持效控制蚊虫孳生并防止其产生抗性的方法 本发明涉及一种微生物控制蚊虫的方法，具体地说是将不同来源的杀蚊毒素基因共同导入蓝藻表达，并把这种基因工程改造的蓝藻释放到自然水体中持效抑制蚊幼虫孳生的方法。
蚊子是疟疾、脑炎、登革热等流行病的传播媒介，蚊虫叮咬也会影响人们的工作和生活。通常对蚊虫的控制，主要是借助于化学杀虫剂的使用和生物防治措施。化学杀虫剂显效快，易于操作；但费用高，造成环境污染，并已导致蚊虫抗性。生物防治措施包括使用细菌制剂和捕食性动物。细菌制剂中有球形芽孢杆菌和苏云金杆菌以色列亚种两类，由于芽孢和伴孢晶体迅速沉淀，有效成分不能对生活于上层的蚊幼虫发挥作用，故持效时间短。捕食动物的使用往往局限于特定水体，并且操作较复杂。研究发现，将来源于“苏云金杆菌以色列亚种”或“球形芽孢杆菌”的杀蚊毒素基因导入蓝藻(或称蓝细菌)，可获得对蚊幼虫的毒杀力。由于蓝藻在自然水体有繁殖力，并可漂浮于水体上层，从而较大程度地提高了对蚊幼虫的持续控制时间。但是，目前已有的杀蚊蓝藻只表达一个来源的杀蚊毒素基因，经历一段时间的使用后，蚊虫可产生抗性。
本发明的目的就在于克服现有技术存在的问题，而提供一种既持效控制蚊虫孳生又防止其产生抗性的方法。
本发明目地是这样实现的，即在蓝藻同时表达两个来源共三种杀蚊毒素基因。由于多种毒素的存在，蚊虫对基因工程蓝藻产生抗性的机会将大大减少。具体地说，是将“苏云金杆菌以色列亚种”的毒素蛋白基因cryllA和cytlA以及“球形芽孢杆菌”的二元毒素基因共同导入丝状固氮蓝藻(如鱼腥藻、念珠藻)表达，并把这种基因工程蓝藻喷施到蚊幼虫孳生水体。总体方案为：
1)将cryllA和cytlA基因串联克隆并装置到强启动子PpsbA下游，与“球形芽孢杆菌”的二元毒素基因(即51kDa和42kDa蛋白基因)共同克隆入大肠杆菌-鱼腥藻穿梭质粒；
2)将含有杀蚊毒素基因的穿梭质粒通过接合转移的方法导入丝状固氮蓝藻；
3)将转基因蓝藻大量培养，喷洒到有蚊幼虫孳生的水体中。
本发明和现有灭蚊技术相比较有以下优点和积极效果：
1)无化学杀虫剂造成的污染，对人畜安全；
2)在自然水体中具有持久灭杀蚊幼虫的效果；
3)防止蚊幼虫抗性的发生。
下面结合实施例进一步说明：
含有杀蚊毒素基因的穿梭质粒可导入多个鱼腥藻藻株，如中国淡水藻种库(湖北武汉，中国科学院水生生物研究所)中保藏的鱼腥藻171号、318号、418号、583号、595号和709号等。多种藻株转基因后显示相似杀蚊幼毒效，混合使用可提高对不同水质的适应性。
使用芽孢杆菌制剂可缓解化学杀虫剂带来的环境污染和日益显著的蚊虫抗性问题，但球形芽孢杆菌制剂一般持效在两个星期以内，苏云金杆菌以色列亚种持效在3～4天以内，之后蚊幼虫可重新在水体中孳生。反复喷洒导致费用增高，并且蚊虫已开始出现对球形芽孢杆菌的抗性。在以前的研究中曾利用蓝藻表达一种或两种单一来源的杀蚊毒素基因，易于引起蚊虫抗性。
本发明同时将cryllA和cytlA基因和51kDa和42kDa杀蚊蛋白基因共同在丝状固氮蓝藻表达，其中可利用的丝状固氮蓝藻包括所有在分类学上隶属于鱼腥藻属和念珠藻属的藻株。其中cytlA和二元毒素基因之间具有协同作用，可抑制蚊虫抗性发生，加上cryllA基因效果更为显著，并扩大杀蚊谱。蓝藻杀蚊剂在自然水体中可持续控制蚊虫孳生2～3个月。
实施例1：在城镇居民区附近的静止小水体中常有蚊幼虫孳生，将本发明中表达多种杀蚊毒素基因的不同蓝藻株混合喷洒到水体表面，在初始浓度达每毫升十万个细胞时，可在48小时内杀死几乎全部蚊幼虫，并在两个月内水体中保持无蚊虫孳生，三个月后蚊幼虫密度仍保持在很低水平。
实施例2：在农村水稻种植区和城郊沼泽地有大量蚊虫孳生，由于面积大，若反复喷洒芽孢杆菌制剂，在费用和人力条件方面均不许可。利用本发明中的杀蚊幼蓝藻经一次喷洒可在较长时间内达到持续控制蚊虫的目的。
实施例3：由于长期使用某种化学杀虫剂或球形芽孢杆菌制剂杀灭蚊虫的地区，蚊虫可形成抗性，从而使杀虫制剂失去效力。此时使用本发明中的杀蚊幼蓝藻可杀灭抗性蚊虫，在较长时间内把蚊虫控制在较低的密度，克服其抗性问题。
由于本发明具有以上优点和积极效果，而且性能价格比高，操作方便，故有广阔的应用前景。