生物活性骨组织诱导再生膜及其制备方法 一、技术领域
本发明属于医用材料及其制备方法技术领域，具体涉及一种可诱导骨组织再生的医用生物膜材料及其制备方法。
二、背景技术
临床上因各种原因所致的组织缺损十分常见，为了给缺损组织自身修复提供再生空间，达到形态和功能重建的目的，临床上通常是在缺损组织部位与其它组织之间设置一生物隔膜。一般而言，用于机体内的生物隔膜除能对不同组织起分隔屏障作用外，还要求相容性好，并且能够在体内降解。但随着医学材料技术的不断发展和临床上使用要求的提高，人们还希望获得同时具有组织诱导活性的隔膜。
目前，市场上所见的国外产品主要有：一、用单一的聚四氟乙烯材料制成的延展型、微孔型、扩展型隔膜和与钛支架网复合的加强型隔膜。这类产品由于在体内均不能降解，因而在其行使功能后，需进行二期手术取出，使用麻烦，且给人体带来二次痛苦。二、用枸橼酸酯软化聚乳酸制成的双层膜，由纯I型、III型猪胶原纤维构成紧密层和疏松、多孔层膜，由冻干脊膜与I型牛胶原纤维复合成的PG910织膜以及聚乙聚丙交酯共聚物膜。这类膜虽可在体内降解，但不具有组织诱导活性。
而目前已有的文献上报道的医用隔膜也如国外产品一样可大致分为两类：一类是在体内不降解的，如审定公告号为1039590的中国专利“医用防粘连硅橡胶膜”。另一类是在体内可降解的，如审定公告号为1088382的中国专利“医用材料及其制备方法”，该材料是用胶粘剂相互粘着的并具有插入其间的网状介质材料的两片胶原膜构成；审定公告号为1086145的中国专利“组织引导再生胶原膜”，其特征是以动物胶原蛋白为原料，经溶胀、成型、交联和干燥步骤制成；审定公告号为2304399地中国专利“医用缓降解型网状胶原膜”，这种胶原膜是由胶原纤维构成的有孔立体网状结构，外形呈海绵状；申请号为CN00112783的“医用防粘连膜”，该膜含有的聚乳酸为50～100％，医用增塑剂为0～50％。这两大类膜与国外产品一样仅具有医用膜的基本性能，同样不具有组织诱导性。
三、发明内容
本发明的目的是克服已有技术存在的缺陷，提供一种不仅相容性好、可在体内降解和具有分隔屏障作用，而且还具有骨组织诱导再生性的生物活性复合膜。
本发明的另一目的是提供上述具有骨组织诱导再生性的生物活性复合膜的制备方法。
本发明提供的生物活性骨组织诱导再生膜为二层复合结构，其中一层为聚乳酸，其特征在于另一层为胶原纤维与生物活性因子重组人基因骨形成蛋白构成的混合物。所用的胶原纤维选自猪胶原纤维或牛胶原纤维。所用的生物活性因子重组人基因骨形成蛋白选自生物活性因子重组人基因骨形成蛋白-2，1，7中的任一种。
使用时将该膜含生物活性因子重组人基因骨形成蛋白一面植入机体内的非骨部位，可诱导生出软骨，并逐渐骨化为成熟骨。
本发明提供的生物活性骨组织诱导再生膜中生物活性因子重组人基因骨形成蛋白的含量为2～8mg/cm2，因为本发明人发现低于2mg/cm2骨诱导作用差，效果不好，而高于8mg/cm2，又要形成浪费，加之生物活性因子重组人基因骨形成蛋白价格昂贵，因而从经济性来看也是不合理的。
