建立病毒性肝炎小鼠模型的方法 技术领域
本发明涉及一种建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，用于模拟、研究和防治人类的病毒性肝炎。
背景技术
病毒性肝炎特别是乙型病毒肝炎是危害人类健康的重要疾病。据初步估计全世界乙型肝炎病毒(HBV)携带者约有4～5亿，我国是乙型肝炎病毒感染的高发地区，人群携带乙型肝炎病毒率约为10～20％。全世界每年由于病毒而引起的暴发型肝炎超过五万例，死亡率高达80～90％。病毒性肝炎肝细胞坏死的分子基础迄今仍不明确，亦无确定有效的治疗方法。因而，深入开展病毒性肝炎肝细胞坏死的分子免疫机理的研究，可为预测病毒性肝炎的疾病衍变和预后、以及为开辟新的药物或基因治疗途径提供理论依据。
由于缺乏体外成功培养人类肝炎病毒的技术，动物肝炎模型的建立显得尤为重要。1969年Litcher等科学家给黑猩猩接种含乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的血清后，黑猩猩出现特异性免疫反应，首次证实乙型肝炎病毒可以感染黑猩猩，这在乙型肝炎的研究中起了重要的作用。但该动物价格极为昂贵，来源也受到了很大的限制，同时其感染后无明显的临床症状，其感染后地经过和转归与人类乙型肝炎有明显的差别，这些不利因素决定了人们有必要寻找其他更容易获得且对乙型肝炎病毒更敏感的动物模型。长臂猿对乙型肝炎病毒的敏感性、以及感染后的血清学和生化改变类似于黑猩猩，但其同样不产生明显的临床症状。有些动物如绒毛猴尽管在接种乙型肝炎病毒感染性血清后可出现迟发性抗原血症，但却没有相应的生化和组织病变形成。恒河猴在一定的条件下似乎对乙型肝炎病毒是易感的，但其敏感性却比黑猩猩和长臂猿都低。恒河猴对不同乙型肝炎病毒株的敏感性并不一致，其对乙型肝炎病毒的adw株相对较敏感。在接种了含乙型肝炎病毒的血清后，恒河猴常产生乙肝抗原表面抗体(HBsAb)，少数恒河猴可产生低水平的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)血症，持续时间约2周左右，被感染的恒河猴不出现临床症状，血清转氨酶活力无明显升高，肝组织也缺乏相应的肝炎病理改变，这些均限制了恒河猴在乙型病毒肝炎研究中的应用。
在选择用乙型肝炎病毒建立乙型肝炎动物模型的同时，许多学者相继发现了几种与乙型肝炎病毒在形态、基因组结构和发病机理等方面相似的动物肝炎病毒，如鸭肝炎病毒(DHBV)、土拨鼠肝炎病毒(WHV)和地松鼠肝炎病毒等等，这些均归为嗜肝DNA病毒属，它们各具自身特性，但尚无一个单独的动物模型可以准确地复制出所有乙型肝炎病毒感染的全部特征，而且多数动物模型遗传背景不清，限制了它们在病毒性肝炎机制方面的研究。如鸭肝炎病毒模型接种病毒后出现持续性病毒血症，伴与不伴有病毒血症的一过性感染，或无感染情况，肝脏损伤较小，仅适用于乙肝病毒复制周期的研究。土拨鼠肝炎病毒模型与肝细胞肝癌(HCC)高度相关，仅适用于抗肿瘤药物的筛选。
随着人们对乙型肝炎病毒认识的不断提高，1985年Chisari等科研工作者通过显微注射技术建立了乙型肝炎病毒转基因小鼠模型，该模型主要用于乙型肝炎病毒治疗性免疫制剂的发展和临床效果观察，为乙型肝炎病毒的深入研究提供了新的途径。但该模型仍然具有体内缺乏病原体复制、与临床情况显著不同的局限性。
