牛乳腺炎疫苗的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别是涉及一种牛乳腺炎疫苗的制备方法。背景技术
在世界各地的奶牛场中，牛乳腺炎是一种严重和花费高的疾病。这种疾病通常在哺乳期的各个阶段都有发病的可能性，而50％的牛乳腺炎是在哺乳期的早期发病。在哺乳期的各个阶段，乳腺地分泌物都是一种适宜细菌生长的良好的培养基，当外界的细菌成功的穿过乳头和导管进入乳腺组织时，就会造成乳腺内感染发炎。
临床的牛乳腺炎的病例是由环境中细菌引起的，而且细菌牛乳腺炎的发病率最近几年的总的百分数有急剧上升的趋势。细菌是一种存在于环境中的微生物，。但是在奶牛产奶后，由于乳腺孔是开放的，极易引起乳腺的细菌的感染，进而引起牛乳腺炎的发生。革兰氏阴性菌是使牛奶产量减少，损害牛的健康，引起奶牛死亡的主要原因，而革兰氏阴性菌细菌引起牛乳腺炎的病例中又以大肠杆菌(E.coli)所引起的临床病例最为常见，大约60％的牛乳腺炎是由大肠杆菌(E.coli)所引起的。
目前国内外对牛乳腺炎的治疗是抗生素和疫苗，然而抗生素治疗牛乳腺炎存在诸多不利的因素：(1)易出现抗药性和耐药性；(2)单一药物抗菌谱不够广，影响疗效；(3)易造成牛奶中药物残留及奶牛体内药物蓄积，危及人类健康；(4)易引起其它的副作用，如奶牛的肠道菌群失调，影响食欲、胃肠功能以及生产性能等。基于此，许多年以来全世界的畜牧兽医研究人员一直致力于一种安全，有效，价格低廉的预防和治疗牛乳腺炎的药物的研究和开发。经过广泛的试验，各种牛乳腺炎疫苗在世界各地相继被开发和投入到生产使用中。这些牛乳腺炎疫苗均是采用传统的生产疫苗的方法，如加热、化学灭活(甲醛或酚)和照射等制备的，而这些方法均可对免疫原性造成一些损害，对于正确地刺激动物免疫系统必需的重要的表位/抗原有伤害。同时又产生一些替代的或“非天然”的疫苗抗原，这些化学物质必须从疫苗中除去，否则会造成环境健康和安全性的问题。同时这些用传统方法制备的牛乳腺炎疫苗的内毒素含量高，副作用大。
利用疫苗防治牛乳腺炎最常见的一个问题是细菌抗原的变异，即细菌利用免疫系统的抗体只识别非常特异的抗原并依次接合到细胞表面的特性，细菌不停地改变它们的表面结构，使得免疫系统在产生新的抗体时总是落后于细菌，造成了牛乳腺炎疫苗在第一年时效果良好，在第二年却不幸的失败。解决上述问题是提高免疫系统的能力，包括：(1)识别细菌不易改变的部分；(2)选择革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、沙门氏菌和白喉杆菌等)的通用结构。在对牛乳腺炎疫苗的研究开发的过程中，人们发现在所有的革兰氏阴性菌的细胞壁的内层都存在一个区域，内含通用核心通用抗原，在细菌生长的最快的时期(对数生长期)，这个部位暴露于免疫系统，且它含有革兰氏阴性菌的内毒素部分-脂质A，这样可以通过抗体结合内毒素达到减少内毒素的作用。利用这个原理，J5大肠杆菌(E.Coli)是最初采用核心通用抗原来制备牛乳腺炎疫苗。但是由于J5大肠杆菌(E.Coli)疫苗制备时采用的是传统的制备疫苗的方法，仍然有传统方法所有的一些弊端，并没有充分发挥出核心通用抗原大肠杆菌(E.Coli)疫苗的优势。
在微生物学的研究中，研究人员发现，革兰氏阴性菌在蔗糖-6果糖转移酶(sacB)存在，在蔗糖为底物诱导的情况下，可以杀灭自身，这种自杀方式并不需要改变自身的外膜蛋白(疫苗抗原或表位)，同时用来诱发这种灭活性质的化学物质是无毒的蔗糖。发明内容
本发明的目的在于提供一种牛乳腺炎疫苗的制备方法，即利用含有核心通用抗原的革兰氏阴性菌，通过含有蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因质粒的转化，在蔗糖的诱导下，使革兰氏阴性菌自杀，收集这些含有核心通用抗原的革兰氏阴性菌，制备疫苗的方法，它对疫苗的免疫原性没有损害，不会伤害正确地刺激动物免疫系统必需的重要的表位/抗原，不会产生替代的或非天然的疫苗抗原，所用的化学诱导物质是食用的无毒的蔗糖，不必从疫苗中除去这些诱导物。同时可以大大减少疫苗中的内毒素，减少死亡率，刺激免疫系统抵御全部的大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌所引起的牛乳腺炎。
本发明牛乳腺炎疫苗的制备方法包括以下步骤：
a.提取含有蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因的质粒；
b.制备革兰氏阴性菌感受态细胞；
