刺激氧化氮生产的含有多酚和L-精氨酸的制品 本发明的领域
本发明涉及含有多酚和L-精氨酸的对于哺乳动物的健康具有有益作用的制品。
本发明的背景
多酚化合物为具有生物活性的物质，它们得自植物材料并且与含有它们的制品的口感和营养质量紧密相关。
原花色素是出现在一些植物种类中的一类多酚化合物。它们为黄烷-3-醇单体单元的低聚物，常常以4→6或4→8连接。最普遍地类型为矢车菊苷配质(它们为儿茶素、表儿茶素及它们的没食子酸酯的链)和原花色素(prodelphinidin)(它们含有棓儿茶酸、表棓儿茶酸(epigallocatechin)及它们的没食子酸酯作为单体单元)。在原花色素低聚物中结构的变化还可通过C-O氧化偶合形成第二交互黄烷醇类(interflavanoid)键而形成A-类低聚物。由于这个转化的复杂性，相对于其B-类低聚物来说在自然界中并不经常见到A-类原花色素。
术语“可可多酚”包括含有原花色素，更具体地讲从可可豆和它们的衍生物萃取的矢车菊苷配质的多酚制品。更具体地讲，术语“可可多酚”包括式An的单体(其中n为1)或式An的低聚物(其中n为2至18或更高的整数)，其中A具有下式：
和R为3-(α)-OH、3-(β)、3-(α)-O-糖类、3-(β)-O-糖类、3-(α)-O-C(O)-R1或3-(β)-OC(O)-R1；
在邻近单体之间的键合发生在4、6或8号位；
在单体4号位的键具有α或β立体化学。
X、Y和Z选自A、氢和部分糖类部分，条件是至少一个末端单体在4号位与邻接的单体键合和任选Y=Z=氢；和
其中所述糖类部分为单-或二-糖类部分并且可任选被酚部分取代，及R’可为任选被至少一个羟基基团取代的芳基或杂芳基部分；和
它们的盐、衍生物和氧化产物。优选所述糖类部分衍生自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。所述糖类部分和任何或全部的R、X、Y和Z可任选在任何位置被酚部分通过酯键取代。所述酚部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羟基苯甲酸和芥子酸。
原花色素越来越受注意是由于急剧增长的例子表明这些化合物具有很大范围的潜在的健康益处。最近人们发现茶叶儿茶酸具有潜在的抗氧化活性并在试验室的老鼠身上减少了肿瘤的多样性(Lunder,1992；Wang等,1992；Chung等，1992)。另外，在葡萄种子的萃取物中的原花色素显示出具有自由基清除能力并降低了健康细胞对于有毒物质和致癌物质的敏感性(Bagchi等，1997；Waterhouse和Walzem,1997；Joshi等，1998)。人们还发现在葡萄汁和红酒中的多酚具有潜在的心血管益处，包括减少血小板的聚集、调节二十烷酸的合成和阻止低密度脂蛋白氧化(Waterhouse和Walzem,1997；Schramm等，1998；Frankel等，1995)。最近的研究表明这些化合物的任何潜在健康益处均受其聚合程度的影响(Saito等，1998)。
许多植物多酚具有抗氧化活性和具有在诱变和致癌方面的阻止作用。例如，在美国专利号5,554,645和美国专利号5,712,305中公开的可可多酚萃取物、具体为矢车菊苷配质显示出具有显著的生物效用。国际公开WO97/36497(于1997年12月24日公布)公开了这些萃取物还具有减少牙周炎、动脉硬化和高血压；阻止LDL氧化和DNAⅡ型拓扑异构酶；调整环加氧酶、脂肪氧合酶、氧化氮或NO-合酶、编程性细胞死亡(apoptosis)和血小板聚集；和具有消炎、抗龈炎和抗牙周炎活性的功能。此外，WO97/36497公开了多酚低聚物5-12相对于其它从可可中分离出来的多酚化合物具有增强的抗癌症活性。因此，吸取了可可制品中这些高级低聚物可提供显著的健康益处。
如上所述，在国际公开WO97/36497中描述了可可萃取物或衍生自NO或NO-合酶调节剂的多酚的使用。氧化氮显示出在许多重要的生物性能，如神经传递、血液凝固、血压控制、血脂水平调节、心血管疾病、脑循环(血管性头疼)中发挥作用，在杀死肿瘤细胞和细胞内寄生物的免疫系统能力中也发挥一定作用。P.Clarkson等，“Oral L-arginine Improves Endothelium dependent situation inHypercholesterolemic Young Adults”,J.Clin,Innest.97,No 8:1989-1994(1996年4月),P.L.Feldman等，“The Surprising Life of NitricOxide”,Chem & Eng.News，第26-38页(1993年12月20日)；S.H.Snyder等，“Biological Rules of Nitric Oxide”,Scientific American，第68-77页(1992年5月)；P.chowienczyk等，“L-arginine：No More Than ASimple Amino Acid？”,Lancet,350:901-30(1997年9月27日)；M.A.Wheeler等，“Efforts of Long Term Oral L-Arginine on The Nitric OxideSynthase Pathway in the Urine from Patients with Interstitial Cystitis”,J.Uro1ogy 158:2045-2050(1997年12月)；A.Tenenbaum,“L-Arginine:Rediscovery in Progress”,Cardiology 90:153-159(1998)；I.K.Mohan等,“Effort of L-arginine Nitric Oxide System on Chemical-InducedDiabetes Mellitus”,Free Radical Biology & Medicine 25,No.7:757-765(1998)；S.Klahr,“The Role of L-Arginin in Hypertension andNephrotoxicity”,Pharmacology and Therapeutics,第547-550页(1998)；和R.H.Boger等，“Dietary L-arginine and L-Tocopheral Reduce VascularOxidation Stress and Preserve Endothelial Function in someHypocholesteralemic Rabbits via Different Mechanisms,”Arterosclerosis141:31-43(1998)。
例如，人们提出了各种食物的健康益处。有报导花生是白藜芦醇的一个来源，在葡萄和红酒中发现的这种化合物可用于减少心血管疾病。人们发现含有胡桃的饮食可导致降低血脂水平和血压。参见Sabate,J.等的：“Effects of Walnuts on Serum Lipid Levels and Blood Pressure inNormal Men”,New England J.Med.328:603-607(1993年3月4日)。还有人提出经常摄取坚果可保护冠状动脉心脏病。参见Sabate,J.等的：“Nuts:A New Protective Food Against Coronary Heart Disease”,Lipidology 5:11-16(1994)。不想被限制于任何理论，其中的一种假设的作用机理包括在坚果中存在相对高水平的精氨酸导致氧化氮生产，因此引起血管平滑肌的松弛。人们相信L-精氨酸是通过氧化氮合酶作用于氧化氮生产的酶作用物。
因此，需要含有高可可多酚浓度、特别是高浓度的可可多酚低聚物5-12的糖类和含可可的制品(可可粉、巧克力浆或它们的萃取物)。同样非常需要提供含有有效量的多酚、特别是可可矢车菊苷配质和L-精氨酸的制品以刺激氧化氮的生产并由此得到它们所提供的健康益处。
本发明概述
本发明涉及含有至少一种可可多酚(即可可和/或坚果矢车菊苷配质)和L-精氨酸的新型食品，其中多酚和L-精氨酸以能有效促使吸取了所述食品的哺乳动物生理上氧化氮生产增加的结合量存在。所述矢车菊苷配质可为天然或合成的。在优选实施方案中，通过含多酚成分(如，或可可和/或可可粉和/或坚果壳成分)和含L-精氨酸成分(如果仁)分别提供了可可多酚和L-精氨酸。然而，本发明还包括食品，其中将天然或合成的可可和/或坚果多酚和/或L-精氨酸直接加入所述食品中。
本发明的食品向摄取了这些食品的哺乳动物提供了健康益处。特别有利的健康益处是降低了血压。其它健康益处包括减少心血管疾病、抗癌症活性、抗氧化活性、治疗肾脏疾病、增强免疫功能和提高识别能力。
优选在本发明的食品中包含的可可多酚为可可多酚低聚物2-18，更优选可可多酚低聚物5-12。
含有矢车菊苷配质的可可多酚存在于可可豆中。如在美国专利5,554,645中描述，它们通过溶剂萃取粉状未发酵豆得到。它们也存在于由可可豆制备的巧克力成分中。
适合的含可可矢车菊苷配质成分包括烘烤的可可碎仁、巧克力浆、部分脱脂的可可固体、脱脂可可固体、由可可固体碾磨得到的可可粉和它们的混合物。优选所述成分由发酵不足的豆制备，因为这些豆含更高量的含有可可矢车菊苷配质的可可多酚。
本发明的一个特别优选的食品为糖类，最优选巧克力，包括同一标准(standard of Identity)和非同一标准的巧克力。本发明的食品还可为非巧克力食品。优选的非巧克力食品包括基于坚果的制品如：花生酱、花生糖等。本发明的另一个优选的食品为采用脱脂或部分脱脂果仁制备的低脂肪食品。
所述L-精氨酸可得自任何适合的精氨酸来源，如花生(Arachishypogaea)、胡桃(Juglans regia)、杏仁(Prunus amygdalus)、榛子(Corylusavellana)、大豆(Glycine max)等。其它有用的为美国山核桃(Caryaillinoensis)、腰果(Amacardium occidentale)和Macadamia integrifolia、澳洲坚果(M.tetraphylla)。已知坚果中的L-精氨酸含量根据所述坚果的成熟情况发生变化，另外在某些品种中会有更高的水平。每一属的相关种类在这里均有用。通常花生中每100g果仁含有大约2-3g的L-精氨酸。杏仁的L-精氨酸含量为每100g大约2-3g，胡桃的为每100g大约2-4g，榛子的为每100g大约1.5-2.5g，美国山核桃和澳洲坚果的为每100g大约0.5-1.5g。坚果可为坚果片、坚果壳、坚果仁糊，和/或坚果粉，以提供所需量的L-精氨酸的量存在，所述量的变化取决于所用坚果的来源。
所述含L-精氨酸的成分还可为种子、种子糊和/或种子粉。适合的种子包括向日葵籽(Helianthus annuus)、芝麻籽(Sesamm indicum)、葫芦巴籽(fenugreek seeds)和南瓜籽(Cucurbita spp.)等。每100g的向日葵籽、南瓜籽和芝麻籽分别含有大约1.5-3.0g、大约3.5-6.0g和大约2-3g的L-精氨酸。
另一个高L-精氨酸含量的来源是明胶，每100g明胶含有大约5g的L-精氨酸。
所述食品中每100g制品含有至少大约200mg、优选300mg的矢车菊苷配质和每100g食品含有至少大约0.9g、优选1.2g、更优选1.6g的L-精氨酸。
除可可豆外，所述食品可从其它来源得到多酚，如上述那些在坚果壳中出现的多酚。花生壳含有大约17％的矢车菊苷配质，杏仁壳含有多至30％的矢车菊苷配质。在优选的实施方案中，在所述食品(如巧克力牛轧糖)中使用了这些坚果壳。得自水果和蔬菜的多酚也适合在这里使用。已知在苹果、橙以及葡萄种子的水果皮中具有高含量的多酚。
