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本发明提供一了种人跨膜型TNF-α单克隆抗体，本发明用传统的单克隆抗体制备方法筛选并建立了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体杂交瘤细胞株。用分子克隆技术从杂交瘤细胞株中获取目的抗体的基因序列，用以构建原核或真核表达载体。本发明利用杂交瘤细胞表达抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体，利用真核细胞表达抗人跨膜型TNF-α人-鼠嵌合抗体，利用原核表达抗人跨膜型TNF-α单链抗体，以利于进行药物或毒素的偶联，用于抗肿瘤治疗。

1.  一种可特异性结合人跨膜型TNF-α的鼠单克隆抗体的可变区序列，其中：1)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰而获得的保守型变异体；2)轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰而获得的保守型变异体。

2.  编码权利要求1所述的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体可变区的DNA序列，其具有如SEQ ID NO：3所示的重链可变区核苷酸序列或其简并性序列；和/或具有如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区核苷酸序列或其简并性序列。

3.  一种杂交瘤，其产生根据权利要求1和2的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体。

4.  一种由权利要求1和2所述的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体的生物学特征是不但与完整的跨膜型TNF-α分子结合，且与其酶切释放分泌型TNF-α后，尚存在于膜上的N端残留片段结合；不与可溶性TNF-α结合。

5.  一种嵌合抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体，其中将根据权利要求1和2的抗跨膜型TNF-α单克隆抗体可变区的氨基酸序列与人免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列融合。

6.  一种抗人跨膜型TNF-α单链抗体，其中将根据权利要求1和2的抗跨膜型TNF-α单克隆抗体重链可变区和轻链可变区氨基酸序列用linker连接起来。

7.  一种基因工程抗体，其包含由权利要求1和2所述的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体可变区序列中重链可变区部分或其保守型变异体，和／或轻链可变区部分的氨基酸序列或其保守型变异体。

8.  一种哺乳动物细胞，其转入编码根据权利要求1和2，5至7抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体氨基酸序列的碱基序列。

9.  根据权利要求8的哺乳动物细胞，其为CHO细胞。

10.  一种诊断或检测剂，其包含根据权利要求1和2,5至7任一项的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体作为有效成分。

11.  一种治疗剂，其包含根据权利要求1和2,5至7任一项的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体作为有效成分。

12.  一种疫苗，其包含根据权利要求1和2,5至7任一项的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体作为有效成分或佐剂。

13.  一种过继细胞，其转入根据权利要求1和2,5至7任一项的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体 基因序列作为识别分子或效应分子的。

14.  权利要求1和2所述的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体及其基因工程抗体或其保留特异结合人跨膜型TNF-α能力的片段用于治疗靶向治疗肿瘤，或作为转基因用于免疫细胞过继治疗、化疗增敏治疗以及抑制肿瘤转移等用途。

