一种抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂及其制备方法，属中药领域。技术背景
肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病，据统计，1999年全球共有各类肿瘤患者约3000多万人，在我国约有400多万人，随着工业化程度的加快和水源以及空气环境污染的不断加重，恶性肿瘤的发病率正以3％的年递增率递增。
药物治疗(化疗)是目前临床肿瘤治疗最有效的手段之一。现今用于肿瘤治疗的化学治疗药物有百余种，这些化学治疗药物虽能在一定程度上控制肿瘤的发展，延长肿瘤患者的生存时间，但治愈率仍很低。此外，目前所有这些化学治疗药物，其选择性作用普遍较差，对机体造血系统、肝脏、肾脏、心脏等毒副作用均很强，晚期肿瘤患者甚至很难接受。因此，对疗效好、毒副作用低的治疗肿瘤药物仍存在很大需求。
毛兰素为联苄类化合物，其结构式名称为3-羟基-4，3′，4′，5′-四甲氧基联苄，分子量318，其英文名为erianin或dihydrocombretastatin A-4，溶于有机溶剂，极微溶于水。二十世纪90年代初，Cushman，M.等人(Cushman，M.等，J MedChem。1991，34，2579-2588)通过体外细胞培养的方法研究发现，毛兰素对体外培养的人体肺腺癌细胞株A-549、乳腺癌细胞株MCF-7、结肠癌细胞株HT-29、白血病细胞株MLM等的生长均有抑制作用，其作用机制与抑制微管蛋白聚合、抑制新生血管形成、收缩血管减少组织血流量等有关。然而到目前为止，还没发现单用毛兰素或以毛兰素为组合物的抗肿瘤药物的报道。
另外，如上所述，毛兰素具有溶于有机溶剂，极微溶于水的物理性质，因此，若将其制成水溶性的口服制剂或供注射用的粉针剂或水针剂，势必用量体积大，临床使用十分困难。当然，也可以将毛兰素先制成毛兰素盐的形式，达到增加其在水中的溶解度，再将毛兰素盐制成水溶性的口服制剂或供注射用的粉针剂或水针剂，这样做，从技术角度看虽然可行，但工艺相对较为复杂，成本也较高。本发明依据毛兰素溶于植物油等有机溶剂地性质，将其制成油与水能均匀混合的脂肪乳剂，解决了不需要以毛兰素盐的形式，而是直接将毛兰素制成可供口服或供注射、使用方便的脂肪乳剂药物。发明内容
本发明包括两项内容：(1)一种抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂；(2)一种抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂的制备方法。
一、一种抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂
本发明依据毛兰素溶于有机溶剂、微溶于水，极性较低等理化性质特点，并根据药效学研究静脉给药能最大限度发挥其抗肿瘤生物活性的特点，将其制备成可供注射用脂肪乳剂。
本发明一种抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂，它主要包含抗肿瘤有效量的活性成分毛兰素、可药用的植物油、乳化剂、渗透压调节剂和水。毛兰素溶解在植物油中。
活性成分毛兰素是从中药材石斛中提取的提取物，它可以通过采取“一种石斛中提取毛兰素的方法”(申请号为03115752.1，申请日为2003年3月12日的发明专利申请文件中作了详细的叙述)而获得，但这不是获得毛兰素的唯一方法和唯一来源。
制备脂肪乳剂的可药用的植物油一般选自大豆油、玉米油、芝麻油、橄榄油、亚麻子油、藏红花油以及这些油的混合物，也可以用甘油三脂肪酸酯，本发明实施例中植物油选用大豆油。
可药用的乳化剂可以用大豆磷脂或卵磷脂，本发明实施例中乳化剂选用大豆磷脂。
可药用的渗透压调节剂可选用甘油、葡萄糖、甘露醇、山梨醇以及这些调节剂的混合物，本发明实施例中渗透压调节剂选用的是甘油。
本发明药物毛兰素脂肪乳剂的各组分的用量和质量应当符合药学的一般标准。为了保证本发明抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂达到注射用标准，其所有组分包括活性成分毛兰素、水、植物油、乳化剂、渗透压调节剂以及其它用料，都应当同时达到注射用标准。