没有受理论的限制，我们相信可可多酚和L-精氨酸的结合提供了意想不到的增强健康益处，因为在NO-合酶的酶作用物L-精氨酸的存在下对NO和/或NO-合酶产生正多酚调整。由此，通过可可和/或坚果多酚和L-精氨酸的结合提高了氧化氮的生产，这提高了来自氧化氮的健康益处，如防止心血管疾病、降低血压、抗癌症活性等。
本发明还涉及含有至少一个可可和/或坚果多酚、L-精氨酸和药物可接受载体的药物组合物。所述多酚和L-精氨酸以能有效促使摄取所述组合物的哺乳动物生理上氧化氮生产的增加的结合量的形式存在。得自可可和/或坚果的矢车菊苷配质以每单位剂量大约1μg至大约10g的量存在。所述L-精氨酸以每单位剂量大约1μg至大约10g的量存在。所述可可多酚成分可为可可物质(豆、浆或粉末等)的萃取物，或可为它们的合成衍生物，或可为合成的多酚化合物或多酚化合物的混合物或它们的衍生物。从坚果壳萃取得到的矢车菊苷配质也适合在这里使用。
本发明的详细描述
本发明的食品含有至少一种可可多酚和任选得自上述其它来源的多酚。所述可可多酚可得自任何来源，即天然或合成的。最优选所述可可多酚为低聚物。
术语“可可多酚”包括存在于可可豆或在生产巧克力糖中使用的可可成分中的矢车菊苷配质，含有矢车菊苷配质的可可豆萃取物或可可成分和它们的合成衍生物，和包括合成的可可多酚化合物或合成的可可多酚化合物的混合物和它们的衍生物。所述可可豆可为全发酵或发酵不足的。
术语“可可成分”指得自无壳可可碎仁的含有可可固体的物质并包括巧克力浆、部分或全部脱脂的可可固体(如块或粉末、碱化的可可粉或碱化的巧克力浆等)。
术语“巧克力浆”指通过碾磨可可碎仁得到的黑褐色流体“浆”。流动性是由于在加工过程中细胞壁的破裂并释放可可脂导致形成了磨碎的可可固体颗粒悬浮在可可脂中的悬浮液。
具有高可可多酚(CP)含量(包括高可可矢车菊苷配质含量)的部分脱脂可可固体可通过直接将可可豆加工成可可固体而不必经过豆或碎仁的烘烤步骤得到。这种方法保护了可可多酚，因为它略去了常规的烘烤步骤。该方法主要由以下步骤所组成：a)将可可豆加热至内部豆温刚好足于减少水分含量至大约3％(重量)并使可可壳松散；b)从可可壳中风选出可可碎仁；c)用螺杆挤压所述可可碎仁；和d)回收含有可可多酚(含有可可矢车菊苷配质)的可可脂和部分脱脂可可固体。任选在加热步骤前在如空气流化床密度分离器中将可可豆净化。风选步骤也可在所述空气流化床密度分离器中进行。优选将可可豆加热至内部豆温为大约100℃至大约110℃，更优选小于大约105℃，一般使用红外加热设备加热需要大约3至4分钟。如果需要，可将所述可可固体碱化和/或碾磨成可可粉末。
可通过将豆(接近80-100粒豆)填充入绝缘容器(如保温瓶)中测定内部豆温(IBT)。随后将所述绝缘容器适当地密封以保持里面样品的温度。将温度计插进所述豆填充的绝缘容器中，温度计的温度等于保温瓶中的豆的温度。所读的温度即为所述豆的IBT温度。IBT也可认为是所述豆的平衡质量温度。
根据可可豆的颜色可将它们分为四种：主要为褐色(完全发酵)、紫色/褐色、紫色和石板色(未发酵)。优选所述可可固体从发酵不足的可可豆中制备，其具有比发酵的豆更高的可可多酚含量。发酵不足的豆包括石板色可可豆、紫色可可豆、石板色和紫色可可豆的混合物、紫色和褐色可可豆的混合物或石板色、紫色和褐色可可豆的混合物。更优选所述可可豆为石板色和/或紫色可可豆。
如上所讨论，当烘烤的可可碎仁、巧克力浆和部分脱脂或无脂可可固体由发酵不足的可可豆或它们的混合物(即具有发酵因数不超过275的豆)制备得到时，可可多酚(CP)含量(包括可可矢车菊苷配质含量)会更高。
所述“发酵因数”采用分级系统测定以表征所述可可豆的发酵。指定石板色为1，紫色为2，紫色/褐色为3和褐色为4。将落在每一种类型中的豆的百分数乘以加权值。因此对于100％褐色豆样品的“发酵因数”为100×4或400，而对于100％紫色豆样品为100×2或200。50％石板色豆和50％紫色豆的样品具有150[(50×1)+(50×2)]的发酵因数。
高CP巧克力浆和/或高CP可可固体可由以下步骤制备：a)将所选的可可豆(发酵因数不超过275)烘烤至95℃至160℃的内部豆温；b)从烘烤的可可豆中风选出可可碎仁；c)将所述可可碎仁碾磨成巧克力浆；和d)任选将可可脂和部分脱脂的可可固体从所述巧克力浆中回收。或者，巧克力浆和/或可可固体可由以下步骤制备：a)将所选的可可豆(发酵因数不超过275)加热至内部豆温为95-135℃以使水分含量减至大约3％(重量)并使可可壳从可可碎仁上松散；b)从可可壳中风选出可可碎仁；c)将所述可可碎仁烘烤至内部碎仁温度为95℃至160℃；d)将所述烘烤的可可碎仁碾磨成巧克力浆；和e)任选从所述巧克力浆中回收可可脂和部分脱脂可可固体。含有每克无脂可可固体至少50,000μg的总可可矢车菊苷配质和/或至少5,000μg的可可矢车菊苷配质五聚体的巧克力浆和部分脱脂可可固体可通过上述方法制备。
含有可可多酚(含有可可矢车菊苷配质)的萃取物可通过溶剂萃取由发酵不足的可可豆或可可碎仁制备的部分脱脂可可固体或无脂可可固体制备。
所述部分脱脂可可固体和/或可可多酚萃取物可用在治疗组合物中，任选与载体或稀释剂一起使用。所述治疗组合物可用在如抗肿瘤组合物、抗氧剂、杀菌剂、氧化氮(NO)或NO-合酶调节剂、环加氧酶调节剂、脂肪氧化酶调节剂和在体内葡萄糖调节剂中。
可采用高CP烘烤可可碎仁、高CP巧克力浆、和/或高CP部分脱脂或无脂可可固体制备高CP食品。所述食品包括宠物食品、干燥的可可混合物、布丁、糖浆、曲奇饼、香薄荷沙司、米饭混合物、米糕、饮料混合物、饮料等。优选所述食品为糖化物，如深色巧克力或牛奶巧克力。所述萃取物还可用于制备含有高可可多酚含量的食物。
哺乳动物的健康可通过给予其含有可可和/或坚果矢车菊苷配质或上述高CP可可成分和/或坚果成分的组合物来改善。在这些组合物中，所述矢车菊苷配质低聚物的总量至少为1μg或更高并且在多于60天的时间内每天供给所述组合物。
可可矢车菊苷配质在结构上可采用单体A的低聚物表示，所述低聚物具有式An，其中n为2-18，其中A具有式：和R为3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖类、3-(β)-O-糖类；相邻单体在4、6或8号位键合；条件是x，y和z选自A、氢和糖类；在4号位上与单体(如至少一个封端单体)的键具有α或β的立体化学；与邻近单体在4号位键合。任选Y=Z=氢；和它们的盐；其中所述糖类部分衍生自单-或二-糖类。
这里所用的术语“低聚物”指具有上式的任何化合物，其中n为2至18，优选其中n为5-12。当n为2时，所述低聚物命名为“二聚物”；当n为3时，所述低聚物命名为“三聚物”；当n为4时，所述低聚物命名为“四聚物”；当n为5时，所述低聚物命名为“五聚物”；相似的列举可为n高至18并包括18和更高的低聚物命名，因此当n为18时，所述低聚物命名为“十八聚物”。
所述可可多酚的合成衍生物包括根据上式An的化合物，其中R为3-(α)-O-糖类、3-(β)-O-糖类、3-(α)-O-C(O)-R1或3-(β)-O-C(O)-R1；其中所述糖类部分衍生自单-或二-糖，选自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖；其中所述糖类部分的任何或全部的R、X、Y和Z可任选在任何位置被酚部分通过酯键被取代；其中所述酚部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羟基苯甲酸和芥子酸；其中R1为任选被至少一个羟基取代的芳基或杂芳基部分。优选R1的取代芳基或杂芳基可包括相应于咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羟基苯甲酸和芥子酸的取代酚基的取代部分。
所述多酚低聚物可通过以下步骤制备：
(a)采用保护基团保护第一和第二多酚单体的每一个酚羟基产生第一和第二保护的多酚单体；
(b)官能化第一保护多酚单体的4号位产生具有下式的官能化保护多酚单体：
其中：c为1至3的整数；
d为1至4的整数；
y为2至6的整数；
R为保护基团；和
R*为H或OH；
(c)采用所述官能化保护多酚单体偶合第二保护多酚单体产生保护的多酚二聚体作为多酚低聚物；
(d)任选重复官能化和偶合步骤以形成具有n单体单元的多酚低聚物，其中n为3至18的整数；优选5-12；和
(e)除去所述酚羟基上的保护基团。
优选的保护多酚单体为溴化保护的表儿茶素或溴化保护的儿茶素，更优选为8-溴-表儿茶素或8-溴-儿茶素。
在以上方法中，保护的多酚单体的4号位可在二醇(如当y为2时为乙二醇)存在下使用醌氧化剂进行氧化官能化。
以上的方法可进一步包括通过酯化所述多酚低聚物的至少一个单体单元的3号位产生酯化多酚低聚物而形成所述多酚低聚物的衍生物的步骤。所述酯基可选自-OC(O)-芳基、-OC(O)-取代芳基、-OC(O)-苯乙烯基和-OC(O)-取代苯乙烯基，其中所述取代芳基或取代苯乙烯基含有至少一个取代基，它选自卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、硫羟、亚甲二氧基、二卤代亚甲二氧基、C1-C6的烷基、C1-C6的烷氧基、C1-C6的卤代烷基、C1-C6的卤代烷氧基、C3-C8的环烷基和C3-C8的环烷氧基。优选至少一个单体单元的3号位转化为衍生自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羟基苯甲酸和芥子酸等的衍生基团。
以上的方法可进一步包括通过糖基化所述多酚低聚物的至少一个单体单元的3号位产生糖基化多酚低聚物而形成所述多酚低聚物的衍生物的步骤。优选至少一个单体单元的3号位转化为选自-O-苷或-O-取代苷的衍生基团，其中所述取代苷被-C(O)-芳基、-C(O)-取代芳基、-C(O)-苯乙烯基或-C(O)-取代苯乙烯基所取代。所述取代芳基或取代苯乙烯基含有选自卤素、羟基、硝基、氰基、氨基、硫羟、亚甲二氧基、二卤代亚甲二氧基、C1-C6的烷基、C1-C6的烷氧基、C1-C6的卤代烷基、C1-C6的卤代烷氧基、C3-C8的环烷基和C3-C8的环烷氧基的取代基。优选所述苷选自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
本发明的食品可含有一个或多个所述可可多酚单体、低聚物2-18或它们的衍生物。优选本发明的食品含有可可多酚低聚物2-18或它们的衍生物的混合物；更优选本发明的食品含有可可多酚低聚物5-12或它们的衍生物的混合物。
本发明的食品包括用于被人和其它哺乳动物，如狗、猫、马等摄取的制品。本发明的食品可被摄取作为营养、娱乐、医药或兽医的目的。
优选的食品是糖果、烘烤制品、调味品、谷物类长面包、麦片长面包、糖浆、粉状饮料混合物、饮料等。更优选本发明的食品为含有坚果，如花生、胡桃、杏仁、榛子、坚果等的巧克力糖果。所述坚果仁可为任何形式，如完整的坚果、破碎的坚果、磨碎坚果、坚果仁糊等。优选的非巧克力食品包括花生浆、花生糖等。这些非巧克力食品可含有可可成分，特别是含可可多酚的可可成分，但是不要认为是本领域传统工艺中的一种巧克力，如含有较少份量的可可粉而含有高浓度的可可多酚的花生浆(butter)。
在美国，食品中使用的巧克力必需符合美国食品和药物行政管理机关根据联邦食品、药物和化妆品法令建立的特性标准(SOI)，该标准规定了可标志为“巧克力”的糖果的必需成分和它们所占的份量。
