海狗油作为制备治疗急性肝损伤的药物的应用 【技术领域】
本发明涉及的是将海狗油作为制备治疗急性肝损伤的药物的应用，具体地讲，本发明涉及的是将海狗油作为制备治疗哺乳动物以及人的急性肝损伤的药物的应用。背景技术
众所周知，糖尿病、肝病、前列腺、高血脂等疾病的患者数量是很巨大的，而实际应用中，具有特别明显效果而几乎没有副作用的药物却很难确认。
通常认为，爱斯基摩人和日本沿海渔民患此类疾病的患者数量比一般人群要明显地低，研究人员相信这种现象和与他们食用富含不饱和脂肪酸的海狗肉、油有关。
但是，至今并未有具体动物实验或者临床结果加以证明。
在本发明中所述的海狗通常是指生活纽芬兰、北大西洋地区、北极的一种哺乳动物，它们体内脂肪中不饱和脂肪酸含量高达25％，其分子结构与人体内的脂肪酸分子结构相似。
本发明所述的海狗油(又称海豹油)是指由海狗的皮下脂肪提炼而成的纯天然产品。
研究结果表明，海狗油中含有大量的人体必需的体内不能自行合成的ω-3系长碳链多烯不饱和脂肪酸以及少量的角鲨烯(SPUALENE)。发明内容
本发明的目的在于提供一种将海狗油作为制备治疗急性肝损伤的药物的应用。
本发明的药理学实验采用的海狗油为海狗体内提取而成的微黄色油状液体，由加拿大的大西洋卫生食品有限公司以软胶囊(0.5g/粒)方式提供，批号为11656，所述的海狗油在实验室采用室温保存。
为了进一步明确上述海狗油的成份和含量，以下对本发明所使用的海狗油的成份进行分析和确认。
现有技术已经表明，从海狗油中提取的ω-3系多烯不饱和脂肪酸的化学主成份为EPA、DHA和DPA，其中：
EPA是指二十碳五烯酸；DPA是指二十二碳五烯酸；DHA是指二十二碳六烯酸；
本发明的研究人员对上述获得的海狗油进行紫外吸收光谱、红外吸收光谱、气相色谱、气-质联用色谱等项目的测定，对所述样品的化学结构进行了确认，具体如下：
本发明采用的海狗油样品的检测结果是：
(1)紫外吸收光谱
用氯仿(分析纯)把样品配成5.9mg/ml溶液后进行全波长紫外扫描，所使用的仪器的型号是U-3210spectrophotometer(Japan制造)；参见附图1，其结果表明样品在249.8nm处有最大吸收，可以证明样品中含有大量的不饱和键；
(2)红外吸收光谱
参见附图2，其结果表明，在3010cm-1和1745cm-1处的强吸收分别是不饱和＝C-H和＞C＝O伸缩振动的特征吸收；1655cm-1处的弱吸收符合顺式双键(R1-C＝C-R2)的伸缩振动特征吸收(1665-1635cm-1，反式为1675-1665cm-1)，H/ \H722cm-1处的吸收峰符合顺式双键＝C-H弯曲振动的特征吸收(730-665cm-1，反式为980-960cm-1)。
综合红外和紫外光谱分析，可以认为样品中主要为顺式非共轭脂肪酸。
(3)气相色谱
在本项检测中，采用的标准品由SIGMA公司提供，分别为：
Cis-5，8，11，14，17-EICOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十碳五烯酸甲酯；
Cis-4，7，10，13，16，19-DOCOSAHEXAENOIC ACID ETHYL ESTER，二十二碳六烯酸乙酯；
Cis-7，10，13，16，19-DOCOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十二碳五烯酸甲酯；
样品为上述获得的海狗油，用GC法分析脂肪酸需要将其乙酯化以利气化，具体是取所述的样品80μl，加0.5ml/l的NaOH-乙醇液1ml，充N2，加塞，于50摄氏度水浴中振摇至小油滴完全消失，加三氟化硼乙醇液1.5ml。混合均匀，于50度水浴中放5min，取出冷却，加正庚烷1ml、饱和NaCl为2ml混合均匀，分层。取上层液于另一试管中，加少量无水NA2SO4，充N2，于4度放置待GC分析。
所使用的仪器为HP6890；