人跨膜型TNF-α单克隆抗体及其临床应用
技术领域
本发明属于生物技术与生物药物领域，涉及发明一种针对人跨膜型肿瘤坏死因子-α（transmembrane tumor necrosis factor-α,tmTNF-α）的单克隆抗体，进一步涉及发明其基因工程抗体，包括嵌合抗体和单链抗体，以及包含这些抗体中任一种作为活性成分用于肿瘤的诊断剂与治疗剂。 
背景技术
恶性肿瘤已成为危害人类健康的主要疾病，由于传统手术、化疗和放疗的疗效不尽人意，生物治疗作为第4种治疗手段，在肿瘤综合治疗中发挥着越来越大的作用。抗体作为治疗性药物已有上百年的历史。早期主要用抗血清进行抗感染治疗。由于其成分太复杂、多变，而且是异源蛋白，在治疗时会出现严重副作用。1975年单克隆抗体技术问世以来，已有多种针对肿瘤标记的单抗用于靶向性治疗肿瘤，并取得很好的疗效。例如Rituximab于1997年批准用于治疗非霍奇金性淋巴瘤，显著提高了弥漫大B型淋巴瘤的临床治愈率^[1-2]。单克隆抗体是近年来年增长率最大的一蛋白类药物，2001年全球销售额增长了57.3%，接近30亿美元。从抗体药物的发展速度来看，目前它已成为生物技术药物中最重要的一大类，也是世界生物工程制药业的支柱产品之一。 
肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)具有两种形式：跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α,tmTNF-α)和分泌型TNF-α(secretory TNF-α,sTNF-α)。定位于细胞膜上的tmTNF-α，在TNF-α转换酶(tumor necrosis factor-alpha converting enzyme,TACE)的作用下，可使其胞外段脱落，成为sTNF-α。尽管TNF-α对部分肿瘤具有杀伤作用，但大量研究证实在许多实体肿瘤中，如乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、肾癌、黑色素瘤，淋巴瘤等sTNF-α分泌明显增加^[3-5]，而肿瘤微环境中的sTNF-α则可促进肿瘤生长、新生血管形成和转移^[6-7]，因此，sTNF-α作为促炎细胞因子被认为是慢性炎症恶变的重要桥梁分子之一。故以TNF-α为靶点，将抗TNF抗体用于治疗实体瘤被批准进入I期和II期临床试验，以治疗肾癌、转移性乳腺癌、以及进展性癌症等，虽然部分患者受益于抗体治疗^[8-10]，但是，血清sTNF-α增高患者常是抗体治疗无应答者^[9]。这可能与当前上市抗体既可与sTNF-α结合，又可与tmTNF-α结合有关，因为血清sTNF-α可中和部分抗体，使之到达肿瘤部位的有效剂量减小；此外，肿瘤细胞tmTNF-α被剪切成sTNF-α，丧失肿瘤标记物也是患者 对抗体不应答的重要原因。 
近几年来，我们对若干不同的肿瘤标本进行检测，证实：（1）tmTNF-α为多种肿瘤的表面标记物：乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、胃癌、急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤等均有部分病例高表达tmTNF-α，但是癌旁组织则不表达;（2）tmTNF-α可能是肿瘤干细胞的标记物：我们初步实验证实不但部分白血病患者（如急性髓样白血病，AML）的肿瘤细胞高表达tmTNF-α，而且其白血病干细胞也同样高表达tmTNF-α，但正常外周血细胞低表达tmTNF-α（<10%）。（3）tmTNF-α明显促进肿瘤生长、转移及抵抗凋亡：我们的实验证实高表达tmTNF-α的乳腺癌细胞和Β淋巴瘤细胞均可通过该膜分子的反向信号，持续性活化NF-κB，导致肿瘤细胞抵抗sTNF-α^[11-12]和化疗药物阿霉素等诱导的凋亡，促进肿瘤生长和转移。上述实验证据提示tmTNF-α不但可作为肿瘤标记物，其本身还可促进肿瘤的生长和发展，因而是理想的肿瘤靶向治疗的分子靶点。制备以TNF-α膜分子为靶点，且不与分泌型TNF-α发生交叉反应的单克隆抗体，对于治疗tmTNF-α阳性肿瘤更为有效，且可能适用于那些对现上市抗体无应答肿瘤患者的治疗。[参考文献： 
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2.Hochster H,Weller E,Gascoyne RD,et al.Maintenance rituximab after cyclophosphamide,vincristine,and prednisone prolongs progression-free survival in advanced indolent lymphoma:results of the randomized phase III ECOG1496Study.J Clin Oncol.2009;27:1540-2； 
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发明内容：
本发明的任务是提供一种人跨膜型TNF-α单克隆抗体。本发明用传统的单克隆抗体制备方法筛选并建立了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体杂交瘤细胞株。用分子克隆技术从杂交瘤细胞株中获取目的抗体的基因序列，用以构建原核或真核表达载体。本发明利用杂交瘤细胞表达抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体，利用真核细胞表达抗人跨膜型TNF-α人-鼠嵌合抗体，利用原核表达抗人跨膜型TNF-α单链抗体，以利于进行药物或毒素的偶联，用于抗肿瘤治疗。 
实现本发明的技术方案是： 