在美国的消费中最流行的巧克力或巧克力糖为甜巧克力或牛奶巧克力。巧克力基本上为悬浮在脂肪中的可可固体的混合物。牛奶巧克力为含有无脂牛奶固体、牛奶脂肪、巧克力浆、营养性碳水化物增甜剂、可可脂的混合物，还可包括各种其它成分如乳化剂、调味品和其它添加剂。甜巧克力含有比牛奶巧克力更高量的巧克力浆，但更低量的牛奶固体。半甜巧克力需要至少35％(重量)的巧克力浆和其它方面与甜巧克力的定义相似。深色巧克力通常只含有巧克力浆、营养性碳水化物增甜剂和可可脂并被定义为甜巧克力或半甜巧克力。奶油巧克力和脱脂巧克力与牛奶巧克力的不同之处在于乳脂分别来源于各种形式的甜性稀奶油、奶油和脱脂乳。脱脂乳要求乳脂的总量限制在低于牛奶巧克力的最少量。混合的乳品巧克力与牛奶巧克力的不同之处在于其牛奶固体包括任何或全部的牛奶巧克力、奶油巧克力或脱脂巧克力所列出的牛奶固体。白巧克力与牛奶巧克力的不同之处在于其包含有无脂可可固体。热稳定巧克力在这里也非常有用。
非标准巧克力为其组成在标准巧克力指定范围外的那些巧克力。当一种指定成分被部分或全部取代时，如当采用植物油或脂肪取代可可脂时，便将这种巧克力归类为“非标准”巧克力。对巧克力配方所作的任何增减使得其在巧克力的US FDA特性标准之外将不允许使用术语“巧克力”描述该种糖果。然而，如这里所用的术语“巧克力”或“巧克力制品”是指任何特性标准或非特性标准的巧克力制品。
巧克力可采用固体块巧克力的形式，如长条形或新的形状。也可将巧克力作为一种成分结合在其它更复杂的糖果中，其中巧克力与其它食品结合或通常覆盖在其它食品上，这些食品包括焦糖、花生浆、牛轧糖、水果片、坚果、松薄饼、冰淇淋等。这些食品的特征在于在常规的大空条件下、在65°-85°F(18-29℃)下微生物可稳定贮藏。
术语“碳水化合物”是指营养性碳水化物增甜剂，具有不同程度的甜味强度和可为通常使用的那些，包括(但不限于此)蔗糖(如甘蔗或甜菜)、右旋糖、果糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖浆固体、玉米糖浆固体、软化糖、水解乳糖、蜂蜜、槭糖、红糖、蜜糖等的任何一种。
所述巧克力食品还可含有其它成分如无脂牛奶固体、无脂可可固体(可可粉)、糖代用品、天然或人造调味剂(如香料、咖啡、盐等以及它们的混合物)、蛋白质等。
本发明的食品还包括L-精氨酸。可使用任何L-精氨酸来源，即合成或天然的精氨酸。特别优选的L-精氨酸来源包括大豆和坚果仁如花生、胡桃、杏仁、榛子等。也可使用脱脂和部分脱脂果仁以增加L-精氨酸浓度。部分或全脱脂的磨碎果仁均指坚果碎仁。
除了已知通过可可矢车菊苷配质或含有可可矢车菊苷配质的组合物引起的生理活性外，L-精氨酸与可可矢车菊苷配质结合产生更好的作用，如增加氧化氮生产。
NO和/或NO-合酶调节剂的协同作用的一个实施方案在以下举例。许多食品含有相当大量的L-精氨酸，但不一定非得含有可可多酚。假使L-精氨酸为NO-合酶基质，那么接受了L-精氨酸补充的高胆固醇血的动物的NO相依性的血管舒张将得到显著改善(参见Cooke等，Circulation 83:1057-1062,1991)并且假使可可多酚可调节NO水平，那么也可期望内皮相依性的血管舒张得到协同改善。已有报导在未加糖的可可粉中L-精氨酸的水平为1.0至1.1g/100g。在这个基础上，将其它来源的L-精氨酸引入食品中以提供给NO和NO-合酶调节剂最大的益处。在一个特别优选的实施方案中，所述可可和/或坚果多酚和L-精氨酸能以有效提供上述协同益处的量存在，如每单位剂量大约1mg至大约10g，优选大约25mg至3g的矢车菊苷配质。本发明的制品可用于阻止哺乳动物中癌细胞的成长、降低哺乳动物中的高血压、治疗炎症性肠病、阻止哺乳动物中细菌的生长、阻止或减少其它硬化或再狭窄的发生、调节血小板聚集、调节编程性细胞死亡、作为抗氧剂，特别用于阻止哺乳动物体内LDL的氧化、调节环加氧酶和/或脂肪氧合酶、调节或刺激哺乳动物体内的氧化氮(NO)生产或氧化氮(NO)合酶、治疗哺乳动物体内氧化氮(NO)影响的高胆固醇血、调节体内葡萄糖、阻止Ⅱ型拓扑异构酶，减少在哺乳动物的单核细胞和/或巨噬细胞中的INOS，以及作为抗菌剂、抗肿瘤剂、抗龈炎剂或抗牙周炎剂。
使用本发明的含有可可和/或坚果多酚和L-精氨酸的食品和药物组合物，可实施改善哺乳动物、特别是人的健康的新方法。
本发明的一个优选实施方案是通过在有效期间内每天供给哺乳动物有效量的含有可可和/或多酚和L-精氨酸的食品或药物组合物来改善该哺乳动物的健康的方法。所述有效时间根据治疗条件的不同可从几乎瞬间至大于60天内变化。在一方面，所述哺乳动物的健康通过在一段大于5天至大于60天的时间内每天摄取含有可可多酚和L-精氨酸的可食组合物来提高。
在本发明中使用多酚调整氧化氮(NO)和NO-合酶。精氨酸作为NO-合酶的酶作用物。可可多酚和L-精氨酸的结合量有效地引起吸收了所述食品的哺乳动物的生理反应。所述生理反应是氧化氮生产的增加超过了单独供给可可多酚或L-精氨酸得到的生理反应。我们相信这种增强的氧化氮生产导致了前述与氧化氮生产有关的健康益处。
本发明的食品和药物组合物如在调节血管舒张中是有用的，另外在调节血压或改善冠状疾病和偏头痛也是有用的。本发明供应的组合物引发的反应包括降低高血压和扩张血管。
本领域的技术人员使用这里所阐述的技术可以容易地制备本发明的新食品。
所述可可成分可由发酵因数少于300的可可豆和/或由发酵因数不少于300的可可豆制备。由发酵因数不少于300的可可豆制备的碱化可可成分可结合由发酵因数小于300的可可豆制备的可可成分一起使用。
可通过在配制所述食品过程中保护碳水化物成分和/或牛奶成分来保护基于巧克力的食品的可可矢车菊苷配质含量。在加入巧克力成分前进行所述成分的保护。将选自脂肪、乳化剂、抗氧剂、调味剂和它们的混合物的至少一种保护成分加入所述碳水化物成分和/或牛奶成分中形成第一混合物。将第一混合物与巧克力成分结合形成第二混合物。所述食品在第二混合物中形成。所述食品可为糖果或饮食添加剂。所述糖果可为深色或牛奶巧克力。任选将所述碳水化物和/或牛奶成分在与保护成分混合前进行碾磨以减少粒径。也可在与保护的碳水化物和/或牛奶成分的第一混合物结合前将所述巧克力成分碾磨。作为预处理成分使用的优选的脂肪为可可脂和/或含有可可脂的由发酵因数不少于300的可可豆制备的巧克力浆。优选的乳化剂包括卵磷脂和/或分馏的卵磷脂。适合的抗氧剂包括鞣酸类、醌类、多羟基化合物、磷脂、母育酚化合物、和/或它们的衍生物。适合的调味剂包括香草醛、香料、和/或天然压榨柑橘油或香料油。可将所述第一混合物、巧克力成分和/或第二混合物做成巧克力。所述巧克力在大约50至大约65℃下进行制备。第二乳化剂可在制作巧克力过程或之后加入。第二乳化剂可为卵磷脂、蔗糖polyeruiate、铵磷脂、聚甘油、多聚蓖酸酯、磷酸单-和二-苷/脱乙酰酒石酸的单甘油酯和分馏的卵磷脂。采用保护的碳水化物和/或牛奶成分制备的食品比采用不包括碳水化物成分和/或牛奶成分的预处理的方法制备的食品多含有至少10至20％(总量)的可可矢车菊苷配质。
通过加入一定量的果仁(如花生)使得足于提供满足所需L-精氨酸的浓度，这样便可将L-精氨酸加入到食品中。
如前面所述，特别优选的食品为巧克力糖果。在巧克力糖果中的巧克力含有较高浓度的可可多酚。在本实施方案中，基于制品中无脂可可固体的总量计算每克巧克力含有至少3,600μg、优选至少4,000μg、优选至少4,500μg、更优选至少5,000μg、和最优选至少5,500μg的可可矢车菊苷配质。根据一个优选的实施方案，基于制品中无脂可可固体的量计算每克巧克力含有至少6,000μg、优选至少6,500μg、更优选至少7,000μg、和最优选至少8,000μg的可可矢车菊苷配质，和甚至更优选10,000。
另一个实施方案涉及每克巧克力含有至少200μg、优选至少225μg、更优选至少275μg、和最优选至少300μg的可可矢车菊苷配质五聚体(基于巧克力食品中无脂可可固体的总量计算)的巧克力食品。优选所述巧克力中每克含有至少325μg、优选至少350μg、更优选至少400μg、和最优选至少450μg的可可矢车菊苷配质五聚体(基于巧克力食品中无脂可可固体的总量计算)。
而另一个实施方案涉及牛奶巧克力糖果，其中每克含有至少1,000μg、优选至少1,250μg、更优选至少1,500μg、和最优选至少2,000μg的可可多酚(基于所述牛奶巧克力制品中无脂可可固体的总量计算)。在优选的实施方案中所述牛奶巧克力中每克含有至少2,500μg、优选至少3,000μg、更优选至少4,000μg、和最优选至少5,000μg的可可矢车菊苷配质(基于所述牛奶巧克力制品中无脂可可固体的总量计算)。
在另一个实施方案中所述食品为牛奶巧克力，其中每克含有至少85μg、优选至少90μg、更优选至少100μg、和最优选至少125μg的可可矢车菊苷配质五聚体(基于所述牛奶巧克力制品中无脂可可固体的总量计算)。在一个优选的实施方案中所述牛奶巧克力中每克含有至少150μg、优选至少175μg、更优选至少200μg、和最优选至少250μg的可可矢车菊苷配质五聚体(基于所述牛奶巧克力制品中无脂可可固体的总量计算)。
非巧克力食品可含有至少1μg、优选至少5μg、更优选至少10μg、更优选至少25μg、和最优选至少50μg的可可矢车菊苷配质。如果需要，与上述巧克力食品中的含量相比，所述非巧克力食品可含有更高水平的可可矢车菊苷配质。
食品中L-精氨酸的量可以变化。一般可可中每100g的部分脱脂可可固体含有1至1.1g的L-精氨酸。其范围的每100g的可可含有0.8至1.5g的L-精氨酸。本发明的巧克力食品含有的L-精氨酸的量高于在所述可可成分中天然存在的量。若已知在所述食品中所用的可可成分和L-精氨酸的量，本领域的技术人员可容易地测定在最终制品中L-精氨酸的总量。
所述食品中每克食品一般含有至少1μg、优选至少10μg或至少100μg、更优选至少1000μg或5,000或10,000μg、和最优选至少20,000、50,000或100,000μg的L-精氨酸。
如上所述，本发明还涉及含有至少一种可可多酚、L-精氨酸和药物可接受组合物的药物组合物。本领域的技术人员可容易地制得含有每单位剂量大约1μg至大约10g的L-精氨酸。本发明的药物组合物可用于治疗需要增加氧化氮生产及由此带来的益处(如降低血压)的哺乳动物。
测试方法
以下方法可用于定量测定在各种实施例中矢车菊苷配质和L-精氨酸的量。
方法A用于定量测定在实施例1至实施例3中所报导的可可矢车菊苷配质的量(总量及五聚体的量)。
方法B应用在定量测定实施例4至10中的食品和食物成分中可可和坚果矢车菊苷配质的量(总量及五聚体的量)。方法B用于定量测定实施例14中报导并在实施例17至19中使用的纯化的可可矢车菊苷配质低聚物的可可矢车菊苷配质的含量。
方法C应用在萃取和鉴定坚果矢车菊苷配质矢车菊苷配质的测定
方法A
通过使用Tekmar A-10分析型碾磨机碾磨6-7g样品5分钟制备可可多酚萃取物，或者在巧克力浆的情况下，由6-7g巧克力浆样品不进行另外的碾磨直接制备得到。随后转移所述样品至50mL的聚丙烯离心试管中，加入大约35mL的己烷，激烈摇荡样品1分钟。使用International Equipment Company IECPR-7000离心机在3000RPM下旋转样品10分钟。倾析出己烷层后，再重复2次脂肪萃取处理。称量大约1g的脱脂物质加入15mL的聚丙烯离心试管中，同时加入5mL70％的丙酮、29.5％的水和0.5％的乙酸溶液。使用Scientific Industries VortexGenie2将样品涡旋大约30秒钟并在IECPR-7000离心机中在300RPM下离心10分钟。将所得的浆通过Millex-HV0.45μ过滤器过滤至1mL的hypovial中。