气相色谱条件：玻璃充填柱2m×3mm，10％DEGS酸洗，101白色担体，载气N2，流速25ml/min，检测器FID，柱温180度，气化室210度，检测器270度，进样量1ul。
将标准品用正己烷定容，配置成2.5mg/ml溶液，精密量取1ul进行气相含量测定，同样的方法对样品进行测定，结果是样品和对照品的保留时间一致。
可参见附图3-7。
(4)气-质联用法
采用的仪器为美国Trace 2000GC/Trace MS型气-质联用仪，所有试剂均为分析纯。
实验条件为：
气相色谱条件：PEG-20M玻璃毛细管柱(2m×0.32mm)；柱温40度保持1min，以10度/min升温至200度，保持5min，再以30度/min升温至210度，保持2min；载气N2，柱前压3.0kpa，分流比1∶30，进样口温度250度；离子源温度250度，电离电压70Ev，质量扫描范围350AmU.S-1；进样量1ml。
经质谱图分析，确定样品和标准品的分子量相符。
至此，对本发明采用的海狗油的分子量、成份、含量和结构已经得到确认。
本发明的药理学实验中所用的材料的准备。
一、海狗油
所述的海狗油已经在上述的内容中详细描述，实验时直接吸取原药液或橄榄油稀释后的药液，大鼠每140g体重灌胃给予1.2ml(高剂量使用原药液)或1ml(中，低剂量使用稀释药液)。
二、阳性对照药
本发明中使用的阳性对照药为联苯双酯，每丸含量1.5mg，批号990527，由北京协和制药厂生产，购于北京协和制药厂药店。试验前将药丸在乳钵中压碎，边研磨边加入蒸馏水，制成浓度22.5mg/ml的混悬药液，大鼠灌胃体积1ml/140g体重。
三、空白对照组大鼠每只灌胃1ml蒸馏水。
四、模型对照药
本发明中采用的模型对照药是四氯化碳，分析纯，由北京化工厂生产，批号990401，购于北京医药商店。试验前用橄榄油配成0.1％溶液，按10ml/kg腹腔注射。
五、生化试剂及其它试剂：AST酶及ALT酶检测试剂盒为北京北化精细化学品有限公司生产，橄榄油，生理盐水，福尔马林均购于北京医药商店。
六、试验动物
本发明中采用的实验动物为清结级wister大鼠，雌雄各半，体重130-150g，动物质量合格证号：京动许字(2000)第012号，由中国药品生物制品检定所中心提供。实验前观察2天，选健康，活泼的动物用于实验。
为了确认本发明所述的海狗油在治疗四氯化碳致急性肝损伤模型方面的疗效，进行了以下的动物试验，实验目的是了解所述的海狗油在治疗所述的四氯化碳致急性肝损伤方面的药理学作用和效果，具体的方法与结果如下：
取大鼠48只，雌雄各半，体重130-150g，试验共分6组，每组8只，即空白对照组，模型对照组均灌胃给水1ml/只，阳性对照药联苯双酯0.16g/kg组，海狗油8.6ml/kg组，4.3ml/kg组，2.2ml/kg组。每天灌胃给药1次，连续7天，在第7天给药后5小时，除空白对照组外，均腹腔注射0.1％四氯化碳。给药期间大鼠精神好，活动自如，未见药物引起的不良反应，给药满7天，进行以下指标的检测。
1、AST酶(门冬氨酸氨基转移酶)及ALT酶(丙氨酸氨基转移酶)的测定：腹腔注射0.1％四氯化碳后，于第8天断头取血，待血液凝固后3000rpm，离心10分钟，收取血清。按试剂盒要求分别测定血清中AST酶及ALT酶的含量，以两组t检验测定各组AST酶及ALT酶含量差异的显著性。结果见表1。
表1海狗油对AST酶及ALT酶的影响(一)组别剂量ml/kg动物数n AST酶(U/ml) x±SD P值 ALT酶(U/ml) x±SD P值空白对照—— 8 186.75±18.34 41.53±12.27模型对照10mg 8 206.03±14.5*# ---- 53.48±7.51* ——阳性对照0.16g 8 182.76±5.89 P＜0.05 36.92±5.77＜0.05海狗油2.24.38.6 8 8 8 186.55±13.59 183.44±11.54 171.25±14.16 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.01 48.00±4.69 39.63±3.42 38.55±8.07＞0.05＜0.05＜0.01
