一种水分散性纳米级骨形态发生蛋白注射制剂及其制备方法 技术领域
本发明涉及一种水不溶性的蛋白类生物生长因子的水分散纳米微粒制剂及其制备方法，尤其是一种以蛋白、多糖类材料及其混合物为包覆材料，磷脂为分散剂的骨形态发生蛋白的水分散纳米微粒注射制剂及其制备方法。
背景技术
骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β超家族中的一员，具有高效的骨诱导活性。它可对成骨细胞系中的不同细胞发挥阶段特异性调控作用，诱导新骨形成；在许多器官与组织的生长过程中起着极为重要的调控功能。特别在促进骨生长、骨折愈合等医学临床方面显示出良好的应用前景。已有的研究主要是通过将BMP直接包埋在骨架材料中，并用于动物活体培养来考察BMP的生理活性与缓释效果。但是骨形态发生蛋白在人体内的存活周期短，仅数分钟到几个小时，需要大剂量使用BMP才能维持药效，药物利用率低；而且BMP水溶性差，这种骨架材料使用中的后处理过程复杂。因此，制备一种具有不同缓释性能、水分散的骨形态发生蛋白注射制剂对于BMP的相关研究以及临床应用具有极其重要的价值。
蛋白与多糖类材料是常用的两类生物材料，无毒性，具有良好地生物相容性和组织相容性；而且与骨形态发生蛋白具有很好的相亲性。此外，它们具有良好的组织相容性。如果以蛋白、多糖或它们的混合体来包覆BMP，制备水分散、纳米级的BMP复合粒子分散体，不仅易于通过组织吸收到血液循环系统，从而很好的提高药物的利用率；而且通过控制各组分间的比例，使得这种纳米复合粒子具有不同缓释特性，可以延长了BMP在血液中的循环周期。此外，这种粒子由于以蛋白或多糖为包覆材料，极易与多种组织过程材料结合，这使得制备含BMP的骨架材料的后处理过程得到简化。
发明内容
本发明目的是提供适合于多种水溶或水不溶的水分散性纳米级骨形态发生蛋白注射制剂及其制备法。
本发明是利用具有良好的生物相容性与细胞相容性的磷脂类物质为分散剂，以蛋白、多糖为药物的包覆材料，通过控制蛋白、多糖的比例以及他们的混合体与骨形态发生蛋白(BMP)的比例，采用共凝聚技术，获得粒径40～2000nm的水分散的骨形态发生蛋白注射制剂。
发明的这种注射制剂包括分散在蒸馏水中的纳米颗粒的蛋白类骨诱导生长因子，包覆纳米颗粒的蛋白类骨诱导生长因子的蛋白质类生物大分子材料或多糖类生物大分子材料或蛋白类与多糖类混合的生物大分子材料及作为分散剂的磷脂类物质。
发明的注射制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)在0～50℃温度下，将蛋白类骨诱导生长因子溶解在蛋白或多糖或蛋白和多糖的混合体的尿素或盐酸胍水溶液中，骨诱导生长因子重量体积浓度为0.01～100mg/ml，调节溶液的pH值为2～11，骨诱导生长因子与蛋白或多糖或蛋白-多糖混合体的重量比为1∶0.1～1∶20。
(2)将步骤(1)所得溶液逐滴滴加到pH值为3～9的含有0.1-10mg/ml的磷脂类物质的分散水溶液中，同时机械搅拌或超声波分散。
(3)将步骤(2)获得的分散体在去离子水中反复透析，或者以纳滤膜反复用去离子水过滤清洗，4℃下保存。
本发明中，所说的磷脂类物质为卵磷脂、脑磷脂。蛋白类骨诱导生长因子为骨头中生化提取的骨形态发生蛋白，或者是基因重组的BMP-2型、BMP-4、BMP-7型骨形态发生蛋白。
本发明中，包覆蛋白类骨诱导生长因子的蛋白质类生物大分子材料为白蛋白、胶原蛋白、明胶、酪蛋白、蚕丝蛋白以及它们的混合体。包覆蛋白类骨诱导生长因子的多糖类生物大分子材料为葡聚糖及其衍生物、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、纤维素。包覆蛋白类骨诱导生长因子的蛋白类与多糖类混合的生物大分子材料是白蛋白、胶原蛋白、明胶、酪蛋白、蚕丝蛋白中的一种或多种和葡聚糖及其衍生物、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、纤维素中的一种或多种的混合物。
发明制备过程中，所说的蛋白类骨诱导生长因子是从骨头中生化提取的骨形态发生蛋白，或者是基因重组的BMP-2型、BMP-4、BMP-7型等骨形态发生蛋白。所说的蛋白为白蛋白、胶原蛋白、明胶、酪蛋白、蚕丝蛋白以及它们的混合体，多糖为葡聚糖及其衍生物、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、纤维素。蛋白-多糖混合体是白蛋白、胶原蛋白、明胶、酪蛋白、蚕丝蛋白中的一种或多种和葡聚糖及其衍生物、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、纤维素中的一种或多种的混合物
本发明的优点在于：
(1)无毒性 本发明采用的材料没有任何生理毒性，且制备过程无环境污染的隐患。
(2)良好的生理相容性 本发明以生物相容性良好的蛋白、多糖和磷脂为包覆材料与分散剂，与骨形态发生蛋白有良好相亲性，并具有良好的组织相容性，不会造成组织的不良反应。
(3)可控性 通过简单控制各组分间的比例，可获得不同的缓释特性、不同粒度的BMP复合纳米粒子。
(4)适用范围广 该水分散骨形态发生蛋白注射制剂可作为单独制剂直接应用，也可与其它生物材料相结合，进一步制备具有与细胞以及多种组织具有良好相容性的生物活性材料。