本发明提供的可特异性结合人跨膜型TNF-α的鼠单克隆抗体的可变区序列，其中：1)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：l所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰而获得的保守型变异体；2)轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰而获得的保守型变异体。编码所述的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体可变区的DNA序列，其具有如SEQ ID NO：3所示的重链可变区核苷酸序列或其简并性序列；和/或具有如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区核苷酸序列或其简并性序列。 
本发明还提供了产生上述抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体的杂交瘤。 
本发明所述的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体的生物学特征是不但与完整的跨膜型TNF-α分子结合，且与其酶切释放分泌型TNF-α后，尚存在于膜上的N端残留片段结合；不与可溶性TNF-α结合。 
本发明具体提供以下内容： 
（1）本发明公开了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：l和轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2。 
（2）本发明公开了编码抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体重链可变区核苷酸序列SEQ ID NO：3和轻链可变区核苷酸序列SEQ ID NO：4。 
（3）本发明公开了抗人跨膜型TNF-α人-鼠嵌合抗体，及其表达载体和表达真核细胞。 
（4）本发明公开了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体的单链抗体，及其表达载体。 
（5）本发明公开了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体的生物学特征，既可与完整跨膜型TNF-α结合，又可与酶切释放分泌型TNF-α后残留在膜上TNF的N片段结合；且不与分泌型TNF-α发生交叉反应。 
（6）本发明公开了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体的各种检测方法的应用。 
（7）本发明公开了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体检测不同肿瘤对跨膜型TNF-α作为肿瘤标记物的应用。 
（8）本发明公开了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体在体外对表达跨膜型TNF-α肿瘤细胞的补体介导的胞毒效应和抗体依赖的细胞介导的胞毒效应。 
（9）本发明公开了抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体在体内（动物模型）的抗肿瘤效应。 
上述定义的抗人跨膜型TNF-α单克隆抗体氨基酸序列中的氨基酸可用其他氨基酸置换，只要其二级结构和生物学性质没有显著改变，这些如上所述将氨基酸序列改变的单克隆抗体同样在本发明的范围之内。 
附图说明
图1tmTNF-αmAb经纯化后SDS-PAGE电泳图谱，轻重链两条清晰条带，无杂带 
图2ELISA法测定纯化后tmTNF-α单克隆抗体的效价 
图3tmTNF-αmAb与TMTP20结合的反应曲线，由此测得单克隆抗体TM-TNF-αmAb与TMTP20肽结合的亲和常数为1.00×10⁹mol/L 
图4tmTNF-α单克隆抗体特异性（图4a））与sTNF-α交叉反应性检测(图4b) 
图5Western blot验证tmTNF-αmAb只选择性与tmTNF-α，而不与sTNF-α结合 
图6流式细胞术检测tmTNF-α单克隆抗体的特异性 
A：tmTNF-α单克隆抗体检测到shRNA下调MDA-MD-231细胞tmTNF-α的表达 
B：tmTNF-α单克隆抗体检测到MCF-7细胞表面有转染的野生型tmTNF-α或NTF片段的表达 
图7共聚焦显微镜检测tmTNF-α单克隆抗体的特异性 
A：tmTNF-α单克隆抗体检测到shRNA下调MDA-MD-231细胞tmTNF-α的表达 
B：tmTNF-α单克隆抗体检测到MCF-7细胞表面有转染的野生型tmTNF-α或NTF片段的表达 
图8双抗夹心法ELISA检测tmTNF-α的表达，以本发明tmTNF-αmAb为基础建立双抗夹心法ELISA检测tmTNF-α 
A：流式细胞术检测PHA刺激Jurkat细胞表达tmTNF-α 
B：ELISA检测PHA刺激Jurkat细胞表达tmTNF-α 
图9用tmTNF-αmAb进行直接荧光和间接荧光检测 
A：直接免疫荧光法显示MDA-MD-231细胞表达tmTNF-α 
B：间接免疫荧光法显示TNF-α的NTF片段在COS-7细胞中的表达 
图10tmTNF-αmAb用于进行免疫共沉淀，成功钓取tmTNF-α反向信号转导复合物 
图11tmTNF-αmAb用于免疫组化法，检测6种肿瘤组织tmTNF-α的表达，发现均有高表达tmTNF-α的病例，*淋巴瘤没有癌旁组织，用同型抗体作为一抗，作为阴性对照 
图12tmTNF-α在不同病变及正常乳腺组织的表达，Normal：正常乳腺上皮；Hyperplasia：乳腺单纯性增生；Atypical dysplasia：不典型增生；primary breast cancer：原位乳腺癌 
图13tmTNF-αmAb对表达tmTNF-α乳腺癌细胞的ADCC和CDC杀伤效应 