与空白对照组比#P＜0.05，*P＜0.01
海狗油对AST酶及ALT酶的影响(二)组别剂量ml/kg动物数n AST酶(U/ml) x±SD P值 ALT酶(U/ml) x±SD P值空白对照—— 8 136.02±12.40 44.27±3.71模型对照10mg 8 173.71±21.54* ---- 66.58± 16.69#*——阳性对照0.16g 8 138.23±26.29＜0.01 35.86±5.32＜0.01海狗油2.24.38.6 8 8 8 165.79±18.06 135.07±15.17 129.88±19.30＞0.05＜0.01＜0.01 59.57±16.3 38.89±4.7 34.16±4.87＞0.05＜0.01＜0.01
与空白对照组比*P＜0.01
结果表明，空白对照组的AST酶及ALT酶在正常值范围内，模型对照组的值升高非常明显；而阳性对照组及海狗油4.3ml/kg-8.6ml/kg组的数值均有明显降低，与模型对照组比较统计学分析具有显著性差异或非常显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。
2、病理组织学观察及测定：在取血同时逐一取同部位矸用10％福尔马林固定48小时，常规制片，HE染色，光镜检查。显微镜下观察可见：空白对照组大鼠肝组织结构正常，未发现特殊病变。模型对照动物病变显著严重，大部分动物腹腔出血，肝中央静脉高度扩张淤血，汇管区组织及中央静脉细胞严惩损害(退变一坏死)，阳性对照药及高剂量组与空白对照相近矸组织结构明确，中剂量组个别大鼠汇管区组织及周边少量肝细胞受损害，中央静脉轻度扩张充血，低剂量组病变较以上稍重，其效果次于高，中剂量组。详见图1-6。
海狗油在4.3-8.6ml/kg剂量下，连续灌胃7天，对大鼠四氯化碳所致的急性肝损伤，可以使升高的AST酶和ALT酶降低，可以有效地预防急性损伤的发生，肝病理组织学观察认为抗急性肝损伤作用明显，提示了该药在此剂量下，具有较好的抗急性肝损伤的作用。附图说明
以下是本发明的附图说明，通过附图说明并结合上述的具体描述，可以更清楚地理解本发明，具体如下：
附图1是本发明所采用的海狗油的紫外吸收谱图；
附图2是本发明所采用的海狗油的红外吸收谱图；
附图3-5是本发明中使用的EPA甲酯、DHA乙酯、DPA甲酯的标准品的气相色谱图；
附图6-7是本发明所采用的海狗油的气相色谱图；
附图8是本发明所述的实验中病理组织学观测及测定，其中：
附图8-1是高剂量组，肝组织结构与空白对照组相近，肝小叶与肝血窦结构清晰，中央静脉部肝细胞排列成索，呈放射状；
附图8-2是中剂量组，肝组织结构有所恢复，部分动物中央静脉扩张充血；
附图8-3是低剂量组，个别动物汇管区组织变性坏死，肝细胞见核固缩，胞浆呈空泡变性；
附图8-4是对照组，肝组织结构完整，清晰，肝小叶结构正常，中央静脉壁薄，肝细胞排列成索，呈放射状；
附图8-5是模型对照组，中央静脉高度扩张，淤血，汇管区及中央静脉附近肝细胞严重损害(退变-坏死)，肝细胞索消失；
附图8-6是阳性对照组，肝细胞结构较清晰，偶见中央静脉扩张有充血及部分炎性细胞；
附图8-7是对照组，肝组织结构完整，清晰，肝小叶结构正常，中央静脉壁薄，肝细胞排列成索，呈放射状；
附图8-8是模型对照组，中央静脉高度扩张，淤血，汇管区及中央静脉附近肝细胞严重损害(退变-坏死)，肝细胞索消失；
附图8-9是阳性对照组，肝细胞结构较清晰，偶见中央静脉扩张有充血及部分炎性细胞；
附图8-10是高剂量组，肝组织结构与空白对照组相近，肝小叶与肝血窦结构清晰，中央静脉部肝细胞排列成索，呈放射状；
附图8-11是中剂量组，肝组织结构有所恢复，部分动物中央静脉扩张充血；
附图8-12是低剂量组，个别动物汇管区组织变性坏死，肝细胞见核固缩，胞浆呈空泡变性；