(5)工艺简单，条件温和。
附图说明
图1是以白蛋白为包覆材料，超声波分散条件下获得的BMP分散体的扫描电镜(SEM)图片，放大倍数为30000。由图可以清晰地看出，颗粒平均大小在40纳米左右，少数大的颗粒大小也不超过100纳米，且颗粒分散均匀。
图2是以白蛋白为包覆材料，机械搅拌条件下获得的BMP分散体的粒度分布图，由图可以看到，颗粒大小主要集中在150纳米左右，少数大的颗粒大小也不超过500纳米。
图3是以牛腱胶原为包覆材料，机械搅拌条件下获得的BMP分散体的原子力显微镜(AFM)，由图可以看到，颗粒大小主要集中在200纳米左右。
图4是以二乙胺基乙基葡聚糖氯化物(DEAE-葡聚糖)为包覆材料，超声波分散条件下获得的BMP分散体的扫描电镜(SEM)图片，放大倍数为20000倍。由图可以清晰地看出，颗粒平均大小在70纳米左右，少数大的颗粒大小也不超过150纳米，且颗粒分散均匀。
图5以壳聚糖(Chitosan)为包覆材料，机械搅拌条件下获得的BMP分散体的原子力显微镜(AFM)图片，由图可以看到，颗粒大小主要集中在300纳米左右。
图6以胶原-DEAE-葡聚糖混合物为包覆材料，机械搅拌条件下获得的BMP分散体的原子力显微镜(AFM)图片，由图可以看到，颗粒大小在300-2000纳米之间。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作详细说明：实例1：以牛血清白蛋白为包覆材料—透析法制备
在25℃下，将骨头中生化提取的骨形态发生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量体积浓度为0.5mg/ml)，加入白蛋白(BMP与白蛋白的重量比例为1∶5)，用醋酸调节溶液pH值为3。将此溶液逐滴滴加到溶有3mg/ml卵磷脂的缓冲水溶液中(pH＝5)，同时在超声波清洗器中震荡，将获得的分散体在去离子水中反复透析3昼夜。所得的结果见图1。实例2：以牛血清白蛋白为包覆材料—纳滤法制备
在25℃下，将骨头中生化提取的骨形态发生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量体积浓度为0.5mg/ml)，加入白蛋白(BMP与白蛋白的重量比例为1∶5)，用醋酸调节溶液pH值为3。将此溶液逐滴滴加到溶有3mg/ml卵磷脂的缓冲水溶液中(pH＝5)，同时机械搅拌上述水溶液，将获得的分散体在孔径为50nm的纳滤膜上反复用去离子水清洗。所得的结果见图2。实例3：以牛腱胶原为包覆材料
在25℃下，将骨头中生化提取的骨形态发生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量体积浓度1mg/ml)，加入胶原(BMP与胶原的重量比例为1∶4)，用醋酸调节溶液pH值为3。将此溶液逐滴滴加到溶解有3mg/ml卵磷脂的缓冲水溶液中(pH＝7)，同时机械搅拌上述水溶液。将获得的分散体在50nm滤孔的纳滤膜上反复用去离子水清洗。所得BMP纳米粒子的形态见图3。实例4：以牛血清白蛋白-牛腱胶原混合体为包覆材料
在25℃下，将骨头中生化提取的骨形态发生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量体积浓度0.2-4mg/ml)，加入白蛋白-胶原(BMP与白蛋白-胶原的重量比例为1∶1～1∶10，白蛋白与胶原的重量比例为1∶1)，用醋酸调节溶液pH值(3～7)。将此溶液逐滴滴加到溶解有1-3mg/ml卵磷脂的缓冲水溶液中(pH＝5～9)，同时在超声波清洗器中震荡，或机械搅拌上述水溶液，将获得的分散体在去离子水中反复透析3昼夜，或在50nm滤孔的纳滤膜上反复用去离子水清洗。实例5：以DEAE-葡聚糖为包覆材料
在25℃下，将骨头中生化提取的骨形态发生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量体积浓度1mg/ml)，DEAE-葡聚糖(BMP与DEAE-葡聚糖的重量比为1∶5)，用醋酸或氢氧化钠调节溶液pH值为9。将此溶液逐滴滴加到溶解有3mg/ml卵磷脂的缓冲水溶液中(pH＝7)，同时在超声波清洗器中震荡。将获得的分散体在去离子水中反复透析3昼夜，所得的结果见图4。实例6：以壳聚糖为包覆材料
在25℃下，将骨头中生化提取的骨形态发生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量体积浓度1mg/ml)，壳聚糖(BMP与壳聚糖的重量比为1∶5)，用盐酸调节溶液pH值为3。将此溶液逐滴滴加到溶解有3mg/ml卵磷脂的缓冲水溶液中(pH＝7)，同时机械搅拌上述水溶液。将获得的分散体在50nm滤孔的纳滤膜上反复用去离子水清洗，所得的结果见图5。实例7：以胶原-DEAE-葡聚糖为包覆材料
在25℃下，将骨头中生化提取的骨形态发生蛋白(BMP)溶解于6M的尿素水溶液中(BMP重量体积浓度1mg/ml)，加入胶原-DEAE-葡聚糖(BMP与胶原-DEAE葡聚糖的重量比例为1∶5，胶原与DEAE-葡聚糖的重量比为1∶2)，用盐酸调节溶液的pH值为3。将此溶液逐滴滴加到溶解有3mg/ml卵磷脂的缓冲水溶液中(pH＝7)，同时机械搅拌上述水溶液，将获得的分散体在50nm滤孔的纳滤膜上反复用去离子水清洗。所得的结果见图6。