一种免疫抑制药物 本发明涉及一种由雷公藤多甙和白芍总甙组合成的主要用于自身免疫性疾病和器官移植排斥反应的治疗药物。
目前临床常用的植物提取的免疫抑制剂为雷公藤多甙(GTW),GTW对自身免疫性疾病、过敏性疾病及器官移植后的排异反应均有显著疗效。但是GTW存在的严重缺陷是对消化系统、泌尿生殖系统、神经系统和骨髓造血系统均有不同程度的毒副作用,并有致死的报道。GTW的毒副作用与治疗效果都随服用剂量的增加而增强。而如何保持或增强雷公藤的疗效,并且减少其使用剂量和降低毒副作用是个一直未能解决的难题。白芍总甙(TGP)具有双向调节免疫功能的作用,在高剂量时具有免疫抑制作用,而在低剂量时主要表现为免疫增强作用,在临床上具有抗炎和免疫调节的功能,大剂量对类风湿性关节炎有效果,且安全低毒,在改善疾病症状的同时尚能纠正病人的一般状况。因而,TGP对免疫应答的作用特点和临床应用的情况均与GTW有很大差异,但又存在着作用的互补性。并且,二者免疫应答的作用部位、作用环节和性质也各有特点。与本发明相同的组合物目前尚未见有报导。
本发明的主要目的是,将TGP与GTW进行组合,提供一种较单纯GTW治疗作用强,且毒副作用小的免疫抑制药物。
本发明的技术方案包括如下步骤:体内实验时,将雷公藤多甙片研为粉末,溶于1%羧甲基纤维素中成混悬液;白芍总甙(TGP)由中药白芍提取,其中芍药甙含量不低于350μg/mg,TGP用生理盐水直接配制;合并组药物在动物给药前按1∶5~10充分混合即可。给药体积为0.2ml/kg。对照组灌服等量地生理盐水。体外实验时,雷公藤多甙的制备是用少许蒸馏水崩解药片,然后加入乙酸乙酯萃取三次,去除乙酸乙酯,使用时加少许Tween-80助溶后用完全RPMI-1640稀释,微孔滤膜过滤后-20℃冰箱保存,使用时用含10%FCS的RPMI-1640稀释。TGP直接用完全1640液配制,-20℃保存备用。
实验研究证明,雷公藤多甙和白芍总甙结合物的免疫抑制作用明显比其单独成分的作用强,即二者有协同抑制机体免疫应答的作用,而无毒副作用方面的协同作用。主要的药理实验结果包括:
1.TGP与小剂量的GTW体内联合应用具有协同抑制整体免疫应答的作用,其作用效果超过它们被单独应用时的效应。具体实验为:
1.1GTW和TGP二者合用对小鼠迟发型过敏反应(DTH)的抑制作用
DTH是由致敏的淋巴细胞与抗原特异反应而引起的组织损伤,其反应原理是迟发型过敏反应细胞与抗原结合,引起相应特异细胞活化,释放出多种淋巴因子,导致局部组织以单核细胞浸润为主的炎症反应。2,4-二硝基氯苯(DNCB)是一种半抗原,可与机体的蛋白质载体结合成完全抗原诱导特异性细胞免疫应答,产生皮肤的DTH反应。TGP和小剂量GTW口服七天对正常小鼠DTH均有一定抑制作用,但效能较弱。而小剂量的GTW和TGP合用的效果明显增强,超过大剂量GTW的作用强度。结果见表1。
表1GTW,TGP及其二者合用对BALB/c小鼠DTH的影响 组 剂量(mg/kg) 耳重(mg) 抑制率(%) 对照 GTW GTW TGP GTW+TGP - 10 30 50 10+50 9.20±1.33 7.87±1.65* 7.38±1.07* 7.92±1.19*,a 6.32±0.83* 14.5 19.7 13.9 31.2
结果由均值±标准差表示,样本数=10,与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01与GTW(10mg/kg)组比较,a∶P<0.05。
1.2GTW和TGP及其二者合用对小鼠脾脏抗体形成细胞(PFC)的影响
结果见表2,一定剂量的GTW和TGP对小鼠特异性抗体产生细胞均有抑制作用,而小剂量GTW和TGP合用则可明显抑制PFC,与大剂量的GTW效果一致。
表2GTW,TGP及其合用对脾脏细胞PFC数量的影响 组 剂量(mg/kg) PFC数/脾 抑制率(%) 对照 GTW GTW TGP GTW+TGP 0 10 30 50 10+50 89410±1540 69121±1213** 41263±1012** 72129±1354* 39746±921** - 22.69 53.88 19.25 55.52
结果由均值±标准差表示,样本数=10,与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01。
1.3GTW和TGP及其二者合用对同种异体皮肤移植排斥反应的影响
BALB/c小鼠分为5组,即对照组、GTW小剂量组(10mg/kg)、GTW大剂量组(30mg/kg)、TGP组(50mg/kg)和药物协同治疗组(GTW10mg/kg+TGP50mg/kg)。于移皮前5天开始口服给药,每日一次,直至皮肤被排斥死亡。第6天进行皮肤移植手术。结果显示GTW30mg剂量组皮肤存活期延长62.96%,小剂量GTW组和TGP组的皮肤存活期与对照组无显著差异(P>0.05)。但二者组合后可明显抑制移植排斥反应,协同治疗组的皮肤存活期延长56.79%,基本接近大剂量GTW组的效果,但均不能完全防止移植物的排斥反应,使其长期存活,结果见表3。实验结果表明:单独GTW和TGP的抑制移植排斥反应的作用有限,通过联合使用TGP等不同的药物,可提高GTW对移植排斥的抑制作用。