A．tmTNF-αmAb发挥ADCC效应的剂量依赖性 
B．tmTNF-αmAb对表达tmTNF-α乳腺癌细胞的ADCC效应 
C．tmTNF-αmAb发挥CDC效应的剂量依赖性 
D．tmTNF-αmAb对表达tmTNF-α乳腺癌细胞的CDC效应 
E．tmTNF-αmAb对转染和表达tmTNF-α及其NTF片段的MCF-7乳腺癌细胞的ADCC效应 
F．tmTNF-αmAb对转染和表达tmTNF-α及其NTF片段的MCF-7乳腺癌细胞的CDC效应 
图14tmTNF-αmAb抑制裸鼠MDA-MD-231乳腺癌生长 
A.tmTNF-αmAb对裸鼠乳腺癌生长曲线的影响 
B.tmTNF-αmAb抑制裸鼠乳腺癌体积 
C.tmTNF-αmAb对裸鼠乳腺癌的抑制率 
图15tmTNF-αmAb抑制乳腺癌血道和淋巴道转移 
A.tmTNF-αmAb抑制乳腺癌血管和淋巴管肿瘤栓数目 
B.tmTNF-αmAb抑制乳腺癌淋巴结转移 
C.tmTNF-αmAb抑制转移相关分子CD44v6的表达 
具体实施方式
以下实施例仅仅对本发明作进一步的说明，并非用于限制本发明的保护范围。 
实施例1：针对TM-TNF-α单克隆抗体的制备 
1.抗原肽预测 
以tmTNF-α全长为模板，用哈佛大学分子免疫基金会在线提供的抗原肽预测软件（http://mif.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl）对其全长进行分析。tmTNF-α全长共有8个表位，其中2个表位位于细胞内，5个表位位于sTNF-α序列中，只有1个表位位于细胞外，且仅有3个氨基酸与sTNF-α序列重叠。本发明去掉与sTNF-α序列重叠的氨基酸，选择该肽段作为免疫原，并命名为TMTP20。 
2.抗原肽的合成及TMTP20与载体蛋白偶联后的纯化 
西安美联科技有限公司合成该肽段，纯化并经过质谱分析和高压液相色谱图显示合成物纯化后纯度达到了95%以上。将TMTP20偶联马来酰亚胺活化的载体蛋白——匙孔蝛血蓝蛋白（key hole limpet hemocyanin，KLH）或牛血清白蛋白(BSA)，多肽-KLH偶联复合物用于免疫BALB/c小鼠，多肽-BSA偶联复合物用于检测。经凝胶柱洗脱后，偶联蛋白洗脱曲线成单峰，且峰形较窄，蛋白浓度最高达3.71mg/ml。 
3.单克隆抗体的制备和纯化 
按常规方法，用多肽-KLH偶联复合物免疫BALB/c小鼠（由中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司提供）4次，在最终免疫三天之后，提取小鼠脾细胞，用PEG4000融合脾细胞和SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞,用HTA进行筛选。通过有限稀释法进行克隆，用特异性ELISA进行分泌特异性抗体克隆的筛选。按常规方法制备腹水，经硫酸铵沉淀后，用蛋白G柱进一步纯化。经SDS-PAGE鉴定纯化抗体，其纯度约为95%(图1)。 
4.tmTNF-α单克隆抗体的基本性质鉴定 
4.1tmTNF-α单克隆抗体效价的测定：用ELISA方法对纯化的tmTNF-α单克隆抗体效价进行测定，其效价达1:12800（图2）。 
4.2tmTNF-α单克隆抗体的类别与亚类的鉴定：用ELISA方法对tmTNF-α单克隆抗体Ig类及亚类鉴定（小鼠免疫球蛋白类型检测试剂盒购自Invitrogen)，显示tmTNF mAb为IgG1（κ型）。 
4.3tmTNF-α单克隆抗体亲和常数的测定:以Beatty等建立的非竞争酶免疫法（Beatty JD,et al.J Immunol Methods1987;100:173-9）测定tmTNF-α单克隆抗体的亲和常数，该单抗与TMTP20结合的亲和常数为1.00×10⁹mol/L（图3）。 
4.4tmTNF-α单克隆抗体特异性鉴定： 
4.4.1ELISA（竞争法）检测特异性： 
分别用200μg特异性抗原肽或无关肽（乙酰胆碱受体97-166）(溶于pH9.6,0.05M碳酸盐缓冲液）包被ELISA板4℃过夜，每孔加入1%BSA的PBS200μl，37℃湿盒静置1h;用不同浓度的TMTP20-BSA复合物或不同浓度的sTNF-α与tmTNF-α单克隆抗体在4℃孵育30min，再加入ELISA板中，100μl/孔，37℃湿盒孵育1h;用含0.05％Tween-20的PBS洗板5次，每孔加入100μl HRP偶联的抗小鼠免疫球蛋白抗体，37℃湿盒孵育1h;再洗板5次后，加入底物TMB显色，用ELISA读数仪（Bio-Rad,Richmond CA,USA）在波长492nm下检测吸光度。 
结果证实tmTNF-α单克隆抗体只能与特异性抗原肽结合，而且这种特异性结合可被TMTP20-BSA复合物完全竞争性抑制（图4A），而sTNF-α则毫无竞争性影响(图4B)。此外，tmTNF-α单克隆抗体也不能与BSA和IL-2、IFN-γ等细胞因子发生交叉反应。 
4.4.2免疫印迹试验检测tmTNF-α单克隆抗体的特异性： 
在5x10⁶Raji细胞中加入含有蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem,San Diego,CA)的细胞裂解液（50mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl,5M EDTA,1%Nonidet P-40），冰上孵育15min.离心后取上清（细胞总蛋白），与原核表达并纯化的sTmNF-α蛋白一起进行蛋白定量。20μg样品在12%SDS-PAGE凝胶中电泳，并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶0.05%Tween-20的PBS4°C封闭过夜后，将膜分别用1:100稀释的鼠抗人sTNF-α单克隆抗体和tmTNF-α单克隆抗体孵育2h,洗膜后，再与HRP标记的二抗（抗鼠IgG抗体）孵育1h；用化学发光法ECL（NENTM LIFE Science，Boston,MA,USA)检测抗体反应。 