采用装备有HP1046A型可编程荧光检测器和二极管阵列检测器的Hewlett Packard 1090系列ⅡHPLC系统分析可可多酚萃取物。在37℃下，在连接了Supelco Supelcosil LC-Si 5μm的保护柱(20×2.1毫米)的5μ的Supelco Supelcosil LC-Si柱(250×4.6mm)中实现分离。矢车菊苷配质在以下线性梯度条件下洗脱：(时间％A,％B,％C)；(0,82,14,4)；(30,67.6,28.4,4)；(60,46,50,4),(65,10,86,4),接着进行5分钟的再平衡。流动相组合物为A=二氯甲烷，B=甲醇和C=1∶1体积比的乙酸∶水。使用1mL/min的流速。通过荧光检测成分，其中λex=276nm和λem=316nm，或通过在280nm的紫外光检测。使用表儿茶素作为外标。
HPLC条件：
250×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si柱(5μm)20×2.1mmSupelco LC-Si(5μm)保护柱
检测器：光二极管阵列，在280nm
荧光λex=276nm；λem=316nm
流速：1mL/min
柱温：37℃ 梯度 CH2Cl2 甲醇 乙酸∶水(1∶1) 0 82 14 4 30 67.6 28.4 4 60 46 50 4 65 10 86 4
方法B
在本方法中采用正相高效液体色谱(HPLC)方法及荧光检测(FLD)，代替280nm的紫外检测定量测定单体和低聚物的可可和坚果矢车菊苷配质。
使用Hammerstone等的报导“Identification of Procyanidins in Cocoa(Theobroma cacao)and Chocolate Using High Performance LiquidChromatography/Mass Spectrometry”,J.Agric.Food Chems.47,2：490-496(1/14/99)中的正相HPLC方法进行分离并定量测定至多为十聚体的低聚物。
通过萃取可可豆得到矢车菊苷配质标准物至十聚体,通过Sephadex LH-20凝胶渗透色谱富集并且最后通过制备正相HPLC进行纯化。每一个低聚物馏分的纯度通过HPLC和质谱联用评定。
随后制备组合标准物并使用面积和对浓度的二次方程作出每一个低聚物类型的校正曲线。
可可豆由巴西Itajuipe的Almirante Center for Cocoa Studies提供。
参比化合物为(-)-表儿茶素(Sigma Chemcal,St.Louis)和纯化的低聚物得自巴西可可豆。
萃取经过在液氮下、在高速实验室碾磨机中碾磨至粒径减少为大约90μm的新鲜种子得到可可矢车菊苷配质。通过采用1000mL己烷萃取3次从220克磨碎的种子中移出类脂类。将所得的无脂固体空气干燥得到大约100g的无脂物质。通过采用1000mL的70％(体积)的丙酮水溶液萃取得到含矢车菊苷配质馏分。将所述悬浮液在1500xg下离心10分钟。将丙酮层通过填充有玻璃棉的漏斗倾析出。随后采用己烷(～75mL)再次萃取所述含水丙酮除去残余的类脂类。将己烷层弃去并在部分真空及40℃下将含水丙酮旋转蒸发至最终体积为200mL。将含水萃取物冷冻干燥得到大约19g的丙酮萃取物。
为了进行凝胶渗透色谱，将大约2g的丙酮萃取物悬浮在10mL70％的含水甲醇中并在1500xg下离心。将上清液在已经采用甲醇平衡的流速为3.5mL/min的Sephadex LH-20柱(70×3cm)中进行半纯化。装载了样品2.5小时后，每20分钟收集馏分一次并采用HPLC分析可可碱和咖啡碱(Clapperton等，“Polyphenols and CocoaFlavour”,Proceedings,16th International Conference of group Polyphenols,Lisbon,Portugal,Grouppe Polyphenols,Norbonne France,Tome Ⅱ:112-115 1992)。一旦可可碱和咖啡碱流出柱(～3.5小时)，收集剩下的流出物另外4.5小时并在部分真空及40℃下进行旋转蒸发以除去有机溶剂。随后将萃取物悬浮在水中并进行冷冻干燥。
通过制备正相HPLC纯化可可矢车菊苷配质低聚物。将大约0.7g半纯化丙酮萃取物溶解在7mL体积比分别为70∶29.5∶0.5的丙酮-水-乙酸中。在室温下使用5μ的Supelcosil LC-Si 100_(50×2cm)进行分离。矢车菊苷配质通过在下表显示的线性梯度条件下洗脱。低聚物的分离通过280nm的紫外光进行监控并收集相应于低聚物的波峰之间的波谷的馏分。将几个制备分离的具有相同停留时间的馏分集聚在一起，在部分真空下进行旋转蒸发并进行冷冻干燥。
制备正相HPLC的梯度曲线 时间 (分) 氯代甲烷∶乙酸∶水 (96∶2.2v/v) 甲醇∶乙酸∶水 (96∶2.2v/v) 流速 (mL/min) 0 92.5％ 7.5％ 10 10 92.5％ 7.5％ 40 30 91.5％ 8.5％ 40 145 78.0％ 22.0％ 40 150 14.0％ 86.0％ 40 155 14.0％ 86.0％ 50 180 0％ 100％ 50
为了进行部分纯化的可可矢车菊苷配质低聚物的质谱分析，采用HPLC/质谱(MS)分析纯化部分，使用由Lazarus等在“High PerformanceLiquid Chromatography/mass Spectrometry Analysis of Proanthocyanidinsin Food Stuffs”,J.Agric.Food Chem.(1998年提交)中描述的参数。通过使用紫外光在280nm检测的峰面积结合比较每种低聚物类型之间的离子丰度的比例测定每部分的纯度。对于单体使用商业可得的(-)-表儿茶素和对于二聚物至十聚体使用纯化的低聚物制备组合标准储液。
在下表中显示组合标准储液的低聚物的分布。
组合标准物的低聚物的分布 可可矢车菊苷配质 组成(％重量) 单体 9.82 二聚体 13.25 三聚体 9.85 四聚体 10.49 五聚体 10.51 六聚体 12.68 七聚体 7.98 八聚体 8.44 九聚体 11.56 十聚体 5.42
储液按以下浓度制备：20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL和0.4mg/mL。
将巧克力浆和巧克力样品如以上方法进行萃取，仅使用(大约8g样品)45mL的己烷。如上采用5mL的丙酮-水-乙酸萃取大约1g的脱脂物质。通过在1500xg下离心所述固体10分种将其造粒。随后通过0.45nicron尼龙过滤器将上清液过滤至HPLC注射瓶中。所有脱脂样品一式两份进行称重、萃取和注射。使用AOAC Official Method 920.177测定巧克力浆和巧克力的脂肪组合物。需要对样品的大小做轻微的修改以结合使用1g的巧克力样品和0.5g的浆样品。使用装备有自动注射器、四元HPLC泵、柱加热器、荧光检测器和用于数据收集和处理的HP Chem Station的HP1100系列HPLC(Hewlett Packard,Palo Alto,CA)进行可可矢车菊苷配质的高效液体色谱分析。荧光检测在激发波长276nm和发射波长316nm处作记录。在37℃下使用Phenomenex(Torrance,CA)5μLichrosphere二氧化硅柱(25×4.6mm)以5μL的注射体积进行矢车菊苷配质低聚物的正相分离。三元流动相由A)二氯甲烷、B)甲醇和C)乙酸和水(1∶1v/v)组成。在1mL/min的流速下，通过一系列的B-A，其中具有恒定的4％的C的线性梯度进行分离，线性梯度如下：洗脱开始为14％的B-A；0-30分，14-28.4％的B-A；30-45分，28.4-39.2％的B-A；45-50分，39.2-86％的B-A。在注射25mL(10个柱体积)的当量初始流动相之间将柱再平衡。
为了定量测定巧克力浆和巧克力中的可可矢车菊苷配质，使用相应于每种低聚物类型的峰面积和与浓度的关系的二次方程作出储液的校正曲线。
方法C
本方法是用于测定坚果中的矢车菊苷配质的类型。存在于坚果中的单体和低聚物的矢车菊苷配质根据聚合程度进行分离并使用改进的正相高效液体色谱(HPLC)方法结合使用大气压电离电雾化(API-ES)室的联机质谱(MS)分析进行鉴定。
原料花生由M&M/MARS(Hackettstown,NJ)提供。原料杏仁由Almond Board of California(Modesto,CA)提供。
使用的标准物为(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素(Sigma Chemical,St.Louis,MO)。
采用3×5mL的甲醇冲洗固体相萃取(SPE)柱(Supelcosil Envi-1820mL柱，得自Supelco,Inc.,Bellafonte,PA)并随后在样品装载前采用3×5mL的水调湿。经过适当的样品装载和冲洗程序后，在真空下干燥所述柱1-2分钟。接着在矢车菊苷配质流出所述SPE柱之前将柱在10mL的丙酮-水-乙酸(体积比分别为70∶29.5∶0.5)中浸渍1分钟。为了从花生壳中萃取出矢车菊苷配质，在采用25mL的丙酮-水-乙酸(体积比分别为70∶29.5∶0.5)进行萃取前将大约3.5g的花生壳在实验室碾磨机中磨碎。在1500xg下将所述悬浮液离心10分钟并将上清液倾析出。在通过在部分真空及45℃下旋转蒸发除去有机溶剂前向上清液中加入20mL的水得到大约22mL的含水萃取物。将所述含水萃取物(22mL)装载入预调湿的SPE柱中并采用40mL的水冲洗。随后如上所述流出矢车菊苷配质。为了从花生果仁中萃取出矢车菊苷配质，将花生果仁在液氮下冷冻并接着在实验室碾磨机中碾磨成粉末。采用45mL己烷萃取所述花生果仁粉末(～10克)3次以除去脂类。将1g得到的脱脂果仁采用5mL的丙酮-水-乙酸(体积比分别为70∶29.5∶0.5)进行萃取。
对于杏仁种皮，使用薄片从原料杏仁除去大约24g的种皮。随后将种皮采用135mL的己烷脱脂两次并在1500xg下离心10分钟得到大约14.6g的脱脂物质。采用90mL的丙酮、水和乙酸(体积比分别为70∶29.5∶0.5)萃取所述脱脂种皮。往上清液中加入30mL的水并将所得酸化含水丙酮在部分真空及45℃下旋转蒸发得到最终体积为50mL。将含水溶液装载入经过预调湿的SPE柱中，采用大约10mL的水冲洗，矢车菊苷配质如上述流出。
使用HP1100系列HPLC(如在以上方法B中描述)连接装备有API-ES电离室的HP1100系列质量选择检测器(G1946A型)进行所述萃取物的HPLC/MS分析。在HPLC的洗脱液流刚好进入质谱仪之前通过T形管加入缓冲剂并采用HP1100系列HPLC泵传输绕过脱气装置。负离子方式的分析条件包括以～0.75M的氢氧化铵作为缓冲剂，流速0.04mL/min，毛细管电压3kv，碎裂器电压75v，喷雾压力25psig和干燥气体温度为350℃。数据在HP ChemStation中使用扫描模式和选择离子监控进行收集。色谱以每循环1.96秒对m/z100-3000的整个质量范围进行扫描。
杏仁种皮离子的质谱数据表明存在单独连接的矢车菊苷配质的多至七聚体的低聚物，而花生壳的质谱数据表明存在单独和双连接的多至八聚体的低聚物。在花生果仁中没有检测到矢车菊苷配质。
L-精氨酸含量的测定
