是糖尿病肾脏病变发病机制的最后共同通路。即在高血糖条件下，多种生物化学异常以及微循环障碍共同参与糖尿病肾脏病变的发生，包括蛋白激酶C途径、蛋白非酶性糖化、氧化应激、肾素-血管紧张素系统活性增加等因素，通过调节转化生长因子-beta，导致细胞外基质积聚、肾小球硬化。
因此，在此基础上，Sharma表明体外培养肾小球时，给予转化生长因子-beta中和性抗体能明显抑制肾脏组织转化生长因子-beta mRNA表达并减轻细胞外基质地进行性积聚。Kolm等发现，在体外高糖条件下，培养肾小球系膜细胞培养液中加入转化生长因子-beta反义基因可有效地抑制肾小球系膜细胞的增生以及其产生层粘连蛋白、硫酸肝素多糖和Ⅳ型胶原。Kashihara的研究也得出同样的结论。但是反义基因作为基因治疗的手段仍有许多缺点，如反义基因难以进入细胞内，并较为容易被核酸酶降解。而应用基因疫苗则可以有效地克服这些缺点。
1990年，Wolff偶然发现将裸DNA质粒注射到小鼠的骨骼肌中，骨骼肌可以直接摄取质粒DNA，并产生小量的基因翻译产物，由此得出的结论为：编码抗原DNA在细胞内的表达为疫苗的发展开辟了一条新的途径。
本发明提出的应用转化生长因子-beta基因疫苗预防糖尿病肾脏病变的发生。其理论基础在于：给机体注射基因疫苗后，辅助性T淋巴细胞和相关的MHC抗原提供编码疫苗基因转录和翻译的场所。肌肉细胞合成的由基因疫苗目的基因编码的多肽和/或蛋白质为机体特异性免疫细胞提供特异性的抗体，并起到保护性免疫反应的作用。在给机体注射含转化生长因子-beta的基因疫苗能有效地刺激出针对转化生长因子-beta的免疫反应，使转化生长因子-beta在体内含量减少，从而中止糖尿病肾脏病变的共同通路。
在上述理论的基础上，应用转化生长因子-beta基因疫苗防止糖尿病肾脏病变的发生不仅是可能的，而且是可行的。