另外，本发明人根据生物活性骨组织诱导再生膜的使用环境和目的对其结构形态进行了设计，即聚乳酸层的外表面为光滑状，而胶原纤维与生物活性因子重组人基因骨形成蛋白混合层的外表面为网孔状，孔径约为15～20μm，见附图。这种设计是基于聚乳酸层主要起隔离屏障作用，以阻隔周围其它组织对缺损部位，尤其是成纤维细胞的干扰侵袭，光滑面更能达到此目的；而胶原纤维与生物活性因子重组人基因骨形成蛋白混合层主要起骨诱导再生作用，由于加入的胶原纤维除能将生物活性因子重组人基因骨形成蛋白附着在聚乳酸基膜上外，还有控制其释放速度的功效，为了使隔膜使用前期释放的生物活性因子重组人基因骨形成蛋白较多，增强诱导效果，因而需要增大释放面，以使短期内达到诱导浓度，同时，还希望其具有稳定凝血块的作用，这一切网孔面均可满足要求。
本发明提供的上述生物活性骨组织诱导再生膜的制备方法，是先将聚乳酸加入溶剂中，并在室温下经溶胀→搅拌溶解→脱泡后，倒入平板模上平淌流延成膜，再逐步室温挥发、真空干燥去除溶剂，其特征在于：
(1)在已制成的聚乳酸膜的一面，划痕粗化处理后，均匀涂布浓度为1～3％的胶原纤维溶液，室温下自然晾干1～2天；
(2)将生物活性因子重组人基因骨形成蛋白加入到浓度为1～3％的胶原纤维溶液中混合均匀，再涂布到已涂有胶原纤维一面的膜上，然后将其在-60℃至-40℃下冷冻10～12小时后，放入真空干燥器中真空干燥6～8小时，脱模即成。
其中涂布在有胶原纤维一面膜上的混合液中加入的生物活性因子重组人基因骨形成蛋白与胶原纤维的配比为1∶1～8；划痕粗化处理是用尖状物，如探针在聚乳酸膜面上进行，使之形成深度为1～10微米呈交错状的划痕。另外，为了使该膜能够在植入体内后六个月能完全降解吸收，本发明选用的聚乳酸的粘度为3.20～3.80。
本发明中聚乳酸所用溶剂是已有技术公知的乙酸乙酯、氯仿或丙酮中的任一种；胶原纤维所用溶剂是已有技术的醋酸或水，这些都是这一领域技术人员公知的知识。
用本发明提供的方法制备的生物活性骨组织诱导再生膜，膜厚100～150μm；在温度24℃，相对湿度50％，拉伸速度50mm/min的条件下，拉伸强度32.0～38.0MPa，断裂伸长率1.5～3.5％；在37℃的KH2PO4-Na2HPO4的缓冲液中，12个月膜完全降解；植入动物体内膜形态保持2～3个月，6个月膜完全降解吸收，膜周围未见明显炎性细胞，所植入的外骨部位能形成软骨，并逐渐骨化为成熟骨。
本发明具有以下优点：
1、本发明提供的这种生物活性骨诱导再生膜除具备临床所期待的一系列基本性能外，还具有骨诱导活性，因而为骨损伤机体的尽快恢复提供了可能，也必然对临床学科和生物材料学领域产生深远的影响和重要的学术价值。
2、本发明提供的这种生物活性骨诱导再生膜适用范围广，可用于骨科、颅、颌面外科、牙种植科、牙周外科、修复重建外科等多个临床学科，具有巨大的社会效益和经济效益。
3、本发明提供的制备方法简单，工艺成熟，易于控制。
四、附图说明
附图为本发明提供的生物活性骨诱导再生膜胶原纤维与生物活性因子重组人基因骨形成蛋白混合层的外表面的扫描电子显微镜照片。
五、具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域技术熟练人员根据上述本发明内容作出的一些非本质的改进和调整，仍属本发明的保护范围。本发明及以下实施例所用浓度均为重量百分浓度。
实施例1