使用在AOAC Official Method 982.30,AOAC Official Methods ofAnalysis 91995,Vitamins and Other Nutrients，第45章，第59-61页中报导的方法进行L-精氨酸的测定。将样品酸解并使用有利于所用的氨基酸分析器的参数将3个水解产物的每一个进行分析。使用标准L-精氨酸溶液至少每24小时一次校正所述分析器。通过AOAC OfficialMethod 955.04C、920.39A、976.05A或其它适合的Kjidahl方法测定氮气。未校正g/16gN根据以下计算：
gL-精氨酸(未校正16g样品N=(n摩尔L-精氨酸×初始样品体积(mL)×MwL-精氨酸)/(样品注射体积(mL)×样品重量(g)×样品的％N×6.25×105))
将大约0.1g(称量精确至0.1mg)样品放在水解试管中，加入10mL6N的HCl并混合进行酸解。将所述混合物在干冰-乙醇浴中冰冻。抽取真空＜50u并保持1分钟，随后将试管真空密封。在110+1℃下将样品水解24小时。接着冷却试管并揭开密封。将水解产物通过WhitmanNo1纸过滤。试管采用水冲洗3次并将每一次洗液过滤。将滤液在真空及65℃下干燥。将干燥的水解产物溶解在一定体积的适合于氨基酸分析器的缓冲剂中。在进行分析前，所述水解产物不能贮存超过1星期。
实施例
以下的实施例是作为对本发明的某些优选实施方案的说明，而不意味着对本发明的限制。在实施例17、18和19中的离析出的可可矢车菊苷配质低聚物的离析使用了在美国专利5,554,645(于9/10/96授权给L.Romanczyk等)中描述的方法并进一步使用方法B的程序进行纯化。
实施例1
从可可豆取得可可多酚、可可固体的方法
商业可得的具有原始水分含量为大约7至8％(重量)的可可豆使用11”×56”的谷物预净机(由Carter Day Intemational,Minneapolis,MN,USA制造)预净化。在6.5小时的时间内将大约600袋的可可豆(39,000kg)预净化。将所述豆进料至入口进料斗，其流速通过机械进料辊调节。将豆进料至旋转式线网除谷皮转筛的外部。将豆通过线网筛并接着通过空气吸气室，在这里从产物流中吸出轻污垢、灰尘、和细绳。没有穿过除谷皮转筛的豆被转运至筛除粗物流。这个筛除粗物流含有大块的豆、杆和石头等。产生的筛除粗物流的量为大约150kg，或原料的38％。称量所得的预净化产物为大约38,850kg并通过豆净化步骤。
随后将从谷物预净机出来的预净化豆产物使用CamasIntemational SV4-5空气流化床密度分离器(AFBDS,由Camasinternational,Pocotello,ID,USA制造)。在大约6.5小时内将大约38,850kg的可可豆产物进料至所述AFBDS中。该设备基本上将所有的重杂质如石头、金属、玻璃等，还有更轻的无用物质如发霉和感染的可可豆从豆中除去，得到的净化豆产物中基本只含有有用的可可豆。产生的被除去的重杂质重约50kg和所述轻的无用物质重约151kg。经过上述的预净化和净化步骤后总共得到大约38,649kg的净化豆(经过净化后产率为99.1％)。
然后将净化的可可豆通过红外加热设备。所用的设备为Micro Red20电子红外振动粉碎机(由Micronizing Company(U.K.)Limited,U.K.制造)。所述粉碎机以每小时大约1,701kg的速率运转。粉碎机的振动床的豆深为大约2英寸或大约2-3个豆深。粉碎机的表面温度设置在大约165℃，在1至1.5分钟的时间内产生大约135℃的IBT。这种处理使得壳快速干燥并与可可碎仁分离。由于基本上所有进料至粉碎机的可可豆均为完整的豆并基本上不含豆或壳的小碎块，因此在红外加热过程中不会观察到火星或火焰。在送进粉碎机前通过振动筛分离的碎块在进行风选步骤前再次被引入产物流中。
经过粉碎机后的豆具有大约3.9％(重量)的水分含量。将从粉碎机出来的IBT为大约135℃的豆立即在大约3分钟内冷却至大约90℃的温度以最大限度减少额外水分的损失。经过加热步骤后总共可得大约36,137kg的豆。
接着使用Jupiter mitra Seita风选机(由Jupiter mitra Seita,Jakarta,Indonesia制造)对豆进行风选。风选步骤使豆裂开以松开壳并从碎仁中分离出更轻的壳，而同时最大限度减少碎仁随筛除粗物流的损失。风选机的进料速率为每小时大约1,591kg。所得产物含有大约31,861kg可用的碎仁和4,276kg的筛除粗物流。来自原料的可用碎仁的总产率为大约81.7％。
使用Dupps 10-6压榨机(由Dupps Company,Germantown,Ohio,USA制造)将所得的可可碎仁压榨。将每小时大约1,402kg的碎仁稳定地、连续地进料送入双螺杆中压榨以提取黄油。压榨产生大约16,198kg含有大约10％的可可固体的可可脂和大约15,663kg含有大约10％可可脂的可可固体。
使用Sharples P3000倾析离心器(由Jenkins Centrifuge Rebuilders,N.Kansas City,MO,USA制造)进一步加工可可脂。离心使所述可可脂中的固体含量降低至大约1-2％的固体并提供大约13,606kg的可可脂和2,592kg含有大约40至45％可可脂的可可固体。使用板框压滤机(由Jupiter Mitra Seita制造)进一步加工含有1-2％固体的可可脂，从可可脂中除去剩余的固体并提供大约13,271kg透明可可脂和大约335kg含有40-45％可可脂的可可固体。
从离心机和过滤器压榨移出的可可固体含有大约40-45％的脂肪并在间歇式液压机中压榨得到10％脂肪可可油饼。这种物质产生大约1.186kg的透明可可脂和1,742kg的可可固体。
从加入的豆计算的透明可可脂的总产率为14,456kg或37.1％。从加入的豆总共生产了17,405kg或44.6％的可可固体。
根据上述方法由未发酵的可可豆(发酵因数为100)生产的部分脱脂可可固体可可粉的样品含有以下浓度的矢车菊苷配质：总矢车菊苷配质32,743μg/g、矢车菊苷配质9,433μg/g、矢车菊苷配质二聚体5,929μg/g、矢车菊苷配质三聚体5,356μg/g、矢车菊苷配质四聚体4,027μg/g、矢车菊苷配质五聚体3,168μg/g、矢车菊苷配质六聚体2,131μg/g、矢车菊苷配质七聚体1,304μg/g、矢车菊苷配质八聚体739μg/g、矢车菊苷配质九聚体439μg/g。
实施例2
含有可可多酚的巧克力浆的生产
选择含有原始水分含量为7.4％(重量)和发酵因数水平为233(31％石板色、29％紫色、22％紫褐色和17％褐色)的中等品(FAQ)Sulawesi可可豆作为原料。随后将可可豆通过红外加热装置。所用的装置为红外振动粉碎机(由Micronizer Company(U.K.)Limited,U.K.制造)。豆通过所述红外加热器的进料速率和红外加热器床的角度均作改变以控制豆接收的热处理量。豆在所述红外加热器中的时间(停留时间)由床的角度和进料速率决定。下表1列出用于制备各种物质的时间。测量在所述粉碎机的出口豆的内部豆温(IBT)，这些数值也在表1中列出。
将1kg经红外加热的豆样品(在不同的IBT下从红外加热器中收集)打碎成更小块，这样做有利于使碎仁从壳中分离。在实验室中用于除去壳的设备为由John Gordon Co.LTD of England制造的Limiprimita可可破碎机。接着将打碎的豆通过实验室规模的Catador CC-1风选系统(由John Gordon Co.LTD,England制造)。
可可碎仁接着采用由Pascall Engineering Co.LTD,England制造的Melange碾磨为粗浆。该装置使可可仁压碎并碾磨为巧克力浆。对于所述浆在Melange中的正常工作温度约为50℃。可使用其它类型的碾磨机(如采用Carle & Montanari碾磨机)在较大的生产规模上进行将可可碎仁加工为粗浆的相同方法。可可碎仁在Melange中碾磨1小时。测试相对于红外加热温度的样品的可可前矢车菊苷配质的浓度。这些值在以下表1中给出。
表1 IBT ℃ 在粉碎机中的停 留时间(秒) 成品浆液中的 水分(％) 脱脂浆中的矢车 菊苷配质(μg/g) 脱脂浆液中 的总矢车菊 苷配质(μg/g) 107 42 3.9 3,098 39,690 126 82 1.87 1,487 28,815 148 156 1.15 695 23,937
实施例3
巧克力食品
使用10磅曲拐式叶片搅拌机(由Teledyne Read Co.,York,Pennsylvania制造)将在以下列出的浓度范围内的成分混合在一起。在所给范围内本领域的技术人员是容易选择适合的成分和量来制备巧克力而无须进行大量的试验。
成分 ％浓度(重量)
蔗糖 40％
巧克力浆 7％
CP浆(实施例2) 49％
脂肪 3.5％
卵磷脂 0.5％
使用10磅曲拐式叶片搅拌机将卵磷脂和脂肪结合并混合至均匀。将所得的脂肪/卵磷脂混合物加入第二10磅曲拐式搅拌机的颗粒蔗糖中。在大约35℃至大约90℃下将蔗糖、脂肪和卵磷脂混合至均匀。加入包括实施例2的含有高浓度可可矢车菊苷配质的巧克力浆的剩余成分并混合至均匀。将所得的混合物精制至微粒径为大约20微米，制成巧克力(conched)并标准化。所得巧克力的可可矢车菊苷配质五聚体具有每克巧克力大约385至472μg的浓度。
加入最终制品重量的大约5-30％(重量)的花生形成具有高含量可可矢车菊苷配质和L-精氨酸的含巧克力花生制品。
实施例4
花生浆食品
将预烘烤花生与添加的制成花生浆所需的盐和糖一起碾磨。在混合过程中，将实施例1的具有高可可矢车菊苷配质含量的可可粉以大约2至3％(重量)的量(以混合物的总重量计算)加入所述混合物中。产物为含有可可多酚和L-精氨酸的花生浆。
实施例5
药物组合物
制备含有以下成分(百分数为重量百分数)的片状混合物：
实施例1的可可粉 -24.0％
L-精氨酸 -5.0％
天然香草萃取物 -1.5％
硬脂酸镁(润滑剂) -0.5％
Dipac片状糖 -32.0％
木糖醇 -37.0％
在食品加工器中将可可粉、香草萃取物和L-精氨酸混合几分钟。将糖和硬脂酸镁缓慢地混合在一起，接着与可可粉/香草萃取物/L-精氨酸混合物一起混合。将这个物质穿过在最大压力下的Manesty TabletPress(B3B)并压缩得到圆片(15mm×5mm)，称重为1.5至1.8g。
实施例6
深色巧克力
使用基本上与实施例3描述的方法相似的方式制备深色巧克力，使用以下的通用配方：
成分范围(％(重量))
15-35％蔗糖
40-75％实施例2的CP浆
1-10％实施例1的CP可可粉
1-10％脂肪
0.01-0.05％香草醛
0.1-1.0％卵磷脂
将大约5至30％(重量)的花生(以制品的总量计算)加入深色巧克力中。
实施例7
牛奶巧克力
使用基本上与实施例3描述的方法相似的方式制备牛奶巧克力，使用以下的通用配方：
成分范围(重量％)
35-55％蔗糖
12-25％牛奶成分
10-20％实施例2的CP浆
15-25％脂肪
0.1-1.0％乳化剂
将大约5至30％(重量)的杏仁(以制品的总量计算)加入巧克力中。
实施例8
采用高CP深色巧克力成分涂覆的花生浆-大豆曲奇长面包 成分 ％ 范围 每克巧克力 3.4mg深色巧克力 35 30-40 花生 32 30-40 大豆粉，低脂肪 11 10-15 植物油 5 2-10 糖 15 10-20 水 1.5 盐 ＜1 焦糖糖浆溶液 ＜1 碳酸氢钠 ＜1 棓酸丙酯 ＜1
通过混合花生、糖、植物油、盐和棓酸丙酯制备花生浆。通过混合大豆粉、水、植物油和碳酸氢钠并焙烤制备曲奇饼。随后将花生浆挤压到焙烤的曲奇饼上并接着将整个长面包浸在高CP深色巧克力中涂覆。
根据所述通用配方中的可可矢车菊苷配质、坚果矢车菊苷配质和精氨酸的含量，理论的矢车菊苷配质和精氨酸浓度显示如下：