c.转化步骤a中提取含有的蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因的质粒进入步骤b所制备的革兰氏阴性菌感受态细胞中；
d.鉴定，获得转化的革兰氏阴性菌；
e.已转化的革兰氏阴性菌在细菌培养基中生长直到浓度达到105-1012CFU/ml；
f.收集步骤e中的已转化的革兰氏阴性菌，室温，400g，离心20分钟；
g.弃上清液，用1-10％(体积比)的蔗糖和清洗物质清洗疫苗，重悬浮，在37℃下，混合20分钟，诱导自杀性蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因表达，混合物在400g，4℃下再次离心，弃上清液；
h.重复步骤g两次；
i.疫苗在清洗物质中被悬浮，按佐剂和疫苗体积比为3∶2的比例加入佐剂，使疫苗每一次免疫量的浓度为8.0×105CFU或以上。
本发明的优点是本发明牛乳腺炎疫苗的制备方法，由于采用核心通用抗原与自杀性革兰氏阴性菌结合的制备方法，不会对疫苗的免疫原性造成损害，不会伤害正确地刺激动物免疫系统必需的重要的表位/抗原，不会产生替代的或非天然的疫苗抗原，所用的化学诱导物质是食用的无毒的蔗糖，不必从疫苗中除去这些诱导物。同时制备的疫苗大大减少了传统制备疫苗方法象加热，或化学灭活(甲醛或酚)及照射可能产生的致癌疫苗的机会。同时可以大大减少疫苗中的内毒素，减少副作用，刺激免疫系统抵御全部的大肠杆菌，沙门氏菌等革兰氏阴性菌所引起的牛乳腺炎，进而有效的预防牛乳腺炎的发生。具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按常规条件中所述的条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例1：1.提取含有蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因的质粒
购买一株大肠杆菌(E.coli)DH5F’(ATCC #77281)，此菌株含有质粒pHSS21，它具有潮霉素抗性的标记和蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因，因而具有蔗糖的敏感性。参看(Schweizer，H.P.(1992)使用Coli1型载体和带有便携oriT和sacB标记物的暗盒进行青绿色假单胞菌等位基因交换，分子微生物学6(9)1195-1204)。利用常规的分子生物学方法，提取质粒pHSS21，做为下一步转化所用的质粒。2.制备大肠杆菌(E.coli)J5感受态细胞
(a)接种大肠杆菌(E.coli)J5到40ml的含有卡那霉素的TSA培养基上，在37℃培养条件下过夜培养；
(b)第二天，接种过夜的大肠杆菌(E.coli)J5培养物在40mlLB培养基的烧瓶中，过夜培养，直到OD600达到0.06；
(c)在37℃的水浴摇床中温育直到OD600达到0.6；
(d)在冰上冷却烧瓶，收集细胞，在4℃，4000g，离心15分钟；
(e)弃去上清液，在40ml冷却的双重蒸馏水中重悬沉淀，在4℃，4000g，离心15分钟；
(f)弃去上清液，在20ml冷却的双重蒸馏水中重悬沉淀，在4℃，4000g，离心15分钟；
(g)弃去上清液，在5ml冷却的10％的甘油中重悬沉淀，在4℃，4000g，离心15分钟；
(h)弃去上清液，在1ml冷却的10％的甘油中重悬沉淀，在4℃，4000g，离心15分钟；
(i)每50ul一等份贮存在离心管中，放在冰上5分钟，然后放在冰箱中冷冻保藏。3.转化步骤1中提取含有蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因的质粒进入步骤2所制备的大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞中
(a)在室温下轻轻的融化细胞，放在冰上；
(b)将下列4瓶细胞和质粒混合；
(1)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2ml具有卡那霉素抗性pHSS21质粒；
(2)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2ml具有氨卡青霉素抗性pUC19质粒；
(3)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2ml的重蒸无菌水；
(4)仅仅40ml的大肠杆菌(E.coli)J5感受态细胞；其中(2)(3)(4)为对照实验组。