用天平称取2克粘度为3.51的聚乳酸，加入到40ml的乙酸乙酯中，并在室温下溶胀12小时，搅拌溶解1小时，脱泡1小时后，倒入10×10cm的平板模，本实施例选用的是平板玻璃模上平淌流延成膜，然后放入半封闭容器中缓慢挥发乙酸乙酯1天，再敝开挥发2天后于70℃下真空干燥8小时，以去除残留的乙酸乙酯。
在将已制成的聚乳酸膜分离膜四周而不脱模的条件下，用探针划痕粗化处理，使膜面上形成深度为1～10微米呈交错状的划痕，然后将牛胶原0.5克用0.01M的醋酸溶解并配成3％浓度的胶原液均匀涂布在有划痕的膜面上，于室温下自然挥发晾干2天。
将0.5克生物活性因子重组人基因骨形成蛋白-2的冻干粉，加入到用0.5克牛胶原与0.01M的醋酸配成的浓度为3％的胶原液中混合均匀，再涂布到已涂有胶原纤维一面的膜上，然后将其放入冰箱在-60℃下冷冻10小时后，放入真空干燥器中真空干燥6小时，脱模即获得含生物活性因子重组人基因骨形成蛋白5mg/cm2的骨组织诱导再生膜。
因该膜需植入体内，故通常还需根据要求裁剪成适当大小的块状、封装，并经环氧乙烷消毒备用。
实施例2
用天平称取3克粘度为3.32的聚乳酸，加入到50ml的乙酸乙酯中，并在室温下溶胀15小时，搅拌溶解2小时，脱泡1小时后，倒入14×14cm的平板模，本实施例选用的是平板玻璃模上平淌流延成膜，然后放入半封闭容器中缓慢挥发乙酸乙酯2天，再敝开挥发1天后于60℃下真空干燥6小时，以去除残留的乙酸乙酯。
在将已制成的聚乳酸膜分离膜四周而不脱模的条件下，用探针划痕粗化处理，使膜面上形成深度为1～10微米呈交错状的划痕，然后将猪胶原1.0克用0.01M的醋酸溶解并配成1％浓度的胶原液均匀涂布在有划痕的膜面上，于室温下自然挥发晾干1天。
将0.4克生物活性因子重组人基因骨形成蛋白-1的冻干粉，加入到用3.0克猪胶原与0.01M的醋酸配成的浓度为1％的胶原液中混合均匀，再涂布到已涂有胶原纤维一面的膜上，然后将其放入冰箱在-50℃下冷冻12小时后，放入真空干燥器中真空干燥8小时，脱模即获得含生物活性因子重组人基因骨形成蛋白2mg/cm2的骨组织诱导再生膜。
因该膜需植入体内，故通常还需根据要求裁剪成适当大小的块状、封装，并经环氧乙烷消毒备用。
实施例3
用天平称取3克粘度为3.78的聚乳酸，加入到100ml的乙酸乙酯中，并在室温下溶胀18小时，搅拌溶解2小时，脱泡2小时后，倒入14×14cm的平板模，本实施例选用的是平板玻璃模上平淌流延成膜，然后放入半封闭容器中缓慢挥发乙酸乙酯2天，再敝开挥发2天后于80℃下真空干燥10小时，以去除残留的乙酸乙酯。
在将已制成的聚乳酸膜分离膜四周而不脱模的条件下，用探针划痕粗化处理，使膜面上形成深度为1～10微米呈交错状的划痕，然后将牛胶原1.0克用0.01M的醋酸溶解并配成2％浓度的胶原液均匀涂布在有划痕的膜面上，于室温下自然挥发晾干1天。
将1.2克生物活性因子重组人基因骨形成蛋白-7的冻干粉，加入到用1.5克牛胶原与0.01M的醋酸配成的浓度为2％的胶原液中混合均匀，再涂布到已涂有胶原纤维一面的膜上，然后将其放入冰箱在-80℃下冷冻12小时后，放入真空干燥器中真空干燥8小时，脱模即获得含生物活性因子重组人基因骨形成蛋白6mg/cm2的骨组织诱导再生膜。
因该膜需植入体内，故通常还需根据要求裁剪成适当大小的块状、封装，并经环氧乙烷消毒备用。