总矢车菊苷配质 120mg/100g
精氨酸 1.4g/100g
实施例9
含有高CP可可和L-精氨酸的干酒混合物
根据以下配方制备含有实施例1的具有增强水平的可可多酚(CPs)和L-精氨酸的可可粉的干酒混合物：
成分 ％
糖 59
脱脂奶粉 20
麦芽粉 1.9
CP可可粉25-50mg/g可可粉 8.0
花生粉 10.0
香草醛 ＜0.01
卵磷脂 ＜0.995
盐 ＜0.1
调味剂 ＜0.1
根据以上配方将这些干成分配料并在Kitchen Aid ProfessionalMixer(KSM50P型)中以#2速度使用搅打器(Wire whip)混合1小时。在所述配方中使用之前，在Niro-Aeromatic Agglomerator(STREA/1型)中使卵磷脂凝聚。
根据所述配方成分中的可可矢车菊苷配质、坚果矢车菊苷配质和精氨酸的含量，理论的矢车菊苷配质和精氨酸浓度显示如下：
矢车菊苷配质 200-400mg/100g
L-精氨酸 0.9g/100g
实施例10
具有可可萃取物的果仁和种子长面包
杏仁 30
南瓜子 12
向日葵籽 5
芝麻仁 5
盐 ＜1
黄油 10
玉米糖浆 7.6
卵磷脂 ＜1
糖 26
可可萃取物 4
将杏仁在咸味黄油中稍微烘烤。加入南瓜子、向日葵籽和芝麻仁。将黄油、玉米糖浆、卵磷脂和盐混合并在微波炉中以1/2火力加热1分钟。将糖放在不锈钢沙司盘中并在感应蒸煮器中以全火力蒸煮。当糖几乎完全熔化后，降低至中等火力加热(290°F)并继续蒸煮直至糖全部熔化并呈现蜂蜜的颜色。当糖全部熔化时缓慢加入玉米糖浆/黄油混合物并混合。将所述坚果混合物放在直立混合器中。采用搅棒小心缓慢地将糖浆倒入坚果混合物中。使所述坚果/糖浆混合物形成长条并冷却。
根据所述配方成分中的可可矢车菊苷配质、坚果矢车菊苷配质和精氨酸的含量，理论的矢车菊苷配质和精氨酸浓度显示如下：
矢车菊苷配质 1586mg/100g
精氨酸 1.6g/100g
实施例11
在高CP深色巧克力中涂覆的花生、焦糖、牛轧糖、长面包
％配方
CP深色巧克力 31.5
花生w/壳 30.0
焦糖 27.0
牛轧糖 11.5
制备含有45％花生的牛轧糖混合物，切成厚片放在冷却的桌上并切成规则的条状。制备含有大约38％花生的焦糖混合物，冷却并切成相似的片状。将牛轧糖放在焦糖片的上面并将整条在含有大约10％花生的巧克力中涂覆。
根据该配方成分中的可可矢车菊苷配质、坚果矢车菊苷配质和精氨酸的含量，理论的矢车菊苷配质和L-精氨酸浓度显示如下：
矢车菊苷配质 260mg/100g
精氨酸 1g/100g
实施例12
可可来源及其制备方法
代表三种公认的可可园艺品种的几种可可基因型(Enriquez等，1967；Engels,1981)得自世界上三个主要可可产地。那些基因型一览表示于表2。其它品种的可可及其紧密相关的基因Herranina也适合在这里使用。
表2：可可来源材料的描述 基因型 产地 园艺品种 UIT-1 马来西亚 Trinitar 未知 西非 Foraster ICS-100 巴西 Trinitario (Nicaraguan Criollo祖先) ICS-39 巴西 Trinitario (Nicaraguan Criollo祖先) UF-613 巴西 Trinitario EEG-48 巴西 Forastero UF-12 巴西 Trinitario NA-33 巴西 Forastero
收获的可可豆荚是开裂的，取出带有果肉的发酵不足的可可豆进行冷冻干燥。手工取出果肉。手工脱壳并用TEKMAR碾磨机磨成细粉料(fine powery mass)。随后采用重蒸己烷作为溶剂，将产生的细粉料通过Soxhlet萃取过夜脱脂。在室温下，通过真空除去脱脂细粉料的残留溶剂。
实施例12
矢车菊苷配质萃取程序
A．方法1
采用Jalal和Collin(1977)描述的方法的修改方法，从实施例11的脱脂未发酵的冷冻干燥可可豆萃取矢车菊苷配质。用2,400ml70％的丙酮/去离子水，然后用400ml70％的甲醇/去离子水，从50克一批的脱脂可可中萃取矢车菊苷配质。合并提取物，采用保持部分真空的旋转蒸发器在45℃下通过蒸发除去溶剂。产生的水相用去离子水稀释至1升并用400mlCHCl3萃取2次。弃去溶剂相。然后用500ml乙酸乙酯萃取水相4次。通过在10℃下在Sorvall RC 28S离心机上以2,000×g离心30分钟及保持部分真空的旋转蒸发器打破任何产生的乳液。将产生的水相在液氮中冷冻，然后在LABCONCO冷冻干燥系统上进行冷冻干燥。得自不同可可基因型的粗矢车菊苷配质的产量列于表3。
表3
粗矢车菊苷配质产量 基因型 产地 产量(g) UIT-1 马来西亚 3.81 未知 西非 2.55 ICS-100 巴西 3.42 ICS-39 巴西 3.45 UF-613 巴西 2.98 EEG-48 巴西 3.15 UF-12 巴西 1.21 NA-33 巴西 2.23B．方法2
或者也可以用70％的丙酮水溶液从实施例1的脱脂未发酵的冷冻干燥可可豆提取矢车菊苷配质。用100ml溶剂将10克脱脂材料打浆5-10分钟。将浆液在4℃及3000×g下离心15分钟，将上清液通过玻璃棉。将滤液在部分真空下蒸馏，产生的水相在液氮中冷冻干燥，然后在LABCONCO冷冻干燥系统上冷冻干燥。粗矢车菊苷配质的产率为15-50％。
我们认为粗产率的差异反映出由于采用不同基因型、地理来源、园艺品种和制备方法而产生相应的变化。实施例13可可矢车菊苷配质的部分纯化
A．凝胶渗透色谱
通过在Sephadex LH-20(28×2.5cm)的液相色谱中将得自实施例12的矢车菊苷配质部分纯化。通过将去离子水加入甲醇中的分段梯度辅助分离。初始梯度组成以15％的甲醇去离子水溶液开始，接着以每30分钟分段，分别为25％的甲醇去离子水溶液、35％的甲醇去离子水溶液、70％的甲醇去离子水溶液和最终为100％的甲醇。收集接着黄嘌呤生物碱(咖啡碱和可可碱)洗脱液的流出液作为单独的馏分。该馏分为不含黄嘌呤生物碱的细馏份，将其进一步细分馏得到五个细馏份指定为MM2A至MM2E。采用保持在部分真空下的旋转蒸发器在45℃下通过蒸发将每一细馏份的溶剂除去。产生的水相在液氮中冷冻并在LABCONCO冷冻干燥系统上进行整夜冷冻干燥。图2表示显示所述分级的代表性的凝胶渗透色谱。在这种方式中细分馏为大约100mg的物质。色谱条件：柱；28×2.5cm Sephadex LH-20，流动相：甲醇/水分段梯度，每隔1/2小时分段为：15∶85,25∶75,35∶65,70∶30,100∶0，流速；1.5mL/min；检测器；紫外光，其中λ1=254nm和λ1=365nm，记录纸速：9.5mm/min，柱装载量；120mg。
B．半制备高效液体色谱(HPLC)
方法1．反相分离
通过半制备HPLC部分纯化得自实施例2和/或3A的矢车菊苷配质。配备有各种波长检测器、具有1mL注射回路的Rheodyne7010注射阀门的Hewlett Packard1050HPLC系统连接了Pharmacia FRAC-100馏分收集器。在连接了Phenomenex10μODS UltracarbTM(60×10mm)保护柱的Phenomenex UltracarbTM10μODS柱(250×22.5mm)中进行分离。流动相组成为A=水；B=甲醇，使用以下线性梯度条件：(时间，％A)；(0,85),(60,50),(90,0)和(110,0)，流速：5mL/min。采用在254nm的紫外光检测化合物。
在图15N中显示了用于分离存在于馏分D+E的矢车菊苷配质的代表性的半制备HPLC踪迹(trace)。通过馏分收集，每隔一段时间或手工收集独立峰或选择色谱区域以进一步纯化并接着进行蒸发。注射装载量为25-100mg物质。
方法2．正相分离
通过半制备HPLC部分纯化得自实施例2和/或3A的矢车菊苷配质萃取物。Hewlett Packard 1050 HPLC系统、Millipore-Waters 480LC型检测器(设置在254nm)连接了Pharmacia Frac-100馏分收集器(设置在峰模式)。在连接了Supelco 5μm Supelguard LC-Si保护柱(20×4.6mm)的Supelco 5μm Supelcosil LC-Si柱(250×10mm)中进行分离。使用以下线性梯度条件洗脱矢车菊苷配质：(时间，％A,％B)；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,46,50),(65,10,86)和(70,10,86)，接着进行10分钟的再平衡。流动相组成为A=二氯甲烷，B=甲烷和C=乙酸-水(1∶1)。使用3mL/min的流速。采用在254nm的紫外光检测成分并记录在Kipp & Zonan BD41记录仪中。注射体积为100-250μL的10mg矢车菊苷配质萃取物溶解在0.25mL70％丙酮水溶液中。图2显示代表性的半制备HPLC踪迹(trace)。通过馏分收集，每隔一段时间或手工收集独立峰或选择色谱区域以进一步纯化并接着进行评价。
HPLC条件：
250×10mm Supelco Supelcosil LC-Si(5m)半制备柱
20×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)保护柱
检测器：Waters LC
色谱光度计480型@254nm
流速：3mL/min
柱温：室温
注射体积：250μL的70％含水丙酮萃取物 梯度：时间(分) CH2Cl2 甲醇乙酸∶水(1∶1) 0 82 14 4 30 67.6 28.4 4 60 46 50 4 65 10 86 4 70 10 86 4
实施例14
HPLC纯化方法
方法A．GPC纯化
在Sephadex LH-20(72.5×2.5cm)的液相色谱中使用100％的甲醇作为洗脱溶剂，以流速3.5mL/min将在实施例12中得到的矢车菊苷配质部分纯化。经过第一个1.5小时后收集馏分的洗脱液并采用旋转蒸发器浓缩该馏分，将其重新溶解在水中并进行冷冻干燥。这些馏分是指五聚体富集的馏分。以这种方式大约2.00g的从实施例2中得到的萃取物得以细分馏。结果显示在表4中。
表4
所得部分的组合物 部分 (时间) 单体(％面积) 二聚体(％面积) 三聚体(％面积) 四聚体(％面积) 五聚体(％面积) 六聚体(％面积) 1∶15 73 8 16 3 ND ND 1∶44 67 19 10 3 1 tr 2∶13 30 29 24 11 4 1 2∶42 2 16 31 28 15 6 3∶11 1 12 17 25 22 13 3∶40 tr 18 13 18 20 15 4∶09 tr 6 8 17 21 19 部分 (时间) 七聚体 (％面积) 八聚体 (％面积) 九聚体 (％面积) 十聚体 (％面积) 十一聚体 (％面积 其它 (％面积 1∶15 ND ND ND ND ND ND 1∶44 tr tr tr tr tr tr 2∶13 1 tr tr tr tr tr 2∶42 2 tr tr tr tr tr 3∶11 7 1 tr tr tr tr 3∶40 10 2 2 tr tr tr 4∶09 14 4 4 2 tr tr
ND=未检测到
tr痕量
方法B．正相分离