(c)分别同时转移上述4瓶混合物到4个在冰上预冷电穿孔的小槽中；
(d)在200欧姆的电阻下，用1.8千伏电压电穿孔5微秒；
(e)迅速加1ml室温下的培养基SOC到电穿孔的小槽中，轻轻地，但迅速地重悬浮细胞；
(f)转移重悬浮的细胞到4个新的离心管中，在37℃，水浴摇床中温育1小时；
(g)将上述转化细胞涂抹平铺在合适的选择性培养基中，在37℃下温育过夜；
(1)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2mlpHSS21质粒的转化细胞涂抹平铺在具有卡那霉素抗性的TSA培养基中；
(2)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2mlpUC19质粒的转化细胞涂抹平铺在具有氨卡青霉素抗性的TSA培养基中；
(3)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2ml的重蒸无菌水的转化细胞分别涂抹平铺在具有卡那霉素抗性和氨卡青霉素抗性的TSA培养基中；
(4)40ml的大肠杆菌(E.coli)J5感受态细胞的转化细胞分别涂抹平铺在具有卡那霉素抗性和氨卡青霉素抗性的TSA培养基中。4.利用蔗糖敏感性检测转化细胞
1.分别加入3个怀疑是转化细胞的大肠杆菌(E.coli)克隆到3个50ml含有卡那霉素的TSB的培养基中，37℃下温育20小时；
2.转移1ml过夜的培养物到50ml含有卡那霉素的TSB的培养基中；
3.记录培养物的OD580值，把培养物放在37℃的水浴摇床中培养；
4.当OD580增加10倍时，在2000g，离心10分钟；
5.弃上清液，在13ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的缓冲液中重悬浮沉淀；
6.在2000g，离心10分钟，沉淀菌体；
7.在10ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的缓冲液中重悬浮沉淀。
8.加34.5ul样品到1ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的缓冲液中，测培养物的OD620值。
9.调整所得到的液体培养物达到1×107CFU/ml；
10.取10ml样品，用10mM Na3PO4(PH7.4)的缓冲液稀释10倍，加入蔗糖使蔗糖的最终浓度为1.0，2.5，5.0，10.0％。
11.在37℃培养，在30，60，90，120分钟时取样，放在TSB平板中检测，若没有克隆菌落生长，可初步断定是转化细胞。
12.取上述初步判定的对数生长期的转化细胞，在500ml卡那霉素的TSB培养基中培养；
13.在摇床中温育上述培养物，直到培养物达到一个稳定生长状态，即可见光的吸收密度值OD600不再增加；
14.在每个样品中加入蔗糖使蔗糖的最终浓度为1.0，2.5，5.0，10.0％；
15.在37℃的水浴摇床中培养。
16.在30，60，90，120分钟时取样0.25ml加入2ml的含有卡那霉素的浓度为35g/ml的TSB培养基中。
17. 37℃，温育样品过夜，第二天测样品的可见光的吸收密度值OD600，进一步判断转化细胞。
结果表明：在转化细胞生长到对数生长期后，加入诱导自杀的蔗糖的最终浓度范围是1-10％，优选的蔗糖最终的浓度范围是2.5％-5.0％，制备疫苗的最佳的时间是加入蔗糖以后30-120分钟，优选的制备疫苗的最佳的时间是加入蔗糖以后60-90分钟。5.挑选上述判定的已转化的大肠杆菌(E.coli)J8，在胰酶解酪蛋白-大豆培养基中生长，当转化的大肠杆菌(E.coli)J8浓度达到105-1012；6.收集步骤5中的J8大肠杆菌，室温，400g，离心20分钟；7.弃上清液，用2.5-5％(体积比)的蔗糖和无菌的非热的盐，重悬浮疫苗，在37℃下，混合20分钟，混合物在400g，4℃下再次离心，弃上清液；8.重复步骤7两次；9.疫苗在无菌的非热的盐被悬浮，按佐剂和疫苗体积比为3∶2的比例加入佐剂，使疫苗每一次免疫量的浓度为6.0×109CFU。
为了更好地理解本发明的实质，下面结合具体的试验来说明本发明牛乳腺炎疫苗的制备方法在减少内毒素、副作用、抗革兰氏阴性菌的广普性、疫苗的安全性及预防牛乳腺炎方面的有益效果。试验1：用鲎阿米巴样细胞裂解物检测(LAL)方法检测疫苗中内毒素(EU)的含量