结果如图5，抗sTNF-α的单克隆抗体既与sTNF-α结合,也与tmTNF-α结合，而tmTNF-α单抗则只能特异性识别26kD的tmTNF-α，而不识别17kD的sTNF-α，提示该单克隆抗体仅特异性识别 tmTNF-α。 
4.4.3流式细胞术检测tmTNF-α单克隆抗体的特异性： 
将高表达tmTNF-α的乳腺癌细胞株MDA-MD-231稳转TNF特异性shRNA，将不表达tmTNF-α的乳腺癌细胞株MCF-7稳转tmTNF-α酶切后残留的N片段（NTF）或野生型tmTNF-α。再将这些细胞用胰蛋白酶-EDTA解粘附，悬浮于含有1%BSA和0.1%叠氮钠的PBS中（5x10⁵/ml），加入tmTNF-α单克隆抗体（稀释度1:100）或同型抗体（阴性对照），在冰上孵育1h,用PBS洗后，加入FITC标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体（稀释度1:1000）(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，在冰上孵育1h,用PBS洗涤3次，重悬细胞于500μl1%磷酸多聚甲醛缓冲液中；上流式细胞仪（FACSCalibur440E，Becton Dickinson,San Jose,CA)检测，用Cell Quest软件(BD Biosciences-Immunocytometry Systems)分析这些细胞株tmTNF-α的表达。 
结果证实转染shRNA可下调MDA-MD-231细胞的tmTNF-α表达，而转染野生型tmTNF-α，则使MCF细胞转变为tmTNF-α阳性细胞；此外，tmTNF-α单克隆抗体不但能与野生型tmTNF-α结合，而且还能与转染NTF的MCF-7细胞表面的TNF N端残留片段结合（图6）。 
4.4.4共聚焦显微镜观察tmTNF-α单克隆抗体的特异性： 
用tmTNF-α单克隆抗体对上述稳转细胞株进行共聚焦显微镜检测，即将1x10⁵稳转细胞接种至含有盖玻片的12孔培养板中，培养过夜。用PBS洗2次后，加入5%脱脂牛奶PBS在室温下封闭1h。加tmTNF mAb于玻片上，在4℃过夜。用PBS洗后，加入PE标记的抗小鼠IgG抗体，孵育1h。在共聚焦显微镜FU5000(Olympus,Japan)下观察并拍照。 
结果与上述流逝细胞术结果相似，即稳转shRNA使MDA-MD-231细胞膜着色变弱，而稳转野生型tmTNF-α或NTF，则使原本荧光着色阴性的MCF-7细胞变为强阳性细胞（图7）。 
实施例2：tmTNF-α单克隆抗体可变区核苷酸序列及氨基酸序列的鉴定 
1.cDNA的制备 
收集2x10⁶个单克隆杂交瘤细胞，用Invitrogen公司的Trizol试剂提取细胞的总RNA，并以之为模板，用Fermentas公司的逆转录试剂盒反转录出cDNA第一链，以上步骤按照厂家提供的说明书进行。 
2.PCR扩增 
参照国内外已发表的鼠抗体基因家族序列中V区先导肽段和FR4较保守的区段序列设计并合成了鼠抗体VH基因、VL基因5’端（forward）和3’端(reverse)的上下游简并引物，且引入了适当的限制性酶切位点。引物序列如下列： 
VH forward primer(含Sal I酶切位点) 
5’-GGGGTCGACCTCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3’ 
VH reverse primer(含Not I酶切位点) 
5’-GGCCTGCGGCCGCAGTAGAGCAGACTCACCTGMGGAGACRGTGACC-3’ 
VL forward primer(含Sal I酶切位点) 
5’-GGGGTCGACCTCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3’ 
VL reverse primer(含Not I酶切位点) 
5’-GGCCTGCGGCCGCTTTAAATTCTACTCACGTTTKATTTCCAGCTTGGT-3’ 
引物均委托上海生工公司进行合成。 
PCR反应：以步骤（1）获得的cDNA产物为模板，分别以VH引物对或VL引物对进行PCR扩增。条件为：94°C30sec,56°C30sec,72°C45sec,共30个循环，末次72°C延伸15min。 
3.PCR产物的回收及纯化 
按照上述条件进行PCR后，将产物在1%琼脂糖凝胶上电泳进行鉴定，发现有分子量在300bp左右的两条条带，用Fermentas公司的胶回收试剂盒回收片断，操作按照厂家的说明书进行。 
4.PCR回收产物的连接、转化与测序 
将回收的PCR产物连接到PUC-mT载体上，通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，以T7启动子序列作为测序引物，进行重链VH及轻链VL的序列测定。 
确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析，并将可变区基因翻译成氨基酸序列;经过胚系基因归属分析，其重链V片段可能来自胚系基因Ig V6，同源度达97.6%，D片段来源于胚系基因DST4.2，同源度100%，J片段来源于胚系基因JH3，同源度达94.9%；返回的同源度最高的序列为98.2%（112/114），Genbank accession number为CAA79998，该基因为一种抗DNA抗体的重链可变区基因，虽然两者氨基酸序列上高度同源，但是CDR3区的氨基酸序列存在差异，而重链可变区的CDR3区恰好是决定抗体结合特异性最重要的互补决定区。轻链V片段可能源于胚系基因IgVk ai4gene（Genbank accession number：AJ231217），同源度达到94.5%，其J片段则可能源于胚系基因Jk2（Genbank accession number：V00777），同源度达到91.7%。同时经IMGT V-quest分析，得到一致的结果。轻链可变区氨基酸序列经NCBI IgBLAST blastp算法比对，该序列为一尚未报道过的全新轻链可变区序列。 