通过Supelcosil LC-Si,100A,5μm(250×4.6mm)，流速1.0mL/min或者另外通过Lichrosphere0Silica 100,100_,5μm(235×3.2mm),流速0.5mL/min的正相色谱将在实施例12中得到的矢车菊苷配质进行分离和纯化。使用以下条件的分步梯度辅助分离：(时间，％A,％B)；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,10,86),(70,10,86)。流动相组成为A=二氯甲烷，B=甲醇和C=乙酸-水(1∶1)。采用荧光检测成分，其中λex=276nm和λem=316nm，和通过280nm的紫外光检测。注射体积为5.0μL(20mg/mL)得自实施例2的矢车菊苷配质。这些结果显示在图4A和4B中。
或者使用以下条件的分步梯度辅助分离：(时间，％A,％B)；(0,76,20),(25,46,50),(30,10,86)。流动相组成为A=二氯甲烷，B=甲醇和C=乙酸-水(1∶1)。这些结果显示在图4A和4B中。
方法C．反相分离
通过Hewlett Packard Hypersil ODS 5μm(200×2.1mm)和HewlettPackard Hypersil ODS 5μm保护柱(20×2.1mm)的反相色谱将在实施例12中的矢车菊苷配质进行分离和纯化。在20分钟内采用20％B-A的线性梯度洗脱所述矢车菊苷配质，接着在9.3mL/min的流速下采用100％的B进行柱洗。流动相组成为B=1.0％的乙酸甲醇溶液和A=2.0％的乙酸无泡水溶液的脱气混合物。采用在280nm的紫外光和荧光，其中λex=276nm和λem=316nm检测化合物；注射体积为2.0μL(20mg/mL)。
实施例15
五聚体富集馏分的HPLC分离
方法A．半制备正相HPLC
通过半制备正相HPLC进一步纯化所述五聚体富集的馏分，该半制备正相HPLC为装备了连接有Pharmacia Frac-100馏分收集器(设置在峰模式)的Millipore-waters480型LC检测器(设置在254nm)的Hewlett Packard 1050 HPLC系统。在连接了Supelco5 SupelguardLC-Si保护柱(20×4.6mm)的Supelco 5m Supelcosel LC-Si,100_柱(250×10mm)中进行分离。通过以下线性梯度条件洗脱矢车菊苷配质：[时间，％A,％B]；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,10,86),(70,10,86)，接着进行10分钟的再平衡。流动相组成为A=二氯甲烷，B=甲醇和C=乙酸-水(1∶1)。使用3mL/min的流速。采用在254nm的紫外光检测化合物并记录在Kipp & Zonan BD41记录仪中。注射体积为100-250μL的10mg矢车菊苷配质萃取物溶解在0.25mL70％含水丙酮中。通过收集馏分，每隔一段时间或手工收集独立峰或选择色谱区域以进一步纯化并接着进行评价。
HPLC条件：
250×10mm Supelco Supelcosil LC-Si(5m)半制备柱
20×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)保护柱
检测器：Waters LC
色谱光度计480型@254nm
流速：3mL/min
柱温：室温
注射体积：250μL的五聚体富集的萃取物 梯度 CH2Cl2 甲醇 乙酸∶水(1∶1) 0 62 14 4 30 67.6 28.4 4 60 46 50 4 65 10 86 4 70 10 86 4
方法B．反相分离
将在实施例15中得到的矢车菊苷配质萃取物通过0.45μ的尼龙过滤器过滤并采用装备了二极管阵列检测器和HP1046A型可编程荧光检测器的Hewlett Packard 1090三相HPLC系统分析。在45℃下通过Hewlett Packard 5μHypersil ODS柱(200×2.1mm)进行分离。采用60％的B-A线性梯度洗脱所述矢车菊苷配质，接着在0.3mL/min的流速下采用B进行柱洗。流动相组成为B=0.5％的乙酸甲醇溶液和A=0.5％的乙酸无泡水溶液的脱气混合物。在A和B流动相中的乙酸水平可增加至2％。采用荧光，其中λex=276nm和λem=316nm和在280nm的紫外光检测成分。参比标准溶液测定(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素的浓度。通过使用(-)-表儿茶素的相应因子估计矢车菊苷配质的水平。
方法C．正相分离
通过9.45μ的尼龙过滤器将在实施例15中得到的五聚体富集矢车菊苷配质萃取物过滤并采用装备了HP1046A型可编程荧光检测器和二极管阵列检测器的Hewlett Packard 1090系列ⅡHPLC系统进行分析。在连接了Supelco Supelguard LC-Si 5μ保护柱(20×4.6mm)的5μPhenomenex Lichrosphere0二氧化硅100柱(250×3.2mm)中进行分离。使用以下线性梯度条件洗脱矢车菊苷配质：(时间，％A,％B)；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,10,86)和(7,10,86)，接着进行8分钟的再平衡。流动相组成为A=二氯甲烷，B=甲醇和C=乙酸-水(体积比1∶1)。流速：0.5mL/min。采用荧光，其中λex=276nm和λem=316nm或在280nm紫外光检测成分。在图4中显示了一种基因型的对于各种矢车菊苷配质的分离的代表性HPLC色谱。从其它Theobroma、Herrania和/或其相互-或内-特定交叉种类中也能得到类似的HPLC曲线图。
HPLC条件：
250×3.2mm henomenex Lichrosphere0二氧化硅100
柱(5μ)20×4.6mm Supelco Supelguard LC-Si(5μ)
保护柱
检测器：光二极管阵列@280nm
荧光，其中λex=276nm和λem=316nm
流速：9.5mL/min
柱温：37℃ 梯度 CH2Cl2 甲醇 乙酸∶水(1∶1) 0 62 14 4 30 67.6 28.4 4 60 46 50 4 65 10 86 4 70 10 86 4
方法D．制备正相分离
采用Riguad等对制备正相色谱的修改方法(J.Chrom.654:255-260,1993)进一步纯化在实施例5中得到的五聚体富集的部分。
在室温下，在装备了适当的保护柱的5μSupelcosil LC-Si100_柱(50×2cm)中进行分离。使用以下线性梯度条件洗脱矢车菊苷配质：(时间，％A,％B,流速)；(0,92.5,7.5,10)，(10,92.5,7.5,40)，(30,91.5,18.5,40)，(145,88,22,40)，(150,24,86,40)，(155,24,86,50)和(180,0,100,50)。在使用前，采用以下方案对所述流动相组分进行混合：
溶剂A的制备(82％CH2Cl2,14％甲醇，2％乙酸，2％水)：
1．量取80mL水并装入在4L的瓶中。
2．量取80mL水并装入在同样的4L的瓶中。
3．量取560mL甲醇并装入在同样的4L的瓶中。
4．量取3280mL二氯甲烷并装入在同样的4L的瓶中。
5．盖上瓶子并混合均匀。
6．采用高纯度的氦冲洗所述混合物5-10分钟进行脱气。
重复步骤1-6两次得到8体积的溶剂A。
溶剂B的制备(96％甲醇，2％乙酸，2％水)：
1．量取80mL水并装入在4L的瓶中。
2．量取80mL乙酸并装入在同样的4L的瓶中。
3．量取3840mL甲醇并装入在同样的4L的瓶中。
4．盖上瓶子并混合均匀。
5．采用高纯度的氦冲洗所述混合物5-10分钟进行脱气。重复步骤1-5两次得到4体积的溶剂B。流动相组成为A=二氯甲烷-2％的乙酸-2％的水；B=甲醇-2％乙酸-2％的水。柱装载量为0.7g在7mL的溶液中。采用在254nm的紫外光检测成分。在图5中显示可可矢车菊苷配质一般的制备正相HPLC的分离。HPLC条件：柱：50×2cm5μSupercosil LC-Si在室温下运行。流动相：A=二氯甲烷-2％的乙酸-2％的水；
B=甲醇和2％乙酸-2％的水。
梯度/流动曲线 时间(分) ％A ％B 流速(mL/min) 0 92.5 7.5 10 10 92.5 7.5 40 30 91.5 8.5 40 145 88.0 22.0 40 150 24.0 86.0 40 155 24.0 86.0 50 180 0 100.0 50
实施例16
低聚物馏分的纯化
方法A．通过半制备反相HPLC纯化
将得自实施例15、方法A、B和D的矢车菊苷配质进一步分离得到试验量的低聚物。装备有可变波长的检测器、具有1mL注射回路的Rheodyne7010注射阀门的Hewlett Packard 1050 HPLC系统连接了Pharmacia FRAC-100馏分收集器。在连接了Phenomenex 10μODSUltracarb_(60×10mm)保护柱的Phenomenex Ultracarb_10μODS柱(250×22.5mm)中进行分离。流动相组成为A=水；B=甲醇，使用以下线性梯度条件：(时间，％A)；(0,85)，(60,50)，(90,0)和(110,0)，流速：5mL/min。通过馏分收集，每隔一段时间或手工收集独立峰或选择色谱区域以进一步通过MADLY-OF/MS和NKr进行评价。注射装载量范围为25-100mg物质。在图6A中显示了代表性的洗脱曲线。
方法B．修改的半制备HPLC
将得自实施例15、方法A、B和D的矢车菊苷配质进一步分离得到试验量的相似低聚物或进行进一步结构性鉴定和阐明(如实施例15、18、19和20)。Supelcosil LC-Si5μ柱(250×10mm)与Supelcosil LC-Si5μ保护柱(20×2mm)连接。在室温下，以3.0mL/min的流速进行分离。流动相组成为A=二氯甲烷，B=甲醇和C=乙酸-水(1∶1)。使用以下线性梯度条件：(时间，％A,％B)；(0,82,14)，(22,74,21)，(60,74,21)，(60,74,50,4)和(6l,82,14)，接着柱再平衡7分钟。注射体积为60μL含有12mg的富集五聚体。采用在280nm的紫外光检测成分。在图6B中显示了代表性的洗脱曲线。
实施例17
氧化氮合酶活性的评估
使用的Medium200的培养介质(Cascade Biologics Inc.)补充了Low Serum Growth Supplement(Cascade Biologics Inc.)和20％的胎牛血清(DAP)。
进行评估的可可矢车菊苷配质为表儿茶素单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和七聚体。对可可矢车菊苷配质的亚硝酸盐的含量进行评估。在使用最大浓度时(100μg/mL)，没有检测到亚硝酸比。
人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC)在原代培养阶段，购自CascadeBiologics Inc.(波兰)。细胞在75cm2的瓶中补充了Low Serum GrowthSupplement(LSGS)和20％的胎牛血清(FCS)的介质中培养。所述细胞经过一周的成熟后接着在37℃及5％二氧化碳气氛下采用牛胰岛素-EDTA处理(2mL/瓶)。添加3mLFCS米中和牛胰岛素。
在1200转/分下将细胞悬浮液离心10分钟并将细胞颗粒再次悬浮在上述的培养介质中。
通过测量在所述培养介质中的亚硝酸盐浓度来评估氧化氮合酶的活性。使用第2至13代之间的HUVEC。在24格培养板中，在浓度为5×105细胞mL的含有LSGS(300μL/格)和20％CS的Medium200中培养细胞。在37℃及5％二氧化碳气氛下经过24小时至48小时的诱导期，将所述细胞集中使用(2.5×106细胞)。弃去介质并加入新鲜的介质。
