蛇毒蛋白水解酶在制药中的应用 【技术领域】
本发明涉及蛇毒蛋白水解酶在制药领域的新用途。背景技术
目前，蛇毒蛋白水解酶在临床上只是以大剂量作抗凝血药应用，以溶解血栓，抑制血栓形成，改善微循环。用于血栓性疾病，脑梗塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等的治疗，剂量为每次静脉注射5-10降纤酶单位(以中国药品生物制品检定所提供的降纤酶标准品测定效价所得的酶单位)，该剂量范围时，血液中的纤维蛋白原被大量消耗，血液粘度明显降低，从而抑制血栓形成或使血栓溶解，达到治疗血栓性疾病的目的。过去我国有些省批准的地方药品如蝮蛇抗栓酶、精制腹蛇抗栓酶、江浙腹蛇抗栓酶、东北白眉蝮蛇抗栓酶、五步蛇毒去纤酶及其注射剂，虽其名称不同，但主要成分一致，均属这类蛇毒蛋白水解酶，为同一种药物，2000年起国家药品监督管理局为统一管理，将其名称统一为降纤酶及注射用降纤酶，并制订了统一的局颁药品标准(标准号分别为WS1-XG-031-2000和WS1-XG-032-2000)。这类酶的分子量范围为28000至42000Dalton(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定)。发明内容
本发明的目的是为现今仅作为制备抗凝血剂的这类蛇毒蛋白水解酶提供一种新用途，即在制药领域中用以制备止血药剂；并开发其高纯度蛇毒蛋白水解酶用以制备止血药剂。
本发明将蛇毒蛋白水解酶中的降纤酶制成每次注射0.0005-1个降纤酶单位的止血剂；将纯度达95％以上的蛇毒蛋白水解酶(如尖吻蝮蛇凝血酶)制成每次注射1-2个凝血酶单位(一个凝血酶单位相当于在37±0.5℃条件下，使0.2ml标准人血浆在60±20秒内振摇，出现白色絮网的蛇毒凝血酶量)的止血剂。
本发明所用蛇毒最好从蛇岛蝮蛇Agkistrodon Shedaoensis(zhan)、江浙蝮蛇、尖吻蝮蛇Agkistrodon acutus(Guenther)或长白山白眉蝮蛇Agkistrodonhalys(ussriensis Emelianor)等蝮蛇中采集，再经提取或分离、精制得到，如国家药品监督管理局批准生产的降纤酶及注射用降纤酶(药品标准号分别为WS1-XG-031-2000和WS1-XG-032-2000)[其主成分分子量范围为28000至42000Dalton(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定)]，减小剂量制成注射剂，剂量按每次0.0005-1降纤酶单位给药；也可以是分子量位于该范围内、纯度高达95％以上地蝮蛇凝血酶(如尖吻蝮蛇凝血酶Heamocoagulase Agkistrodon)及注射剂[如注射用尖吻蝮蛇凝血酶Heamocoagulase Agkistrodon for Injection，其分子量为29000-29500Dalton(飞行质谱法测定)]，剂量按每次注射1-2个凝血酶单位。利用其小剂量给药时不大量消耗血液中的纤维蛋白原，而是将纤维蛋白原降解，释放出纤维蛋白肽A，并聚合成纤维蛋白多聚体，加速血管破损处血小板止血栓的形成，明显缩短出血时间，减少血液损失，起到止血作用的这一特性，将这类蛇毒蛋白水解酶用于须减少流血或止血的各种医疗情况下的出血及出血性疾病。
将蛇毒蛋白水解酶以0.0005-1降纤酶单位/次或1-2凝血酶单位/次作止血药制成注射剂(水针剂或粉针剂)；还可将这类蛇毒蛋白水解酶与镇痛剂抗菌剂如盐酸曲马多、盐酸加替沙星以及蛇毒中的有效镇痛成分等联合制成静脉或肌注用复方止血镇痛或止血抗菌注射水针剂或粉针剂。
本发明开拓了这类蛇毒蛋白水解酶的另一用途即制作止血药，具有止血快速、效果好的优点，而且制作工艺简单，成本低。附图说明
图1为本发明不同剂量蛇毒降纤酶对小鼠出血时间的影响的曲线图
如图1所示蛇毒降纤酶在0.0001-0.01降纤酶单位/kg范围内可使小鼠的出血时间明显缩短，而当剂量增大到3.0降纤酶单位/kg时，则明显延长了小鼠的出血时间。表明该酶大剂量使用时具有抗凝血作用，而小剂量使用时具有凝血作用。且其凝血作用与抗凝血作用的剂量差距较大，约在500至1000倍，这就保证了其作为凝血和抗凝血作用药物使用的安全性。
以下动物实验进一步证明蛇毒蛋白水解酶作为凝血剂的可行性.