表1tmTNF-αmAb VH及VL基因及氨基酸序列 
V_H氨基酸序列和基因序列包括CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列和基因序列如下： 
1caggtccaactgcagcagcctggtgctgagcttgtgaagcctggggcctcagtgaagctg 
 Q V Q L Q Q P G A E L V K P G A S V K L 
61tcctgcaaggcttctggctacactttcaccagctactggataaactgggtgaagcagagg 
  S C K A S G Y T F T S Y W I N W V K Q R 
121cctggacaaggccttgagtggattggaaatatttatcctggtagtagtagtactaactac 
   P G Q G L E W I G N I Y P G S S S T N Y
181aatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacacatcctccagcacagcctac 
   N E K F K S K A T L T V D T S S S T A Y 
241atgcagctcagcagcctgacatctgacgactctgcggtctattattgtgcaaggttgggg 
   M Q L S S L T S D D S A V Y Y C A R L G
301gcttactggggccaagggactctggtcaccgtctccgca 
   A Y W G Q G T L V T V S A 
V_L氨基酸序列和基因序列包括CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列与基因序列和如下： 
1caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcctctccaggggagaaggtcacc 
 Q I V L T Q S P A I M S A S P G E K V T 
61atgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttccaggtacttgcactggtaccagcagaag 
  M T C S A S S S V S S R Y L H W Y Q Q K 
121tcaggagcctcccccaaactctggatttatggcacatccaacctggcttctggagtccct 
   S G A S P K L W I Y G T S N L A S G V P 
181gctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcgtggag 
   A R F S G S G S G T S Y S L T I S S V E 
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  A E D A A T Y Y C Q Q Y H S D P P T F G 
301tcggcgaccaagctggaaataaaa 
   S A T K L E I K 
实施例3：tmTNF-α嵌合抗体的制备 
将编码鼠源抗跨膜型TNF-α抗体的重链和轻链可变区的基因插入含有编码人IgG1轻链（κ）恒定区和重链恒定区基因的真核表达载体pIRES，稳转CHO细胞。用ELISA方法鉴定，其分泌的嵌合抗体可与TMTP20-BSA偶联复合物发生特异性结合，与亲本抗体的亲和力相似。 
实施例4：tmTNF-α单链抗体的制备 
将编码鼠源抗跨膜型TNF-α抗体的重链和轻链可变区的基因用linker（序列为： 
GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT）连接，插入原核表达载体pET28a中，转染大肠杆菌BL21，采用Ni-NTA agrose纯化蛋白。用ELISA方法鉴定，该单链抗体可与TMTP20-BSA偶联复合物发生特异性结合，其结合力与亲本抗体相同。 
实施例5：tmTNF-α单克隆抗体的检测应用 
1．tmTNF-α单克隆抗体的标记及定量 
1.1HRP标记tmTNF-α抗体定量以及效价的滴定 
将5mg HRP溶于0.5ml蒸馏水中,加入0.5ml新配的0.06M NaIO4溶液，4℃下避光搅拌20min；再加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀室温避光放置30min；将含有5mg抗体溶液装入透析袋中，以0.05M pH9.5的碳酸钠缓冲液透析6h；将透析样品加入0.2ml新配的5mg/ml NaBH4液，混匀，于4℃放置2h；加入等体积的饱和硫酸铵，4℃过夜；3000rpm，离心30min，将沉淀物溶于少许0.02M pH7.4PBS中，4℃透析过夜；10000rpm，离心30min，取上清即为HRP-抗体结合物，按照1：1体积比例加入100％甘油，－20℃保存。经质量鉴定，tmTNF-α单克隆抗体的HRP标记效率达到81.5%，用方阵法测定，可知抗原的最佳包被浓度为100ng/ml，酶标抗体的最佳工作浓度分别为1:6400，OD_492nm接近于1，且P/N值最高，故将此浓度确定为其最佳工作浓度。 
表2HRP标记抗体的质量鉴定 