将可可矢车菊苷配质单体和低聚物以100μg/mL、10μg/mL或1μg/mL(最终浓度)加入所述培养介质中。对照物含有培养的细胞但不含矢车菊苷配质。参比物包括乙酰胆碱、离子霉素、(以进入的钙作为NO合酶刺激物)、脂糖(NO合酶诱导物)和N-甲基-L-精氨酸乙酯(NO合酶的抑制剂)。使用这些参比物是为了证实在内皮NO合成的亚硝酸盐的生产。
根据Griess反应，通过测量培养介质上清液中的亚硝酸盐(NO2)浓度来评估NO的生产。简而言之，在室温下将50μL的条件介质(conditional medium)采用150μL的Griess试剂(1％磺胺的30％乙酸溶液-0.1％N-(1-萘基)-乙二胺二氢氯化物的60％的乙酸溶液)温育2mins。采用Labsystems MCC/340 Multiskan测定在540nm的吸光度。使用亚硝酸钠作为标准物测定亚硝酸盐的浓度并使用Δsoft2.12软件进行分析。所述无细胞介质和100μg/mL的矢车菊苷配质没有检测到的亚硝酸盐浓度。
原始数据1：显示可可矢车菊苷配质在通过HUVEC的氧化氮生产中的 作用
(13个试验)
处理 试验1 试验2 试验3 平均μ SD 对照物 2.6 2.9 2.4 2.6 0.3 乙酰胆碱10-5M 2.5 2.6 2.8 2.6 0.2 离子霉素1μm 7.8 6.3 5.4 6.5 1.2离子霉素1μm+LNMA1μm 1.8 1.9 2 1.9 0.1 LPS 100mg/mL 15.6 14.3 13.2 14.4 1.2 LPS 100mg/mL+LNMA 1μm 2.2 2.3 2.6 2.4 0.2 单体 1μg/mL 10μg/mL 100μg/mL 2.3 2.7 5.4 2.5 2.8 5.9 2.6 2.6 5.7 2.5 2.7 5.7 0.2 0.1 0.3 二聚体 1μg/mL 10μg/mL 100μg/mL 2.5 3.8 15.1 2.7 4.1 16.4 2.8 3.6 17.2 2.7 3.8 16.2 0.2 0.3 0.1 三聚体 1μg/mL 10μg/mL 100μg/mL 3.1 2.9 11.5 3.3 3.3 11.8 3.1 2.7 11.9 3.2 3.0 11.7 0.1 0.3 0.2 四聚体 1μg/mL 10μg/mL 100μg/mL 3 3.6 8.9 3.2 3.7 9.3 3.3 4.1 9.2 3.2 3.8 9.1 0.2 0.3 0.2 五聚体 1μg/mL 10μg/mL 100μg/mL 1.3 2.9 8.8 1.4 3.4 9.5 1.3 3 9.7 1.3 3.1 9.3 0.1 0.3 0.5 六聚体 1μg/mL 10μg/mL 100μg/mL 2.1 4.8 9.1 2.4 5.6 10.4 2.4 4.3 9.5 2.2 4.9 9.7 0.2 0.7 0.71结果表示为微摩尔亚硝酸盐/106细胞/48小时
在48小时的诱导期中未刺激的HUVEC生产2.6±0.3μm的NO。10μm的乙酰胆碱在通过HUVEC促进氧化氮生产中没有作用。相反，离子霉素(1μm)和脂糖(100ng/mL)引起明显的氧化氮生产。当往培育介质中加入N-甲基-L-精氨酸时这些通过HUVEC的氧化氮的生产将受到抑制。
所述可可矢车菊苷配质二聚体、五聚体和七聚体引发了从HUVEC的剂量相依性的NO的生产。在最高浓度的试验中(即100μg/mL)观察到最大的产量。所述矢车菊苷配质单体、三聚体和四聚体也同样引起明显的生产但只是在100μg/mL的浓度产生。考虑到使用的最高剂量，各种矢车菊苷配质的效力如下：二聚体＞三聚体＞七聚体=五聚体=四聚体＞单体。
实施例18
豚鼠上的氧化氮相依性的高血压
将豚鼠(体重大约400g，雄性和雌性)注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉。在其颈动脉上挖一小洞以通过Gould压力传感器(P500型)监控动脉血压。六个可可矢车菊苷配质中的每一个以浓度为1、3、10和25mg/kg通过颈静脉进行静脉注射。或者将血压记录在多种描记器中。
在初步试验中(2种动物)，我们测定不能使用100mg/kg的剂量，因为含有赋形剂的DMSO将直接影响平均动脉血压。而当使用25mg/kg剂量的可可矢车菊苷配质(15±5％)时没有注意到明显的含有赋形剂的DMSO的作用。
观察供给1、3、10或25mg/kg的可可矢车菊苷配质对于麻醉的豚鼠的动脉血压的作用。在静脉注射中，矢车菊苷配质单体和二聚体降低了大约20％的血压，即与单独注射溶剂(15±5％,n=5)没有明显区别。相反，可可矢车菊苷配质三聚体、五聚体和六聚体(10mg/kg)明显地促进了动脉血压的降低，即对于可可矢车菊苷配质、四聚体和六聚体至多为62.85％。考虑到使用的最高剂量，各种矢车菊苷配质的效力如下：六聚体=四聚体＞五聚体＞三聚体。
表 5
原始数据：可可萃取物对麻醉豚鼠的动脉血压的作用
(6个试验)矢车菊苷配质剂量 高血压(％)1Mg／kg试验1试验2试验3试验4试验5试验6 单体 1 3 10 25 55.32 62.99 58.95 46.93 70.31 72.62 66.53 55.14 70.27 74.59 70.06 63．08 75.99 73.33 65.79 53.95 71.92 76.04 70.69 65.91 77.97 70.44 66.21 58.66 二聚体 1 3 10 25 74.47 77.64 90.76 88.14 90.15 86.29 94.3 95.33 92.14 95.29 99.59 106.6 89.74 91.74 90.59 88.02 96.83 100.6 106.7 110.6 94.13 87.08 97.24 94.02 三聚体 1 3 10 25 75.93 94.99 74.34 12.27 71.61 100 72.38 60.42 74.18 95.05 73.26 12.31 74.05 100.7 78.94 11.6 76.46 92.47 80 12.23 73.23 104.8 70.37 12.56 四聚体 1 3 10 25 96.86 101.2 96.53 21.7 89.19 95.14 0.95 3.45 80.31 102.1 7.75 9.61 82.47 99.15 12.75 15.21 77.64 104.9 7.53 9.07 109.9 93.26 102.8 20.83 五聚体 1 3 10 25 8341 79.85 87.72 59.8 82.57 80.33 83.56 21.13 80.81 81.47 82.49 29.94 81.57 73.75 75 21.82 77.55 74.18 79.81 20.27 83.05 83.43 89.35 30.5 六聚体 1 3 10 25 90.24 74.15 68.8 25.27 64.23 81.18 85.41 11.2 93.97 83.55 69.49 19.34 95.97 80.73 68.04 26.15 86.35 69.14 70.85 25.09 94.68 71.97 71.47 26.6
1结果以对照平均动脉血压％表示。
体外和体内结果的对比结果显示出具有以下的可可矢车菊苷配质效力：
NO生产(100μg/mL)：二聚体＞三聚体＞六聚体=五聚体=四聚体＞单体
NO生产(10μg/mL)：五聚体、四聚体和二聚体(不良诱导)
高血压：六聚体=四聚体＞五聚体＞三聚体＞二聚体=单体。
除了二聚体外，在更低剂量时促使NO生产的七聚体或四聚体对于降低动脉血压是最有效的。这些结果表明可可矢车菊苷配质可在体外及体内促使NO生产。
实施例19
将得自新西兰白兔的主动脉环放在20mL的有机浴中。对于单剂量的(10-5M)可可矢车菊苷配质和乙酰胆碱(Ach)内皮相依性舒张(EDR)采用预感染(pre-contracted)可可矢车菊苷配质的降肾上腺素(NE)(10-5M)的平行环进行说明。试验的可可矢车菊苷配质为单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体。其中只有五聚体、六聚体和七聚体表现出血管舒张活性。对于试验的两种可可矢车菊苷配质混合物，只有含有五聚体至十聚体(结合物2)的一种显示出明显的EDR，而另一种含有单体至四聚体混合物(结合物1)对于血管紧张没有作用。
随后使用结合物2和五聚体证明剂量相依性的血管舒张(10-8至10-5M)。将环与这些可可矢车菊苷配质(10-5M)一起培育30’并再次与Ach和可可矢车菊苷配质(10-7至10-4M)一起试验。可可矢车菊苷配质和Ach剧烈地引起所述组织与这些可可矢车菊苷配质的培育对EDR的削弱。对于Ach预培育后的最大舒张为49±5％；对五聚体培育后为2±1.4％；对结合物2培育后为0.8±0.8％；对五聚体预培育为46.5±4.5％；培育后为6.8±3.2％；对于结合物2预培育为54.3±7％；培育后为1.7±1.1％,n=5。
与两种可可矢车菊苷配质(即废弃的EDR)一起培育的作用通过将所述组织与L-精氨酸(10-4M)培育30’部分恢复(最大舒张，对于Ach：L-精氨酸培育后为21.5±6％；经过结合物2，L-精氨酸培育后为13.7±2.6％；对于五聚体：经过五聚体、L-精氨酸培育后为18.3±5.8％；对于结合物2：经过结合物2、L-精氨酸培育后为5.5±2.8％,n=5)。这些结果表明对于NO合酶的酶作用物的损耗也应考虑在这个作用中。
以上结果显示在表6至9中。
表6
可可矢车菊苷配质在兔主动脉环的作用的初始试验 Ach 单体二聚体三聚体四聚体％舒张 68 0 0 0 40五聚体六聚体七聚体单体-四聚体五聚体-十聚体％舒张 93 68 47 0 55
表7
对可可矢车菊苷配质的激烈暴露引起的剂量反应 Ach ％舒张 五聚体 ％舒张 剂量(Log mo/L) 10-7 10-6 10-5 10-7 10-6 10-5 ％舒张 15.2±2.6 42.2±4.2 49±5.1 1.85±0.2 8.3±2.5 46.5±4.5 单体- 四聚体 ％舒张 五聚体- 十聚体 ％舒张 剂量(Log mol/L) 10-7 10-6 10-5 10-7 10-6 10-5 ％舒张 0 1.4±0.6 25.5±8.2 54.3±7
表8
与可可矢车菊苷配质和L-精氨酸培育的作用Ach％舒张剂量(Logmol/L)10-810-710-610-5五聚体002.1±1.40五聚体和L-精氨酸0.53±0.54.5±1.014.4±5.821.5±5.7五聚体％舒张剂量(Logmol/L)10-810-710-610-5五聚体0006.8±3五聚体和L-精氨酸00.8±0.85.6±2.518.3±5.7
表9Ach％舒张剂量(Log mol/L)10-810-710-610-5五聚体-十聚体00.43±0.40.83±0.80五聚体-十聚体和L-精氨酸3.6±0.86.4±1.211.3±2.413.7±2.6五聚体％舒张剂量(Log mol/L)10-810-710-610-5五聚体-十聚体000.58±0.581.7±1.1五聚体-十聚体和L-精氨酸01.4±1.43.4±1.95.5±2.8
以上的发现说明只有三聚体以上的可可矢车菊苷配质具有引起血管舒张的能力并且可可矢车菊苷配质具有对于血管紧张不连续的作用，这不象是与其抗氧活性有关。
其它对于本领域的技术人员来说明显的改变和修改是在本发明的范围和所指之内的。除了在以下的权利要求书中所阐述的那些之外，本发明不受限制。