前文所述的活性成分毛兰素的“抗肿瘤有效量”，是指毛兰素脂肪乳剂中含有能够有效地治疗肿瘤的毛兰素的量。由于给药对象不同，体重不同以及每人对药物的反应不同，该有效剂量也不同。但从产品的角度看，该有效剂量取决于产品中毛兰素的浓度和给予产品的体积。产品中毛兰素的浓度可在合适的范围内变化，浓度变化的范围取决于毛兰素在所用植物油中的溶解度、给药量、给药的体积以及人对可药用植物油和乳化剂大豆磷脂或卵磷脂的最大耐受的限度等。据此，本发明毛兰素脂肪乳剂中毛兰素的浓度可在1-3.8mg/ml范围内。再结合患者的给药量、给药体积以及人对大豆磷脂或卵磷脂和可药用植物油的耐受程度，以2.0mg/ml为优选浓度。
在本发明抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂的组分中，植物油是抗肿瘤活性成分毛兰素的溶媒，由于植物油种类繁多，不同种类的植物油其极性又各有不同，因此毛兰素在不同种类的植物油中的溶解度亦有差别。鉴此，为了使毛兰素脂肪乳剂中活性成分毛兰素达到“抗肿瘤有效量”，所以不同种类的植物油在用量范围上可以存在一定的差异。在本发明实施例中，植物油选用大豆油，其合理用量应在100-250mg/ml之间，优选用量为200mg/ml。
为保证毛兰素脂肪乳剂的乳化质量和稳定性，在本发明的抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂中，乳化剂的用量与植物油的用量应当匹配。在本发明实施例中，植物油选用的大豆油与乳化剂选用的大豆磷脂的合适比例约为1∶0.06，相应地，乳化剂匹配用量约为6-15mg/ml，优选用量为12mg/ml。此外，由于不同种类的乳化剂乳化能力有差别，在用量上也应有所不同。
在本发明的抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂组分中，渗透压调节剂其作用是使本发明抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂的渗透压调节至人的正常生理范围内。一般来说讲，不同的渗透压调节剂由于其分子大小和极性不同，即使相同重量，不同渗透压调节剂所产生的渗透压也可不同。同时还必须注意，在本发明抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂中，其它组分(如抗肿瘤活性成分、植物油、乳化剂等)对渗透压也产生一定影响，鉴于以上原因，每种渗透压调节剂的用量须根据毛兰素脂肪乳剂中其它组分的用量以及该种所选定的渗透压调节剂的分子大小和极性强弱而定；在本发明实施例中，为了使本发明的抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂的渗透压在人正常生理范围内，所选用的渗透压调节剂甘油其合适用量为18-25mg/ml，优选用量为22mg/ml。
综上所述，本发明药物毛兰素脂肪乳剂的一般处方是：
活性成分毛兰素 1-3.8g
大豆油 100-250g
大豆磷脂 6-15g
甘油 25-18g
注射用水 加至1000ml
其优选处方是：
活性成分毛兰素 2.0g
大豆油 200g
大豆磷脂 12g
甘油 22g
注射用水 加至1000ml
在本发明抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂中，还可以含有其它的抗肿瘤活性成分，借此可以提高疗效、降低毒副作用以及扩大应用范围，如包含紫杉醇、卡铂、环磷酰胺、氟尿嘧啶、阿霉素等已知的抗肿瘤活性成分。
此外，在本发明抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂中，也可以加入抗氧化剂如维生素E、抗坏血酸等；也可以加入增加乳粒表面ζ电势，提高毛兰素脂肪乳剂稳定性的稳定剂，如油酸、胆酸、脱氧胆酸及其它们相应的盐。