1.2荧光标记抗体以及定量 
异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体：用pH9-9.5碳酸盐缓冲液透析抗体，按摩尔比1：20加入溶于DMSO的FITC，加PBS至2.5ml，室温下避光搅拌2h；用PD－10脱盐柱（Sephadex G25）除去游离荧光素，用PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F/P比值（即每个蛋白分子上所标记荧光素分子数量）。经质量鉴定，FITC标记定量为0.8mg/ml,F/P比值（即每个蛋白分子上所标记荧光素分子数量）为1.5。 
2．标记抗体的应用 
2.1免疫组化：本发明将HRP-tmTNF mAb用于免疫组化检测,其结果见实施例6，图11。 
2.2双抗夹心法检测tmTNF-α的表达 
以tmTNF单抗（2.5μg/ml）作为捕获抗体包被ELISA板4℃过夜，加封闭液置湿盒内37℃1h，洗板后，加入待测样本100μl/孔（PBS空白对照，无关肽阴性对照，sTNF标准品为阴性对照），置湿盒内，37℃2h；洗板后，加入1:200的HRP标记的抗sTNF抗体100μl/孔，37℃1h；洗板后，加入TMB底物溶液100μl/孔，避光室温反应15min，终止反应后，用酶标仪测定OD_450nm值。 
由ELISA结果（图8B）显示：低剂量PHA(5μg/ml）刺激28h的Jurkat细胞表达tmTNF-α，本室稳定转染tmTNF-α的HUVEC细胞株（阳性对照）和高剂量（10μg/ml）PHA刺激的Jurkat细胞均高表达tmTNF-α；而PBS空白对照、无关肽对照及sTNF标准品等阴性对照孔均无显色反应。反之，以sTNF mAb作为捕获抗体，tmTNF单抗作为检测抗体，由于sTNF mAb可结合跨膜型和分泌型TNF-α，而检测抗体则仅结合tmTNF-α,故后者组合方式较前者组合方式检测敏感性明显降低。此外，前种ELISA法辨别的差异与FACS结果（图8A）相近，即高剂量PHA刺激Jurcat细胞产生的tmTNF的量约为低剂量刺激产生的1.40倍。 
说明本发明以tmTNF单抗作为捕获抗体建立ELISA方法，检测tmTNF-α是完全可行的。 
2.3直接与间接免疫荧光： 
取50μl COS-7细胞(转染TNF-SP)1×10⁶/ml(间接法)或MDA-MD-231细胞1×10⁶/ml（直接法）涂于载玻片上，用冰冷甲醇固定细胞10min；加入1%Triton-X100PBS，室温10min，破膜； 用PBS洗一遍，加入用PBS1:100稀释的FITC标记tmTNF mAb（直接法）和1:500稀释的未标记tmTNF mAb（间接法），湿盒内，37℃孵育45min；用PBS洗3次，加入1:100稀释的以TRITC标记的羊抗小鼠IgG（二抗）（间接法）,37℃孵育45min；用PBS洗3次后，滴加30％甘油封片，荧光显微镜高倍视野下观察，并照相。 
直接荧光结果如图9A所示，tmTNF单抗成功结合到细胞表面的tmTNF-α，并在激发光作用下显示出绿色荧光。将本室构建的含有TNF-αNTF片段的pIRES2-EGFP/TNF-NTF质粒转染COS-7细胞，以tmTNF单抗作为一抗，以TRITC偶联的抗小鼠IgG抗体作为二抗，进行间接免疫荧光检测，证实转染细胞在488nm激发波长下，其表达的EGFP在细胞胞浆中呈现出绿色荧光(图9B左)；而在595nm激发波长下，同一视野可见细胞膜表面呈现红色荧光，(图9B右)，提示tmTNF单抗能识别表达于COS-7细胞膜上TNF-NTF目的蛋白。由此tmTNF单抗可应用于直接与间接免疫荧光检测。2.4激光共聚焦显微镜：见实施例1:4.4.4,图7。 
2.5流式细胞术分析（FACS）：见实施例1:4.4.3,图6。 
2.6免疫共沉淀: 
为了研究tmTNF-α反向信号复合物成员，故用抗tmTNF-α单抗进行免疫共沉淀，4×10⁷HL-60细胞加入含有PMSF等蛋白酶抑制剂细胞裂解液约400μl，冰上间歇振荡约15-20min；4℃，13000rpm离心20min，吸取上清，蛋白定量；取500μg蛋白，加入6μg tmTNF-αmAb，4℃2h；加入25μl蛋白A琼脂糖凝胶珠（SantaCruz，USA），4℃过夜；用冰细胞裂解液洗涤珠子4次，加入2×SDS上样缓冲液30-40μl，沸水煮5min。将免疫共沉淀物进行Western blot分析，证实IKK-α和TRAF1可与tmTNF-α发生免疫共沉淀（图10）。 
2.7tmTNF单抗用于免疫印迹的检测:见实施例1:4.4.2,图5。 
实施例6：tmTNF-αmAb用于检测肿瘤生物标记物tmTNF-α 
1．tmTNF-αmAb检测6种肿瘤组织tmTNF-α的表达 
本发明用tmTNF-αmAb分别对肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、淋巴瘤6种不同类型的肿瘤组织进行免疫组化染色（SABC法），即取石蜡切片，常规乙醇上行梯度脱蜡至水，3%过氧化氢孵育25min，以清除内源性过氧化物酶的活性；用PBS洗涤后，用3%BSA PBS封闭1h，加tmTNFmAb(1:1000),4℃过夜,用PBS洗涤3次后，加入25μl生物素标记的二抗（1:200稀释），37℃孵育30min，用PBS洗涤3次后，加25μl SABC（链霉亲和素－生物素－酶复合物），37℃孵育30min；PBS冲洗3次,加50μl DAB显色5min，常规脱水、透明、封片，镜下采集图像并分析。 
结果显示这些肿瘤中均有高表达tmTNF-α的病例（图11）；其中，乳腺癌细胞tmTNF的阳性 表达率最高，且其tmTNF-α强阳性（++～+++）病例数也最多（12/15例）。 
表3不同肿瘤对tmTNF-α的表达 