表3GTW和TGP及其二者合用对小鼠同种异体皮肤移植
C57BL/6→BALB/c排斥反应的影响 组 剂量(mg/kg) 存活时间(天)均值±方差(天) 对照 GTW GTW TGP GTW+TGP 0 10 30 50 10+50 7,7,8,8,8,8,8,9,9,9 7,8,8,8,8,9,9,9,9,10 11,12,12,13,13,13,14,14,15,15, 7,7,8,8,8,8,8,9,9,10 11,11,12,12,13,13,13,13,14,15 8.1±0.7 8.5±0.8 13.2±1.24** 8.36±0.98 12.71±1.18**
与对照组相比,**P<0.01。
1.4GTW和TGP及其二者合用对小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的影响
BALB/c小鼠口服给药,每日一次,连续7天。于第8天取脾脏制备细胞悬液分别测定其对有丝分裂原ConA和LPS刺激的增殖反应。结果发现GTW和TGP对ConA和LPS刺激的淋巴细胞增殖均有较明显的抑制作用,GTW的作用以大剂量组的效果更加显著,小剂量GTW(10mg/kg)和TGP合用(50mg/kg)后其抑制作用与大剂量GTW相近,见表4。
表4GTW,TGP及其组合在体内对淋巴细胞增殖反应的影响 组 剂量(mg/kg) 光密度值 ConA LPS 对照 TGP GTW GTW GTW+TGP - 50 10 30 10+50 0.884±0.152 0.740±0.131* 0.695±0.119* 0.528±0.142** 0.531±0.139* 0.563±0.134 0.408±0.129* 0.291±0.104* 0.257±0.121** 0.201±0.069*
结果由均值±标准差表示,样本数=10,与GTW组比较,a∶P<0.05,*与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
1.5GTW,TGP及其二者组合对混合淋巴细胞培养反应(MLR)的作用
MLR是T淋巴细胞对同种异体细胞的主要组织相溶性(MHC)抗原的特异性免疫应答反应,相当于移植排斥反应的体外模型。本发明用BALB/c(H-2d)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠的脾脏细胞测定双向和单向MLR。发现GTW可明显抑制MLR,其作用呈剂量依赖性:小剂量TGP对MLR无明显作用,但25-50μg/ml的TGP对MLR有一定的抑制作用。GTW与TGP(25μg/ml)合用时对MLR的抑制作用显著增强,结果见表5。表明GTW与TGP合用对MLR有协同抑制作用。
表5GTW,TGP及其组合在体内对混合淋巴细胞培养反应的抑制作用 组 剂量(μg/ml) 光密度值(OD570nm) 双向 单向 对照 GTW TGP TGP+GTW - 0.31 0.62 1.25 2.5 6.25 12.5 25 50 25+0.31 25+0.62 25+1.25 25+2.5 0.638±0.029 0.508±0.049* 0.430±0.065** 0.318±0.011** 0.237±0.036** 0.669±0.067 0.660±0.171 0.529±0.158* 0.418±0.450* 0.422±0.070* 0.303±0.112* 0.267±0.003b 0.185±0.015* 0.437±0.048 0.327±0.057* 0.281±0.044** 0.250±0.005** 0.208±0.006** 0.415±0.090 0.374±0.020 0.315±0.012* 0.287±0.020** 0.275±0.004* 0.181±0.024b 0.168±0.015* 0.120±0.001b
n=3,与对照相比,*P<0.05,**P<0.01;与相应的GTW剂量相比,a∶P<0.05,b∶P<0.01。
2.GTW,TGP及其二者合用对骨髓造血功能的影响
GTW对骨髓造血系统有一定的毒性作用,因而在研究GTW和TGP免疫药理的同时,观察了它们对造血系统的作用,以了解它们在协同抑制免疫应答功能的同时是否对造血系统的毒性作用也有相应的增强趋势。
GTW,TGP及其二者组合在体内应用对脾脏集落CFU-S形成的作用
脾脏集落CFU-S是体内检测髓系干细胞数目的指标,CFU-S可进一步分化为红细胞、粒细胞和巨核细胞。将LACA小鼠用850Rad的60Coγ射线照射,在4hr之内经尾静脉输注同品系小鼠的骨髓细胞5×104/鼠,随机分组给药,连续7天。实验结果表明:在本研究的剂量范围内,小剂量GTW和TGP及二者合用组均未见对CFU-S数有明显影响,但GTW在大剂量时对CFU-S有减少作用(P<0.05)。TGP与小剂量和大剂量GTW合用的结果与单独GTW组的结果无明显变化,提示TGP对GTW体内抑制造血系统髓系干细胞的作用无明显影响。
