《一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104178452A43申请公布日20141203CN104178452A21申请号201410424794422申请日20140826C12N5/07120100171申请人同济大学地址200092上海市杨浦区四平路1239号72发明人薛志刚范国平74专利代理机构上海科盛知识产权代理有限公司31225代理人叶敏华54发明名称一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用57摘要本发明涉及一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用，视网膜色素上皮细胞培养基包括第一RPE细胞培养基和第二RPE细胞培养基；在15周内分别使用以上两种培养基，可以快速培养出细胞替代治疗所需的RPE单层细胞，培养得到。
2、的RPE是多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞，并具有正常的生物学功能。与现有技术相比，本发明在使用常规实验耗材的前提下，15周内即可快速培养出细胞替代治疗所需的RPE单层细胞，成本较低，且扩增速度很快。51INTCL权利要求书2页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页10申请公布号CN104178452ACN104178452A1/2页21一种视网膜色素上皮细胞培养基，其特征在于，包括第一RPE细胞培养基和第二RPE细胞培养基；所述的第一RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下修饰最小必需培养基380405ML；N1补充物5。
3、ML；谷氨酰胺5ML；青霉素链霉素5ML；非必需氨基酸5ML；牛磺酸100150MG；氢化可的松1015G；三碘甲状腺原氨酸00080012G；热灭活胎牛血清75100ML；所述的第二RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下修饰最小必需培养基430455ML；N1补充物5ML；谷氨酰胺5ML；青霉素链霉素5ML；非必需氨基酸5ML；牛磺酸75100MG；氢化可的松510G；三碘甲状腺原氨酸00030008G；热灭活胎牛血清2550ML。2根据权利要求1所述的一种视网膜色素上皮细胞培养基，其特征在于，所述的第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基的各组分在配制培养基前。
4、均通过022M孔径的过滤介质过滤，除去可能存在的杂菌。3一种如权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞培养基的应用，其特征在于，视网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增。4根据权利要求3所述的一种视网膜色素上皮细胞培养基的应用，其特征在于，视网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增，具体包括以下步骤1提前16小时，用修饰最小必需培养基包被培养瓶；2快速在3638水浴槽内解冻胚胎RPE细胞，取出冻存管；3将冻存管中的胚胎RPE转移到锥形试管中，并加入第一RPE细胞培养基，离心；4将步骤3锥形试管中的上清吸走，然后再加入第一RPE细胞培养基重悬细胞；5将步骤1中。
5、培养瓶的培养基吸走，同时加入步骤4重悬后的细胞，混匀；6将培养瓶放置于培养箱中培养，第3天将培养瓶中的培养基换成第二RPE细胞培养基；7以后每3天换一次第二RPE细胞培养基，15周后即可观察到具有黑色素的多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞。5根据权利要求4所述的一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基，其特权利要求书CN104178452A2/2页3征在于，步骤1所述的修饰最小必需培养基的层粘连蛋白浓度是520G/ML。6根据权利要求4所述的一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基，其特征在于，步骤3中离心的操作条件为常温，转速为300500XG，离心时间为35分钟。7根据权利要求。
6、4所述的一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基，其特征在于，步骤6中，培养箱的条件为3638，4555CO2，90100湿度。权利要求书CN104178452A1/7页4一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用技术领域0001本发明涉及一种培养基及其用途，尤其是涉及一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用，属于生物医学领域。背景技术0002老年性黄斑变性AGERELATEDMACULARDEGENERATION，AMD是一种在老年人群中多发的眼底疾病。AMD临床表现为中心视力进行性减退，从而引起阅读和其他行为障碍。前期研究工作发现AMD的形成与视网膜色素上皮细胞RPE对视细胞外节盘膜吞噬消化能。