在疫苗自杀灭活后，用无菌的非热源的盐(sterile，nonpyrogenic saline)洗制备的疫苗3次，用鲎阿米巴样细胞裂解物检测(LAL)方法检测本发明制备疫苗在用无菌的非热源的盐(sterile，nonpyrogenic saline)洗前洗后及与3种常用的牛乳腺炎革兰氏阴性菌疫苗中内毒素(EU)的含量的平均值。
检测结果如表1：
表1：几种牛乳腺炎疫苗的内毒素(EU)的含量 牛乳腺炎疫苗名称 剂量 (ml) 内毒素含量 (EU/ml)本发明方法制备的疫苗洗前 5 500,000本发明方法制备的疫苗洗后 5 49,000其它方法制备的革兰氏阴性菌疫苗产品(平均) 5 2,630,000
试验结果表明：用本发明的方法制备的牛乳腺炎的疫苗的内毒素通过用无菌的非热源的盐(sterile，nonpyrogenic saline)洗3次以后，游离的内毒素的含量减少了大约90％左右。每毫升的疫苗中内毒素的含量不到50,000EU，且大大低于传统制备疫苗方法中内毒素的平均水平。试验2：牛乳腺炎疫苗的免疫保护试验
选用6头奶牛为试验组，3头奶牛做对照，用本发明制备的疫苗免疫接种，接种时间分别是干奶期，干奶中期，和产小牛后两周内每次皮下注射2ml，之后接种大肠杆菌(E.Coli)300CFU，进行免疫保护试验。在接种病原菌7天后，立刻观察临床症状和培养有无细菌出现，若有细菌出现，通过标准的微生物学技术鉴定。
试验结果表明，对照组的3头奶牛都出现了临床症状，且其中一头在免疫保护7天后，因为严重的症状，不得不实施安乐死。而试验组在接种12小时后，出现了临床症状，其中5头奶牛恢复正常状况，没有一头奶牛死亡。对照组的3头奶牛在病圈中平均天数是7天，而试验组在病圈中的天数是3天，利用抗生素治疗使患乳腺炎的奶牛恢复健康的天数是14天，而利用疫苗治疗的天数是8天。具体的对比试验结果见表2：
表2：免疫保护7天后牛乳腺炎疫苗的免疫效果试验组别7天后牛乳腺炎临床 症状减少率(％) 在病圈中的 平均天数抗生素治疗 的平均数对照组 0 7 14试验组 83 3 8试验3：牛乳腺炎疫苗减少副作用(安全性)试验
a.用3头4个月的奶牛，它们在临床上是健康的，即正常的体温，正常的白细胞数，食欲良好，正常的粪便。在免疫接种前记录它们的直肠的体温。皮下接种疫苗标签剂量的10倍，72小时观察奶牛有无不良反应。在72小时内未发现被试验的奶牛有异常的现象。
b.用3组，每组6头怀孕6-7月的小母牛以疫苗标签数量皮下接种疫苗，每周接种疫苗一次，连续三周。在第三次接种一周以后，通过直肠触诊确认试验的动物是否仍在怀孕，结果表明，3组试验中，只有一组有1头怀孕6-7月的小母牛流产。
试验结果表明，本疫苗是安全的。试验4：利用酶连免疫吸附反应(ELISA)检测J8疫苗的血清学反应
选用20头12个月，健康的正常食欲的母牛，4组，每组5头，用牛乳腺炎疫苗J8进行阳性血清学反应试验。在免疫接种前，取每头试验动物的血清，每份血清3等份，在40℃或更底温度下冷藏。以不同的剂量皮下接种疫苗，每周接种疫苗一次，连续三周。在最后一次免疫后一周，取每头试验动物的免疫后血清，每份血清3等份，通过酶连免疫吸附反应检测免疫后免疫球蛋白(IgG和IgM)的ELISA值。表3酶连免疫吸附反应(ELISA)检测疫苗的血清学反应试验结果试验组别免疫总剂量 (CFU)免疫前IgG的ELISA效价值免疫后IgG的ELISA效价值 1 5.0×1010250 22600 2 6.0×109234 16280 3 8.0×105200 1117 4 8.2×103226 318试验结果表明：在4组免疫动物中都产生了免疫球蛋白的抗体，接种J8疫苗后，免疫球蛋白IgG的ELISA值最多是免疫前的90倍。可以看出，J8疫苗能产生有效免疫效果的CFU最小的含量是8.0×105，优选的CFU含量范围是8.0×105-5.0×1010，更优选的CFU含量范围是6.0×109。试验5：交叉反应免疫吸附试验
取来自于试验4的第3组的J8免疫血清，用酶连免疫吸附反应(ELISA)测定抗大肠杆菌抗体与革兰氏阳性和阴性细菌的交叉反应免疫吸附。试验结果见表4
表4J8牛乳腺炎疫苗和革兰氏阴性菌的
交叉反应免疫吸附(IgG ELISA)试验结果 被检测的微生物 IgG ELISA吸附的百分率％ 大肠杆菌J8 100 大肠杆菌O157：H7 92 大肠杆菌O11B：4 90 鼠伤沙门菌 95 绿脓假单胞菌 67 鼻肺炎克雷伯杆菌 63 粘质沙雷菌 71 多杀巴斯德菌 74
试验结果表明，通过本发明方法制备疫苗产生的抗体可以和其它广阔范围的革兰氏阴性菌产生交叉反应抗体，证明了通过本发明试验方法制备的牛乳腺炎J8疫苗对革兰氏阴性菌是通用的。