发明内容
本发明的目的就是要克服现有病毒性肝炎动物模型所存在的不足，提供一种建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，用该方法建立的小鼠模型成本低廉、易于复现、临床症状明显、可以复制出肝炎病毒感染的多种特征且与人类情况类似。
为实现此目的，本发明通过深入的研究和大量的实验发现：利用单一的鼠肝炎3型病毒(MHV-3病毒)，感染不同种系近亲繁殖的小鼠，可以得到不同的肝炎感染模式。由此经过严格的筛选，本发明提出一种建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，该方法包括以下步骤：
1)不同种系小鼠的准备：至少选择一组BALB/CJ纯系小鼠、一组C3H/HEJ纯系小鼠和一组A/J纯系小鼠，饲养备用；
2)感染源肝炎病毒的准备：选择纯化的鼠肝炎3型病毒(MHV-3病毒)备用；
3)不同种系小鼠的感染：将步骤2)所选择的鼠肝炎3型病毒分别注入步骤1)所选择的各组纯系小鼠体内，继续饲养；
4)不同种系小鼠的处理：观察经过步骤3)感染后的各组纯系小鼠的存活率，并收集各组纯系小鼠的肝脏以观察其肝脏组织学变化。
对应于BALB/CJ纯系小鼠组，可见其24～48小时开始出现毛发竖直、粘连、行走困难、不食等现象，肝脏病理切片见大面积肝组织坏死，炎性细胞浸润，微血管血栓形成，90％小鼠于感染后5～7日内死于暴发性肝炎，由此获得类似人类暴发性病毒肝炎的小鼠模型。对应于C3H/HEJ纯系小鼠组，可见其24～48小时开始出现毛发粘连、少动、少食现象，70％小鼠7～10日内死亡，30％小鼠存活并发展为慢性肝炎，由此获得类似人类慢性病毒肝炎的小鼠模型。对应于A/J纯系小鼠组，可见其活动自如，饮食正常，全部存活，由此获得类似人类肝炎病毒健康携带者的小鼠模型。
采用本发明方法所建立的模型具有如下优点：
1.所选鼠肝炎3型病毒感染BALB/CJ、C3H/HEJ和A/J这三种不同种系近亲繁殖的小鼠后，可产生类似人类各种不同临床症状类型的肝炎模型，包括暴发性肝炎，慢性肝炎及临床健康病毒携带者，即其感染模式与人类乙型肝炎病毒的感染模式十分相近。
2.所选鼠肝炎3型病毒感染的特征在于疾病的严重程度与鼠种系密切相关，低剂量的病毒即可在BALB/CJ敏感鼠中引致暴发性肝炎，小鼠在5～7天内死亡，是研究暴发性肝炎的理想模型；C3H/HEJ中度敏感鼠先患有急性肝炎，约30％存活者2周后转为慢性肝炎，对其急性肝炎慢性化的衍变窗口期机体的免疫状态及病毒复制情况进行研究，是探讨病毒性肝炎慢性迁延的免疫机制的有力工具。
3.本发明的小鼠模型重复性好，遗传背景清晰，使系统性、动态性研究病毒性肝炎的遗传控制因素及分子生物学、分子免疫学发病机理成为可能。
4.所选鼠肝炎3型病毒易于体内、体外培养，所建模型成本相对低廉，为研究抗病毒药物的作用机制和临床效应提供了实用、可靠的途径，同时也克服了乙型肝炎病毒转基因小鼠模型体内缺乏病原体复制而与临床情况显著不同的局限性。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述：
本发明所提出的建立病毒性肝炎小鼠模型的方法，包括以下步骤：