本发明的抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂可以通过注射或口服的方式给药，用作肿瘤的治疗。本专业的技术人员可根据患者的实际情况，依据毛兰素脂肪乳剂中毛兰素的浓度和患者单位体重用药量(如20mg/kg)或单位面积用药量(如100mg/m2)，很容易确定给药的剂量。
本发明抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂可以用以下所述工艺制备而得。
二、一种抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂的制备方法
本发明抗肿瘤药物毛兰素脂肪乳剂的制备方法其内容包括处方和工艺，其处方已如上所述，其制备工艺包括如下步骤：
(1)按处方称取各组分备用；将活性成分毛兰素溶解在植物油中(必要时水浴加温溶解)，得油相溶液；
(2)将乳化剂用适量预热的注射用水完全溶解，再加入渗透压调节剂，混合均匀，得水相溶液；
(3)向上述制备的水相溶液内通入超纯氮气，打开搅拌机高速搅拌，边搅拌边向其中滴加上述制备的油相溶液，滴加完毕后再搅3-5分钟，得乳白色较为均匀的初乳。
(4)将初乳加入高压均质机内，打开空气泵，调节高压均质机压力至83-138MPa，待压力稳定后开始高压均质，收集经高压均质的乳液；将其静置到室温，补加注射用水至处方总量，混合均匀，即得乳白色均一的毛兰素脂肪乳剂。
(5)用碱溶液调节其PH值至8.5-9.5；在通超纯氮气的条件下，滤过、分装、密封，最后湿热灭菌，即得可供注射用的毛兰素脂肪乳剂成品。
在上述含毛兰素的油相溶液的制备过程中，为了节省时间，必要时可采取水浴加热的方式加速毛兰素在可药用植物油中的溶解，水浴温度可在60-80℃之间。
上述的乳化剂大豆磷脂和卵磷脂在加热或暴露在空气中极容易氧化，为避免或减少乳化剂的氧化，在上述毛兰素脂肪乳剂的制备过程中，至少应从步骤(2)制备水相溶液开始至步骤(5)分装前的操作均需在通氮气的条件下进行。
在本发明中，上述初乳的制备可采用高速搅拌法，搅拌速度在8000-20000转/分钟之间，优选的搅拌速度为15000-18000转/分钟之间。
在高压均质时，均质压力可在83-138Mpa范围内，优选压力在96-120Mpa之间。该均质方法不排除采用二步高压均质的方法，关于二步高压均质的均质压力等各个参数，本专业技术人员对此很容易调整。具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限在这些实施例中。
实施例1
称取毛兰素2.0g，注射用大豆油200g，注射大豆磷脂12g，注射用甘油22g，注射用水适量。将毛兰素加入到注射用大豆油中，置于70℃的恒温水浴中水浴，使其完全溶解，得油相溶液；将注射用大豆磷脂用适量预热至70℃的注射用水完全溶解，再加入注射用甘油，混合均匀，得水相溶液；向上述水相溶液内通入超纯氮气，打开搅拌机，以18000转/分转速搅拌，边搅拌边向其中滴加上述制备好的油相溶液，滴加完毕后再继续搅拌5分钟，得乳白色较为均匀的初乳。
再将初乳溶液加入到高压均质机的料斗内，打开空气泵开关，调节高压均质机压力至110MPa，待压力稳定后进行高压均质；收集经高压均质的乳液，将其静置到室温，补加注射用水至1000ml(在本实施中实际用水约769ml)，混合均匀，即得乳白色均一的毛兰素脂肪乳剂。
向上述制得的毛兰素脂肪乳剂中滴加0.1M的氢氧化钠溶液，调节其PH值至8.5；滤过，在通超纯氮气的条件下，将其分装于输液瓶内，扎盖密封，置于湿热灭菌器内120℃灭菌30分钟，得可供注射用的毛兰素脂肪乳剂成品。
实施例2、3
实施例2、3的工艺步骤与例1完全相同，其处方中各组分及用量、工艺中参数如表1所示：
表1各实施例中所用的组分、分量及压力参数实施例1实施例2实施例3处方活性成分毛兰素2g毛兰素1g毛兰素3.8g植物油大豆油200g大豆油100g大豆油250g乳化剂大豆磷脂12g大豆磷脂6g大豆磷脂15g渗透压调节剂甘油22g甘油25g甘油18g水加至1000ml同例1同例1 均质机压力110MPa83MPa138MPa 备注优选值下限值上限值
在上述实施例中，所用的注射用大豆油，也可用注射用玉米油、芝麻油、橄榄油、亚麻子油、藏红花油、甘油三脂肪酸酯等油溶剂及其混合物来替换；所用的注射用大豆磷脂亦可用注射用卵磷脂或两者混合物来替换。