表6GTW和TGP及其二者合用对小鼠脾脏CFU-S的影响 组 剂量(mg/kg) CFU-S/脾脏 对照 GTW GTW TGP GTW+TGP GTW+TGP - 10 30 50 10+50 30+50 11.77±1.80 11.50±1.71 8.33±1.10* 11.98±3.02 11.67±2.28 8.49±1.51*
结果由均值±标准差表示,样本数=5,与对照组相比,*P<0.05。
3.GTW和TGP合用对实验性自身免疫性脑脊髓炎的防治作用
实验性变自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)是一种由中枢神经系统髓鞘自身抗原碱性蛋白(MBP)与福氏完全佐剂一起皮下注射于实验动物而诱发的一种自身免疫病模型,其疾病的本质是由CD4+自身反应性淋巴细胞在中枢神经系统(CNS)产生的迟发型变态反应,由于在症状表现,病理特征和发病机制等方面与人类自身免疫性疾病一多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)极为相似,而被公认为是MS的极为理想的实验动物模型,本发明应用这一模型观察了GTW和TGP及其合用对EAE的预防和治疗作用。主要结果如下:
3.1GTW,TGP及其合用对大鼠EAE发病的预防作用
用CFA-GPSCH免疫Wistar大鼠诱导EAE,动物随机分为5组,每组9只,于诱导当日开始口服给药,每天1次,连续7天,每日定时观察动物,记录结果。实验结果表明GTW15mg/kg,30mg/kg,TGP50mg/kg,GTW+TGP(15mg/kg+50mg/kg)均有预防EAE发病的作用,发病动物数减少,发病时间延迟,病情减轻。其中以大剂量GTW组及小剂量GTW和TGP合用的效果最好,二者的作用效果基本相同。结果见表7。
表7GTW,TGP及其合用对大鼠EAE的预防作用 组剂量(mg/kg) EAE发病率 临床评分 EAE出现时间(天) 对照 GTW GTW TGP GTW+TGP - 15 30 50 15+50 88.9(8/9) 66.7(6/9) 33.3(3/9) 55.6(5/9) 22.2(2/9) 3.45±1.23 2.50±0.50* 2.01±0.42** 3.00±0.62 2.25±0.35** 9.6±1.8 11.8±2.4 13.3±2.2** 14.5±3.1** 14.7±2.6**
与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,样本数=9
3.2GTW,TGP及其合用对大鼠EAE的治疗作用
免疫诱导动物EAE的大鼠开始出现症状后,将所有动物随机分组,灌胃给药,进行治疗,连续7天,并每日观察记录动物病情,直至症状消失,结果见表8。GTW和TGP能使大鼠的EAE症状明显减轻,病程也明显缩短,大剂量GTW的作用最明显,TGP与小剂量GTW合用的效果基本与大剂量GTW相同。
表8GTW,TGP及其合用对Wistar大鼠的治疗作用 组剂量(mg/kg) 鼠数 临床评分 EAE持续时间(天) 对照 GTW GTW TGP GTW+TGP 15 30 50 15+50 9 9 9 9 9 3.22±0.92 1.88±0.73** 1.67±0.81** 2.11±0.99** 1.77±0.78** 8.22±1.47 6.33±1.66** 5.67±1.33** 7.30±1.61* 6.00±1.00**
与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01。
3.3GTW,TGP及其合用对EAE大鼠特异性免疫应答的作用
由于EAE是由CD4+Th1细胞介导的一种CNS器官特异性的自身免疫性疾病,对CNS髓鞘碱性蛋白(MBP)抗原特异性的自身反应性T细胞在EAE疾病的发生发展过程中有重要作用,是EAE发生的主要细胞学基础,因而,研究药物对自身反应性T淋巴细胞的作用,对探讨药物治疗自身免疫病的机理有重要价值。本发明研究了GTW,TGP及其二者组合体内给药对MBP刺激的EAE大鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的整体作用。动物分组及给药方式同3.1项。于免疫诱导EAE后第20天处死动物,取脾脏淋巴细胞测定其对MBP刺激的增殖反应,结果见表9。
表9GTW,TGP及其合用体内给药对MBP刺激的EAE大鼠
脾脏淋巴细胞增殖反应的影响 组 剂量(mg/kg) 光密度值 抑制率(%) 正常对照 EAE对照 GTW GTW TGP GTW+TGP - - 15 30 50 10+50 0.197±0.021 0.432±0.033* 0.320±0.017** 0.224±0.017** 0.239±0.021** 0.187±0.019** - - 25.92 48.14 44.67 56.71
与正常对照组相比,*P<0.01,与EAE对照组相比,**P<0.01,样本数=9。
本发明的优点是效果肯定,可明显降低雷公藤的毒副作用,但不降低其疗效,部分解决了雷公藤在临床运用中主要面临的难题,药物来源方便、易得,治疗方法简便,是在中医理论指导下,运用现代医药学方法和手段创造性地研究得到的一个较为理想的免疫抑制剂。