1)不同种系小鼠的准备：以12只为一组，选择若干组BALB/CJ纯系雌性小鼠、若干组C3H/HEJ纯系雌性小鼠和若干组A/J纯系雌性小鼠，在动物繁育实验室饲养备用。上述各组纯系雌性小鼠的年龄在6～8周胎龄的范围内较好，因为这个年龄范围的小鼠感染肝炎病毒后所反映出的症状非常稳定，易于模拟人类的感染情况，而所选小鼠最好的年龄应为8周胎龄。上述各组纯系雌性小鼠的动物级别应为清洁级，这样可防止其他污染对所建模型的干扰和影响，确保模型的准确性。将上述各组纯系雌性小鼠置于无菌过滤空气鼠笼内，控制笼内温度为22℃，12小时光照/黑暗交替进行，供给优质饲料与水，饲养一周，使其适应实验室新的生活环境，即可用于下面的实验。
2)感染源肝炎病毒的准备：选择鼠肝炎3型病毒，此病毒可以从所有的美国模式培养物保藏所(ATCC)购置到。将购置到的鼠肝炎3型病毒在DBT细胞系空斑纯化后，于17cL细胞系繁殖培养，L2细胞系滴度定量后，即可用于下面的实验。本例中所用鼠肝炎3型病毒的滴度为4×106pFu/ml。
3)不同种系小鼠的感染：将上述滴度为4×106pFu/ml的鼠肝炎3型病毒，通过30号针头分别对上述各组纯系雌性小鼠的中下腹壁行腹腔内注射。每只纯系雌性小鼠体内注入的鼠肝炎3型病毒量在100～1000pFu(病毒噬班形成单位)的范围内都能有效地体现出感染的症状，本例中每只纯系雌性小鼠体内只注入100pFu鼠肝炎3型病毒，这样可以节约病毒的用量。注射后的纯系雌性小鼠继续在无菌过滤空气鼠笼内饲养。
4)不同种系小鼠的处理：
(1)观察一组BALB/CJ纯系小鼠、一组C3H/HEJ纯系小鼠和一组A/J纯系雌性小鼠的存活率，其结果为：12只BALB/CJ敏感组小鼠于鼠肝炎3型病毒感染后24小时开始出现毛发竖直、粘连、行走困难、不食等现象，第5天全部死亡，死亡率达100％。12只C3H/HEJ中度敏感组小鼠于鼠肝炎3型病毒感染后，其中8只于7天内死亡，死亡率达66.67％，存活下来的小鼠发展为消耗综合征，表现为体重下降、脱发、油性毛发和麻痹。12只A/J耐受组小鼠全部存活。这三种小鼠对鼠肝炎3型病毒感染的敏感性见下图的生存曲线，图中横坐标为小鼠感染鼠肝炎3型病毒后的天数，纵坐标为小鼠存活数。
(2)收集其他各组纯系雌性小鼠的肝脏以观察其肝脏组织学变化：在小鼠感染鼠肝炎3型病毒后分别设立0时、1天、2天、3天、5天、7天、10天、20天等时间点，收集每组小鼠的肝脏，其中0时小鼠肝脏作为正常对照组，制作成厚度为4um的肝脏组织石蜡切片，苏木素、伊红染色后镜下观察。其结果为：BALB/CJ敏感组小鼠感染后24小时，肝组织汇管区出现炎性细胞浸润、微血管血栓，形成大量小范围、不连续的坏死区域；至感染后48小时，大量炎性细胞浸润和纤维素沉积，肝脏坏死区域出现融合，呈大块性坏死，即BALB/CJ敏感小鼠的肝脏组织病变随着时间的推移进行性加重。C3H/HEJ中度敏感组小鼠于感染后24小时，肝脏可见轻度的点、灶状坏死，肝脏结构较完整，随着时间的推移，肝脏可出现中度碎片状坏死，炎性细胞浸润，少量纤维素沉积，但至感染后第7天，存活下来的小鼠肝脏病变基本停止恶性进展。而A/J耐受组小鼠的肝脏组织始终未见明显异常改变。
由此，选用BALB/CJ纯系小鼠可建立类似人类暴发性病毒肝炎的小鼠模型，选用C3H/HEJ纯系小鼠可建立类似人类慢性病毒肝炎的小鼠模型，选用A/J纯系小鼠可建立类似人类肝炎病毒健康携带者的小鼠模型。