采用本发明制得的毛兰素脂肪乳剂，经检测其质量外观均一，呈乳白色液状，PH为6.8-7.3(灭菌后的PH值)，渗透压在人的正常的生理范围内，粒径1um以下占80％，粒径在5um以上的未检出，无菌，内毒素等质量指标符合中华人民共和国药典相关规定。3个月加速实验和一年的室温下稳定性试验表明质量稳定。
以下通过试验例来进一步阐明本发明药物毛兰素脂肪乳剂的有益效果，这些试验包括体外抗肿瘤试验和体内抗肿瘤试验。[试验例1]体外法抗肿瘤试验：1、试验材料：
试验药品毛兰素脂肪乳剂(浙江天皇药业有限公司提供)；阳性对照品阿霉素(浙江海正药业有限公司产品)；肿瘤细胞株：白血病细胞株HL-60，肺腺癌细胞株A-549，结肠癌细胞株HCT-116，肝细胞性肝癌细胞株BEL-7402，乳腺癌细胞株MCF-7。2、试验方法：
分别将一定数量的上述肿瘤细胞株接种在96孔的培养板，悬浮生长细胞在接种后立即加药，，贴壁生长细胞接种培养24小时待其贴壁后再加药。试验药品毛兰素脂肪乳剂设8或10个作用浓度，每个浓度设8个复孔。另设无细胞调零孔、相应的溶媒作为阴性对照孔和阿霉素阳性对照孔。
悬浮生长细胞采用MTT法测定。药物作用48小时后，加入MTT工作液(5mg/ml，Sigma)，每孔20ul；37℃作用4小时，再加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/L HCl)；37℃作用12-20小时后，在酶标仪上于570nm波长处测定OD值；贴壁生长细胞采用SRB法测定。药物作用72小时后，倾去培养液，加10％TCA，每孔100ul，4℃固定1小时；倾去固定液，用蒸馏水洗5次，自然干燥。再加SRB工作液(4mg/ml，Sigma)，每孔100ul，室温染色15分钟，弃去染液，用1％的冰醋酸洗5次，自然干燥。最后加入Tris缓冲液，每孔150ul，摇匀，酶标仪上于515nm波长处测定OD值。按下列公式计算细胞增殖生长抑制率：
抑制率(％)＝(OD值对照空-OD值给药孔)/OD值对照空×100％
采用LOGIT法计算半数抑制浓度IC50值。以IC50值作为抑制能力的最终指标。3、试验结果：
毛兰素脂肪乳剂体外对5株不同组织来源的人肿瘤细胞的增殖生长均呈现出较强的抗肿瘤作用(见下表)，其中对人白血病细胞HL-60生长抑制作用最强，IC50值为0.0025ug/ml；对呼吸系统来源的肿瘤细胞A-549作用次之，IC50值为0.012ug/ml；对胃肠道来源的肿瘤细胞HCT-116的生长抑制作用又次，IC50值为0.05ug/ml；对乳腺癌和肝癌的作用略弱，IC50值分别为0.94ug/ml和1.07ug/ml。试验结果还显示，毛兰素脂肪乳剂抗肿瘤作用具有一定程度的选择性。
表1、毛兰素脂肪乳剂体外对4株人肿瘤细胞的增殖生长抑制率和IC50值细胞株 不同浓度毛兰素(ug/ml)的增殖生长抑制率(％) IC50值
2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 0.031 0.016 0.008 0.004 (ug/ml)HL-60 未测 未测 68.9 66.8 64.5 64.5 52.6 65.2 63. 144.1 0.0025A-549 未测 未测 94.1 96.0 90.4 88.4 86.4 75.4 37.8 12.1 0.012HCT-116 85.4 85.2 81.4 78.1 69.0 46.8 25.8 0.0 未测 未测 0.05MCF-7 71.7 45.9 36.0 19.9 17.8 11.8 6.9 12.0 未测 未测 0.94
表2、毛兰素脂肪乳剂体外对人肝癌细胞株BEL-7402的增殖生长抑制率和IC50值细胞株 不同浓度毛兰素(ug/ml)的增殖生长抑制率(％) IC50值
20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.312 0.156 (ug/ml)BEL-7402 98.5 98.5 97.6 87.7 91.2 62.7 4.3 0 1.07