表1.注射用蛇毒降纤酶对家兔纤维蛋白原含量(FIB)的影响(mg/dl、X±SD，n＝6)组别 剂量(U/kg) 给药前 给药后0.5小时 给药后1小时 给药后3小时对照组(阴性) Ns 318.6±37.82 312.4±45.04 309.8±58.36 338.2±47.35 0.0005 336.42±68.08 341.6±57.37 320.42±53.76 298.7±90.28样品组 0.0015 306.4±78.53 298.4±51.38 284.8±58.74 256.42±42.81 0.0045 329.42±37.88 331.7±63.48 318.8±54.04 279.8±37.82
表2.注射用蛇毒降纤酶对家兔血小板功能(TXB2)的影响(pg/ml、X±SD，n＝6)组别 剂量(U/kg) 给药前 给药后0.5小时 给药后1小时 给药后3小时对照组(阴性) NS 418.64±40.32 340.01±118.86 429.84±39.68 412.84±87.33 0.0005 381.66±75.83 422.54±38.96 449.63±20.82 418.65±30.64样品组 0.0015 419.84±38.42 413.87±20.32 455.86±13.48 398.44±49.63 0.0045 385.66±62.32 392.38±52.44 440.28±30.64 439.63±37.58
表3.高纯度蝮蛇凝血酶对小鼠剪尾出血时间的影响(X±SD，n＝10) 组别 剂量(μ/kg) 出血时间(秒) 对照组(阴性) 63.42±11.32 0.5 31.62±11.02** 样品组 0.25 35.11±10.38** 0.125 38.02±11.12**注：与阴性对照组比较**p＜0.01
表4.高纯度蝮蛇凝血酶对兔耳缘静脉出血时间的影响(X±SD，n＝6) 组别 剂量(μ/kg) 出血时间(min) 对照组(阴性) 6.08±0.52 0.20 3.02±0.38** 样品组 0.10 3.31±0.45** 0.05 3.90±0.52*注：与阴性对照组比较**p＜0.01，p＜0.05
表1、2是进一步从凝血原理上说明了蛇毒降纤酶在适宜剂量范围内确实能起到凝血作用，表1数据表明蛇毒降纤酶在合适剂量时，与阴性对照组(注射用生理盐水)相比能明显降低家兔血液纤维蛋白原含量，提示其促进纤维蛋白原降解，释放出纤维蛋白肽A，并聚合成纤维蛋白多聚体，而起到止血的目的；表2表明本品在合适剂量时，能明显增加TXB2含量，即增加血小板聚集功能，而起到止血的目的。表3、4是高纯度的蛇毒凝血酶—尖吻蝮蛇凝血酶对小鼠和家兔出血时间的影响情况，表明其在低剂量时同样可明显缩短出血时间，达到止血目的。具体实施方式
实施例1，称取蛇岛蝮蛇降纤酶5000单位，加赋形剂右旋糖酐或甘露醇等5000g，加注射水至50000ml，溶解，过滤后灌装于50000支西林瓶中，冻干。静脉、肌肉注射，每次注射1支。
实施例2，称取江浙蝮蛇降纤酶25单位，加稀释剂右旋糖酐或甘露醇等5000g，混匀，等量分装于50000支西林瓶中。静脉、肌肉注射，每次1支。
实施例3，称取蝮蛇降纤酶5000单位，溶解于50000ml注射用水中，过滤，然后灌装于50000支西林瓶中。静脉、肌肉注射，每次1支。
实施例4，准确称取长白山白眉蝮蛇蛇毒降纤酶(约5000单位)，加注射用水至50ml，溶解，测定其效价后备用。量取20％人血白蛋白注射液20ml，6％右旋糖酐20氯化钠注射液83ml，甘露醇30g，加注射用水850ml，搅拌均匀，用盐酸溶液调节pH值为6.0至6.5。精密量取降纤酶备用液适量(约相当于降纤酶100单位)，加入到上述辅料液中，搅拌均匀，加注射用水至1000ml。0.22μm滤膜过滤，测定其效价后，在洁净环境中按每只0.1U的量分装于洁净无菌的西林瓶，冷冻干燥成无菌粉末。静脉、肌肉注射，每次注射1支。