2．tmTNF-α在正常、良性增生和恶性增生乳腺组织的表达 
本发明用tmTNF-αmAb分别对正常乳腺组织、单纯性乳腺增生（良性增生）、不典型乳腺增生（癌前变）和原发性乳腺癌进行免疫组化检测，证实乳腺癌tmTNF阳性率为92.3%，不典型乳腺增生为80%，单纯性乳腺增生为33%，正常乳腺组织则为阴性(图12)，显示从乳腺的良性增生到恶性增生tmTNF-α表达率明显增强，提示tmTNF-α既可作为肿瘤标记物，又可作为癌变的预警信号。 
实施例7：tmTNF-α单抗的补体依赖性杀伤效应（CDC）和抗体依赖细胞介导的杀伤效应（ADCC）1.用tmTNF-α单抗检测几种乳腺癌细胞株对tmTNF-α的表达 
用tmTNF-αmAb进行流式细胞术检测，观察5株乳腺癌细胞株对tmTNF-α的表达。证实tmTNF-α在MDA-MD-435和MDA-MD-231细胞株的表达率分别为52.94%和89.14%，在T47D和MDA-MD-453细胞株呈低表达，在MCF-7细胞株则不表达。因此，我们用高表达tmTNF-α的MDA-MD-231细胞株作为tmTNF-αmAb的靶细胞进行体内外实验。 
2.tmTNF-α单抗和补体单独对于MDA-MD-231细胞增殖的影响 
为检测tmTNF-α单抗和含有补体的血清对细胞的毒性作用，用不同浓度的tmTNF-α单抗或补体分别与MDA-MD-231细胞孵育48小时后，用CCK-8cell counting kit检测细胞增殖。结果与对照组比较，tmTNF-α单抗对细胞增殖无影响P>0.005；补体在低于1：20稀释度对细胞无明显影响。此外，作为同型抗体对照的抗乙肝病毒表面抗原（HBVs）的单抗对细胞增殖也无影响。 
3．tmTNF-α单抗介导的ADCC作用 
抗体的杀伤机制之一是ADCC效应，故我们观察tmTNF-α单抗是否能介导巨噬细胞对高表达tmTNF-α乳腺癌细胞的杀伤作用。按常规方法取BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞，用10%FCS RPMI1640培养基悬浮细胞，加入96孔培养板中，在37℃下贴壁1h,洗去非贴壁细胞，获得效应细胞。不同浓度的tmTNF-αmAb或HBVs mAb和靶细胞事先孵育30min，再加入含有效应细胞的孔板中，效靶比为20：1，共孵育24小时。吸弃上清，加入CCK-8(Dojindo,Kumamoto,Japan)，孵育4h。在波长450nm下测定吸光度值（参考波长630nm）。ADCC计算公式：%Cytotoxicity(ADCC)=(OD_{effector cells+targetcells}–OD_{effector cells+mAb treated target cells})/OD_{effector cells+target cells} x100%. 
图13A结果显示：随着抗体浓度的增加，其ADCC效应也逐步增强。取抗体浓度为2μg/ml，，观察ADCC效应。由图13B可知：tmTNF-αmAb可介导巨噬细胞对MDA-MD-231乳腺癌细胞的ADCC效应（P<0.001），而HBVs mAb（同型抗体对照）则对乳腺癌细胞无ADCC效应；此外，tmTNF-αmAb对不表达tmTNF-α的MCF-7细胞亦无影响。 
4.tmTNF-α单抗介导的CDC效应 
抗体的另一杀伤机制是CDC效应，故我们观察tmTNF单抗是否能介导补体对高表达tmTNF-α乳腺癌细胞的杀伤作用。将MDA-MD-231乳腺癌细胞以5000/孔接种培养板，加入不同浓度tmTNF-αmAb或HBVs mAb，以及含有补体的新鲜豚鼠血清（1:20），37℃下孵育4h。吸弃上清，加入CCK-8(Dojindo,Kumamoto,Japan)，孵育4h。在波长450nm下测定吸光度值（参考波长630nm）。CDC计算公式：%Cytotoxicity(CDC)=(OD _{target cells+complement}–OD_{complement+mAb treated target cells})/OD_{target cells+complement} x100%. 
由图13C可知：同时加入补体和tmTNF-α抗体显示明显的CDC作用（P<0.001），而且杀伤程度随着抗体浓度的增加而增强。取补体的稀释度为1:20，抗体的浓度为2μg/ml，由图13D可知:补体与抗体共同作用，可明显杀伤MDA-MD-231乳腺癌细胞（P<0.001），而针对HBVs的抗体则对该乳腺癌细胞无CDC效应；此外，tmTNF-αmAb对不表达tmTNF-α的MCF-7细胞也无影响。 
5.tmTNF-α单抗对转染并表达TNF的NTF片段的乳腺癌细胞株MCF-7具有ADCC和CDC效应 
用上述3和4同样的方法检测tmTNF单抗对稳转并表达野生型tmTNF-α或TNF的NTF片段的乳腺癌细胞株MCF-7的ADCC（图13E）和CDC效应（图13F），证实该抗体同样可通过ADCC和CDC效应有效杀伤这两株转基因细胞株，但对不表达tmTNF-α的亲本MCF-7乳腺癌细胞株则无杀伤效应。 
实施例8：tmTNF-α单克隆抗体在动物体内对MDA-MD-231乳腺癌的抑制作用 
1．tmTNF-αmAb抑制乳腺癌生长 
给6周雌性裸鼠注射2×10⁶MDA-MD-231乳腺癌细胞株，建立原位移植模型，其成瘤率约为90％。注射乳腺癌细胞后约12～15天开始看见米粒大的肿瘤。待移植瘤长至约400mm³～500mm³时，开始进行不同剂量的抗体干预，即每3天腹腔注射一次抗体（120mg或240mg/只小鼠），持续6周，对照组注射相同剂量的HBVs单抗或生理盐水。结果如图14，与对照组相比，tmTNF-αmAb治疗可明显抑制肿瘤的生长速度（P<0.001）（图14A），并使肿瘤体积缩小（P<0.01）（图14B），此外，有3只小鼠的肿瘤完全消退；有意思的是tmTNF-α低剂量组对肿瘤的抑制率略高于高剂量组(图14C)，而无关抗体HBVs mAb则对肿瘤的生长无影响。提示tmTNF-α单克隆抗体可通过靶向治疗在体内发挥明显的抑瘤作用。 
2.tmTNF-αmAb抑制乳腺癌转移 
用MDA-MD-231乳腺癌细胞建立的裸鼠原位移植模型中，我们发现，在肿瘤生长至4周左右开始出现转移瘤。表4显示对照小鼠和注射HBVs mAb小鼠的肿瘤转移率无显著差异，分别为：57.1％和42.8％；tmTNF-αmAb治疗小鼠未见肉眼可见的肿瘤转移。此外，组织学检测证实与对照组相比，tmTNF-αmAb治疗小鼠的血管和淋巴管的肿瘤栓数目明显减少（图15A），淋巴结肿瘤浸润区域和淋巴结转移率显著下降（图15B），肿瘤转移相关分子CD44v6的表达也受到抑制(图15C)，提示tmTNF单克隆抗体的治疗不仅能抑制肿瘤的生长，而且还可抑制肿瘤转移。 
表4不同处理组乳腺癌的肉眼可见肿瘤转移率