表3、 阳性对照药阿霉素对5株人肿瘤细胞的增殖生长IC50值细胞株 HL-60 A-549 HCT-116 BEL-7402 MCF-7IC50值(mg/ml) 0.02 0.016 0.02 0.06 16.04、试验结论：
毛兰素脂肪乳剂体外对白血病和不同组织来源的人肿瘤细胞的增殖生长具有较强的抑制作用，并显示出一定的选择性。[试验例2]体内法抗肿瘤试验：1、试验材料
试验药毛兰素脂肪乳剂(浙江天皇药业有限公司)，阳性对照药注射用环磷酰胺(上海华联制药集团出品)、注射用顺铂(山东齐鲁制药厂出品)；瘤源：小鼠S180肉瘤、人体肺癌(均有上海医药工业研究院药理室传代提供)；实验动物：昆明种小鼠(由中科院上海实验动物中心提供，合格证号：沪动合证字第107号)，裸鼠(由中科院上海药物所提供，合格证号：沪动合证字第122号)。2、试验方法
小鼠S180肉瘤动物皮下接种模型：无菌条件下取生长旺盛的S180肿瘤，以适当量的生理盐水稀释成细胞匀浆，浓度为1-2×107/ml，于昆明种小鼠腋皮下接种0.2ml/只，次日开始给药。毛兰素脂肪乳剂分三个剂量组，每天尾静脉注射1次，连续给药15天；对照设阴性空白对照和阳性对照两组，阴性空白对照组小鼠每天给予尾静脉注射相同体积的空白乳剂，连续给药15天。阳性对照组小鼠每天给予尾静脉注射环磷酰胺，连续给药7天。3周后处死各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：
肿瘤抑制率(％)＝[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％。
人体肺癌A549异种移植于裸鼠模型：无菌条件下取生长于裸鼠的A549人体肺癌第三代肿瘤组织，以生理盐水按1∶6的比例稀释成细胞匀浆，浓度为1-2×107/ml，于裸鼠腋皮下接种0.2ml/只，次日开始给药。毛兰素脂肪乳剂分三个剂量组，每天尾静脉注射1次，连续给药15天。对照设阴性空白对照和阳性对照两组，阴性空白对照组小鼠每天给予尾静脉注射相同体积的空白乳剂，连续给药15天。阳性对照组小鼠每天给予尾静脉注射顺铂，连续给药7天；3周后处死各组动物，剖取肿瘤称重，按上述计算肿瘤抑制率的公式进行计算。3、试验结果
试验结果显示，高剂量毛兰素脂肪乳剂对动物皮下接种小鼠S180肉瘤模型肿瘤生长增殖抑制率为54.45％，对异种移植于裸鼠人体肺癌A549肿瘤模型的肿瘤生长增殖抑制率为59.36％。试验过程中还发现，毛兰素脂肪乳剂各试验组小鼠活动、饮食、毛色均正常，体重增加。提示毛兰素对肿瘤的生长增殖具有显著的抑制作用，而且无明显毒性。具体结果见表4、表5：
表4、毛兰素脂肪乳剂对小鼠S180肉瘤(皮下接种)疗效样品 剂量 给药方案 动物数(只) 动物体重 瘤重 抑瘤率
(mg/kg) 始/终 始/终(g) X±SD(g) (％)毛兰素 10 iv×15qd 10/10 18.7/24.0 1.83±0.19 34.88毛兰素 50 iv×15qd 10/10 18.7/25.9 1.44±0.16 48.75毛兰素 100 iv×15qd 10/10 18.5/26.2 1.28±0.18 54.45环磷酰胺 30 ip×7qd 10/10 18.6/24.0 0.30±0.16 89.57阴件对照相应溶剂 iv×15qd 20/20 18.8/26.5 2.81±0.34
表5、毛兰素脂肪乳剂对人体肺癌A549异种移植模型的疗效样品 剂量 给药方案 动物数(只) 动物体重 瘤重 抑瘤率
(mg/kg) 始/终 始/终(g) X±SD(g) (％)毛兰素 50 iv×15qd 6/6 19.5/24.0 0.82±0.15 56.15毛兰素 100 iv×15qd 6/6 19.0/23.7 0.78±0.12 58.29毛兰素 200 iv×15qd 6/6 19.3/24.2 0.76±0.07 59.36顺铂 30 ip×7qd 6/6 19.3/19.8 0.22±0.08 88.24阴性对照相应溶剂iv×15 qd 12/12 19.1/23.8 1.87±0.224、结论
毛兰素脂肪乳剂具有显著的抗肿瘤作用，而且毒性较低。根据一般脂肪乳剂药剂学的特点，本发明的抗肿瘤药物毛兰索脂肪乳剂还具有缓释、靶向、为机体提供能量等作用。