实施例5，称取纯度为96％的蝮蛇凝血酶原料药(如尖吻蝮蛇凝血酶)1000个单位和赋形剂右旋糖酐10g，置适宜容器中，加适量注射用水溶解混匀后，补加注射用水至500ml，用0.22微米的滤膜过滤，在洁净环境中分装，使每瓶含尖吻蝮蛇凝血酶1个单位，冷冻干燥成冻干无菌粉末。静脉、肌肉注射，每次注射1支。
实施例6，称取纯度为97％的蝮蛇凝血酶原料药(如尖吻蝮蛇凝血酶)1000个单位和赋形剂右旋糖酐4.0g，置适宜容器中，加适量注射用水溶解混匀后，用氢氧化钠溶液调节PH值为6至7，加注射用水至500ml，用0.22微米的滤膜过滤，在洁净环境中分装，使每瓶含尖吻蝮蛇凝血酶1个单位，冷冻干燥成冻干无菌粉末。静脉、肌肉注射，每次注射1支。
实施例7，取蛇毒粗品用PBS溶解，离心，取离心后上清夜进行透析，透析截留的溶液用DEAE-Sepharose CL-6B柱层析，层析后洗脱组分再透析，截流的溶液再次经DEAE-Sepharose CL-6B柱层析，收集氯化钠-PBS洗脱组分，经SephadexG-75柱层析去热原，再用SephadexG-25柱层析脱盐，即得高纯度蛇毒凝血酶原料药.
确证方法：(1)取本品，照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，其亚基分子量为16000(±2000)Dalton和14000(±2000)Dalton。
(2)取本品，用水制成1单位/毫升的溶液，作为供试品溶液；取小试管两支，各加入人血浆0.2毫升，置37±0.5℃的水浴中保温2分钟，加供试品溶液0.2毫升，置37±0.5℃的水浴中观察，溶液应在两分钟内凝结。加入5mol/L尿素溶液1毫升，振摇，凝块溶解呈澄清溶液。
实施例8，称取蛇毒降纤酶5000单位和盐酸曲马多5000克(或2500克)，加赋形剂右旋糖酐或甘露醇等5克，加注射水至50000ml，溶解，过滤后灌装于50000支西林瓶中，冻干。静脉、肌肉注射，每次注射1支。
实施例9，称取蛇毒降纤酶5000单位和盐酸曲马多5000克(或2500克)，加赋形剂右旋糖酐或甘露醇等约3克，混匀，等量分装于50000支西林瓶中。静脉、肌肉注射，每次1支。
实施例10，称取蛇毒降纤酶5000单位和盐酸曲马多5000克(或2500克)，溶解于50000ml注射用水中，过滤，然后灌装于50000支西林瓶中。静脉、肌肉注射，每次1支。
实施例11，准确称取蛇毒降纤酶(约5000单位)和盐酸曲马多5000克(或2500克)，加注射用水至50ml，溶解，测定其效价后备用。量取20％人血白蛋白注射液20ml，6％右旋糖酐20氯化钠注射液83ml，甘露醇2克，加注射用水850ml，搅拌均匀，用盐酸溶液调节pH值为6.0至6.5。精密量取降纤酶备用液适量(约相当于降纤酶100单位)，加入到上述辅料液中，搅拌均匀，加注射用水至1000ml。0.22μm滤膜过滤，测定其效价后，在洁净环境中按每只0.1U的量分装于洁净无菌的西林瓶，冷冻干燥成无菌粉末。静脉、肌肉注射，每次注射1支。
实施例12，称取高纯度蝮蛇凝血酶原料药(如尖吻蝮蛇凝血酶)1000个单位和盐酸曲马多5000克(或2500克)，加赋形剂右旋糖酐或甘露醇等2克，置适宜容器中，加适量注射用水溶解混匀后，补加注射用水至500ml，用0.22微米的滤膜过滤，在洁净环境中分装，使每瓶含尖吻蝮蛇凝血酶1个单位，冷冻干燥成冻干无菌粉末。静脉、肌肉注射，每次注射1支。
实施例13，称取纯度为95％的蝮蛇凝血酶原料药(如尖吻蝮蛇凝血酶)1000个单位和盐酸曲马多5000克(或2500克)，加赋形剂右旋糖酐或甘露醇等2克，置容器中，加350ml注射用水溶解混匀后，用氢氧化钠溶液调节PH值为6至7，加注射用水至500ml，用0.22微米的滤膜过滤，在洁净环境中分装，使每瓶含尖吻蝮蛇凝血酶1个单位，冷冻干燥成冻干无菌粉末。静脉、肌肉注射，每次注射1支。