7、力下降相关，未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出沉积于BRUCH膜，形成玻璃膜疣。除了细胞替代治疗，目前尚无逆转这一退行性过程并恢复视力的有效方法。细胞替代治疗就是通过外科手术剥离患者病变的RPE细胞，再将各种来源的RPE细胞以悬浮液或聚合物支架为载体移植到有RPE遗传缺陷动物的视网膜下腔，可以有效地延缓光感受器细胞的退行性病变并改善视觉功能。0003RPE是位于脉胳膜和神经视网膜之间的连续单层细胞。其功能主要是维持视网膜细胞的自我更新，这包括吞噬消化脱落的光感受器细胞的视细胞外节盘膜；促进视循环中重要的介质11顺视黄醛的再生；调节眼内的免疫反应；参与形成视网膜血管。
8、屏障等。而RPE细胞的这一生理功能异常与AMD的发生密切相关。在细胞替代治疗中，目前常用的RPE移植的供体来源主要是胎儿及成年人的RPE。虽然诱导多能干细胞IPSC不涉及破坏胚胎细胞等伦理学问题，而且避免了免疫排斥反应，但是IPSC可能的致瘤性限制了其在治疗AMD中的应用。0004目前，用来移植RPE的胎儿及成年人的RPE数量极为有限，不能满足患者的需求。同时，在以往的RPE培养条件下，不仅需要使用TRANSWELL等昂贵耗材，而RPE扩增速度缓慢，不能快速形成具有极性和生物功能的RPE单细胞层。这些都严重束缚了RPE细胞替代治疗的应用。发明内容0005本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在。
9、的缺陷而提供一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用。0006本发明的目的可以通过以下技术方案来实现0007一种视网膜色素上皮细胞培养基，包括第一RPE细胞培养基和第二RPE细胞培养基；0008所述的第一RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下0009修饰最小必需培养基380405ML；0010N1补充物5ML；0011谷氨酰胺5ML0012青霉素链霉素；5ML；说明书CN104178452A2/7页50013非必需氨基酸5ML0014牛磺酸100150MG；0015氢化可的松1015G；0016三碘甲状腺原氨酸00080012G；0017热灭活胎牛血清75100ML；0。
10、018所述的第二RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下0019修饰最小必需培养基430455ML；0020N1补充物5ML；0021谷氨酰胺5ML；0022青霉素链霉素5ML；0023非必需氨基酸5ML；0024牛磺酸75100MG；0025氢化可的松510G；0026三碘甲状腺原氨酸00030008G；0027热灭活胎牛血清2550ML。0028所述的第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基的各组分在配制培养基前均通过022M孔径的过滤介质过滤，通过022M孔径的过滤介质过滤用来除去可能存在的污染细菌。上述第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基可在4下稳定保。
11、存3个月。0029视网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增。具体包括以下步骤00301提前16小时，用修饰最小必需培养基包被培养瓶，其中修饰最小必需培养基的层粘连蛋白浓度是520G/ML；00312快速在3638水浴槽内解冻胚胎RPE细胞，取出冻存管；00323将冻存管中的胚胎RPE转移到锥形试管中，并加入第一RPE细胞培养基，离心，离心的操作条件为常温，转速为300500XG，离心时间为35分钟；00334将步骤3锥形试管中的上清吸走，然后再加入第一RPE细胞培养基重悬细胞；00345将步骤1中培养瓶的培养基吸走，同时加入步骤4重悬后的细胞，混匀；00356将培养瓶放置。
12、于培养箱中培养，培养箱的条件为3638，4555CO2，90100湿度，第3天将培养瓶中的培养基换成第二RPE细胞培养基；00367以后每3天换一次第二RPE细胞培养基，15周后即可观察到具有黑色素的多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞。步骤7中扩增后的细胞数目大于5亿个。0037目前，用来移植RPE的胎儿及成年人的RPE数量极为有限，不能满足患者的需求。同时，在以往的RPE培养条件下，不仅需要使用TRANSWELL等昂贵耗材，而且RPE扩增速度缓慢，不能快速形成具有极性和生物功能的RPE单细胞层。本发明提供了一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基配方，在使用常规实验耗材的前提下，15周。
13、内即可快速培养出细胞替代治疗所需的RPE单层细胞。0038与现有技术相比，本发明的优点在于00391、本发明的培养基中各组分的配比选择可以保证视网膜色素上皮细胞的最优生说明书CN104178452A3/7页6长，如果采用其他的配比均不能达到视网膜色素上皮细胞的最优生长。同时在培养基中加入牛磺酸、氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸，并采用本发明的配比可以模拟视网膜色素上皮细胞在体内环境下的生存条件并防止视网膜色素上皮细胞的氧化损伤。00402、本发明采用的第一RPE细胞培养基与第二RPE细胞培养基的组分含量有变化，第一RPE细胞培养基通过增加血清用量迅速扩增RPE细胞，避免细胞量过低导致细胞形态发生不。
14、可逆变化。第二RPE细胞培养基的组分相应增加了牛磺酸、氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸的用量，主要是增强RPE细胞的活力；同时减少血清用量可以避免细胞过度增殖和凋亡，并维持单层细胞，防止多层细胞的不规则聚团出现。具体实施方式0041下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。0042实施例10043本实施例所需试剂来源如下00440045一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基，分别由第一RPE细胞培养基和第二RPE细胞培养基构成。所述的第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基的各组分在配制培养基前均通过022M孔径的过滤介质过滤，通过022M孔径的过滤介质过滤用来除去可能存在的污染细菌。其配。
15、方和制备方法如下00461第一RPE细胞培养基通过022M过滤0047说明书CN104178452A4/7页700482第二RPE细胞培养基通过022M过滤00490050在上述试剂应在常温下混合，通过022M过滤。上述培养基可在4下稳定保存3个月。0051一种上述培养基的用途，包含如下步骤00521提前2小时，用2ML含有20G层粘连蛋白的修饰最小必需培养基包被T25培养瓶；00532快速在37水浴槽内解冻胚胎RPE细胞，取出冻存管；00543将冻存管中的胚胎RPE转移到1个15ML锥形试管中，并加入5ML第一RPE细胞培养基，300XG离心5分钟；00554将步骤3锥形试管中的上清吸走，然。
16、后加入5ML第一RPE细胞培养基重悬细胞；00565将步骤1中T25培养瓶的培养基吸走，同时加入步骤4重悬后的细胞，轻轻混匀；00576放置于培养箱中培养，第3天换用5ML第二RPE细胞培养基；00587每3天换一次第二RPE细胞培养基，15周后即可观察到具有黑色素的多角说明书CN104178452A5/7页8形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞。0059实施例20060一种视网膜色素上皮细胞培养基，包括第一RPE细胞培养基和第二RPE细胞培养基0061第一RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下0062修饰最小必需培养基380ML、N1补充物5ML、谷氨酰胺5ML、青霉素。
17、链霉素5ML、非必需氨基酸5ML、牛磺酸100MG、氢化可的松10G、三碘甲状腺原氨酸0008G、热灭活胎牛血清100ML；0063第二RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下0064修饰最小必需培养基430ML、N1补充物5ML、谷氨酰胺5ML、青霉素链霉素5ML、非必需氨基酸5ML、牛磺酸75MG、氢化可的松5G、三碘甲状腺原氨酸0003G、热灭活胎牛血清50ML。0065第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基的各组分在配制培养基前均通过022M孔径的过滤介质过滤，通过022M孔径的过滤介质过滤用来除去可能存在的污染细菌。上述第一RPE细胞培养基或第二RPE细。
18、胞培养基可在4下稳定保存3个月。0066视网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增。具体包括以下步骤00671提前1小时，用修饰最小必需培养基包被培养瓶，其中修饰最小必需培养基的层粘连蛋白浓度是5G/ML；00682快速在36水浴槽内解冻胚胎RPE细胞，取出冻存管；00693将冻存管中的胚胎RPE转移到锥形试管中，并加入第一RPE细胞培养基，离心，离心的操作条件为常温，转速为300XG，离心时间为5分钟；00704将步骤3锥形试管中的上清吸走，然后再加入第一RPE细胞培养基重悬细胞；00715将步骤1中培养瓶的培养基吸走，同时加入步骤4重悬后的细胞，混匀00726将培养瓶放。
19、置于培养箱中培养，培养箱的条件为36，45CO2，90湿度，第3天将培养瓶中的培养基换成第二RPE细胞培养基00737以后每3天换一次第二RPE细胞培养基，15周后即可观察到具有黑色素的多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞。步骤7中扩增后的细胞数目大于5亿个。0074实施例30075一种视网膜色素上皮细胞培养基，包括第一RPE细胞培养基和第二RPE细胞培养基；0076第一RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下0077修饰最小必需培养基405ML、N1补充物5ML、谷氨酰胺5ML、青霉素链霉素5ML、非必需氨基酸5ML、牛磺酸150MG、氢化可的松15G、三碘甲状腺原氨。
20、酸0012G、热灭活胎牛血清75ML；0078第二RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下0079修饰最小必需培养基455ML、N1补充物5ML、谷氨酰胺5ML、青霉素链霉素5ML、非必需氨基酸5ML、牛磺酸100MG、氢化可的松10G、三碘甲状腺原氨酸说明书CN104178452A6/7页90008G、热灭活胎牛血清25ML。0080第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基的各组分在配制培养基前均通过022M孔径的过滤介质过滤，通过022M孔径的过滤介质过滤用来除去可能存在的污染细菌。上述第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基可在4下稳定保存3个月。0081视。
21、网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增。具体包括以下步骤00821提前6小时，用修饰最小必需培养基包被培养瓶，其中修饰最小必需培养基的层粘连蛋白浓度是20G/ML；00832快速在38水浴槽内解冻胚胎RPE细胞，取出冻存管；00843将冻存管中的胚胎RPE转移到锥形试管中，并加入第一RPE细胞培养基，离心，离心的操作条件为常温，转速为500XG，离心时间为3分钟；00854将步骤3锥形试管中的上清吸走，然后再加入第一RPE细胞培养基重悬细胞；00865将步骤1中培养瓶的培养基吸走，同时加入步骤4重悬后的细胞，混匀；00876将培养瓶放置于培养箱中培养，培养箱的条件为38，。
22、55CO2，100湿度，第3天将培养瓶中的培养基换成第二RPE细胞培养基；00887以后每3天换一次第二RPE细胞培养基，15周后即可观察到具有黑色素的多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞。步骤7中扩增后的细胞数目大于5亿个。0089实施例40090一种视网膜色素上皮细胞培养基，包括第一RPE细胞培养基和第二RPE细胞培养基；0091第一RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下0092修饰最小必需培养基390ML、N1补充物5ML、谷氨酰胺5ML、青霉素链霉素5ML、非必需氨基酸5ML、牛磺酸120MG、氢化可的松13G、三碘甲状腺原氨酸0010G、热灭活胎牛血清90M。
23、L；0093第二RPE细胞培养基包括以下组分，以500ML计，各组分的用量关系如下0094修饰最小必需培养基440ML、N1补充物5ML、谷氨酰胺5ML、青霉素链霉素5ML、非必需氨基酸5ML、牛磺酸90MG、氢化可的松8G、三碘甲状腺原氨酸0005G、热灭活胎牛血清40ML。0095第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基的各组分在配制培养基前均通过022M孔径的过滤介质过滤，通过022M孔径的过滤介质过滤用来除去可能存在的污染细菌。上述第一RPE细胞培养基或第二RPE细胞培养基可在4下稳定保存3个月。0096视网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增。具体包括以下步骤。
24、00971提前3小时，用修饰最小必需培养基包被培养瓶，其中修饰最小必需培养基的层粘连蛋白浓度是10G/ML；00982快速在37水浴槽内解冻胚胎RPE细胞，取出冻存管；00993将冻存管中的胚胎RPE转移到锥形试管中，并加入第一RPE细胞培养基，离心，离心的操作条件为常温，转速为400XG，离心时间为4分钟；说明书CN104178452A7/7页1001004将步骤3锥形试管中的上清吸走，然后再加入第一RPE细胞培养基重悬细胞；01015将步骤1中培养瓶的培养基吸走，同时加入步骤4重悬后的细胞，混匀；01026将培养瓶放置于培养箱中培养，培养箱的条件为37，50CO2，950湿度，第3天将培养瓶中的培养基换成第二RPE细胞培养基；01037以后每3天换一次第二RPE细胞培养基，15周后即可观察到具有黑色素的多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞。步骤7中扩增后的细胞数目大于5亿个。0104上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。说明书CN104178452A10。