用不能形成芽孢的芽孢杆菌生产蛋白质的方法 【发明领域】
本发明涉及一种通过使用已突变为不能形成芽孢的芽孢杆菌属的细菌来生产多种产物(尤其是生产转运多肽)的方法、用于生产上述细菌的方法以及在上述方法中所使用的DNA构建体。
【发明背景】
在生产用于药物以及多种产业的许多种多肽和蛋白质中正使用着芽孢杆菌属的细菌。
举例来说，地衣形芽孢杆菌就广泛用于生产如淀粉酶和蛋白酶之类的工业用酶并且它在工业制备克隆的基因产物(1，2，3)方面是一种受欢迎的宿主。每年从该生物体中生产出几百吨的胞外酶，这便导致需要处理掉很多吨的用剩的生物体，而这些生物体通常都作为堆肥。
从环境的角度来看，当把这些物质分散到土壤中时，重要的是该物质应是死亡的。这通常可以通过用化学物质、放射性物质和/或热处理污泥来实现。
尽管大多数的生产菌株是Sp-，但是在随机突变实验的过程中一般都已引入了引起这种表型的损伤并且这种损伤地功能及效果是未知的。因此，在废弃的生物物质中存在低水平芽孢的可能性会很高并且通过需要更苛刻、更昂贵以及环境更不宜接受的灭菌条件以确保根除芽孢而增加了灭菌工艺的复杂性。
此外，管理生产菌株的更严格的法律体系的建立使得使用一种十分有限的芽孢形成突变体非常合乎要求。这样的突变体优选的应当是：
(i)在芽孢形成方面是完全缺陷的；
(ii)完全稳定并且不能恢复成形成芽孢，以及
(iii)在合成和分泌胞外酶方面类似于或者超过母体。
目前，枯草芽孢杆菌中芽孢形成的遗传学处于高级阶段(4，5)并且从已被明确表征的地衣形芽孢杆菌的芽孢形成基因(17，6，7)来看，如果发育途径不同的话，那么这种枯草芽孢杆菌的近亲似乎可能遵循类似的发育途径。
在芽孢形成过程中所观察到的第一形态学的变化为在第II阶段中合成了不对称的隔膜。最终将被母体细胞吞没的更小的后代产生了前芽孢。在母体细胞以及成熟芽孢中的基因的表达一部分会受到一连串σ因子的有序合成和激活的控制，其中σ因子以瞬时并且立体定向的方式指导RNA聚合酶转录对芽孢形成具有特异性的启动子(4，5)。
spoIIAC基因的产物σF蛋白(8，9)是一种存在于预分裂细胞中但其活性则限于前芽孢并仅在分隔后活性才变得明显(14)的σ因子。这种σ因子对于建立对区室具有特异性的基因表达而言是至关重要的(10)，并且如果没有这种σ因子的话，就会阻止在发育芽孢中大量基因的表达。σF的一个主要的功能为激活对前芽孢具有特异性的σ因子σG的表达，其中的σG决定着在发育芽孢中基因的表达(11)。此外，把原-σE加工成决定着母体细胞中基因表达的σE也会受到spoIIAC中的无义突变的阻断(11)。spoIIAC基因的缺失可能会导致芽孢中发育的完全破坏并且阻碍取决于σE的母体细胞的发育。
针对这些原因并且由于以前的研究已经表明了spoIIAC突变对在枯草芽孢杆菌中胞外酶的合成影响很小(15，16)，所以本发明发明人选择spoIIAC突变作为地衣形芽孢杆菌中缺失的目标。
发明简述
本发明提供了一种用于生产转运多肽的方法，该方法包括
i)在有利于编码与所说代谢物的生产有关的多肽的DNA构建体表达以及所说代谢物生产的条件下培养由于突变而不能形成芽孢的芽孢杆菌属的细菌，所说的细菌包含所说的DNA构建体，以及
ii)回收所说的代谢物，其前提是所说的细菌不属于枯草芽孢杆菌。
本发明还提供了由于突变而不能形成芽孢的芽孢杆菌属的宿主细菌以及一种用于生产上述宿主的方法。
该方法以使用从枯草芽孢杆菌提供的信息为基础，从而使得可以缺失涉及芽孢形成过程中的一个或者更多个基因。
通过重叠序列延伸技术采用拼接在体外制备了spoIIAC基因的缺失。在一个对温度敏感的质粒中把该基因引入地衣形芽孢杆菌中，并且在从染色体中整合和切除之后，制备一种精确定位缺失的染色体基因。
突变的细菌完全无孢子并且形成了其特征在于在细胞的极上具有不对称隔膜的流产性双孢担子上的孢子细胞。定性平板测试表明上述细菌合成
正常水平的DNA酶、多聚半乳糖醛酸裂合酶、蛋白酶、RNA酶以及木聚糖酶，但是由于β-1，3-葡聚糖酶和羧甲基纤维素酶的活性，因此与母体菌株相比在突变体中减少了水解区。
在延长温育至72小时的过程中，在突变体和母体的分批培养中碱性蛋白酶的合成是相同的，但是由于突变α-淀粉酶的产率下降了大约30％。
在本研究当中，我们指出可以在地衣形芽孢杆菌中使用体内重组来制备所限定的基因缺失，并且spoIIAC的缺失产生了一种在芽孢形成方面完全并且稳定缺陷的菌株，该菌株仍保持着丝氨酸蛋白酶的正常合成而在淀粉酶合成上稍微有所减少。
本发明以地衣形芽孢杆菌为例，但可以设想在诸如缓慢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、肠膜芽孢杆菌等其它的芽孢杆菌中也可以使用本发明。
表格及附图的简要描述
表I表示携带有地衣形芽孢杆菌的缺失spoIIAC等位基因的pE194ts的切除频率。
图1表示通过在spoIIA中创造缺失的重叠序列延伸反应进行的拼接。
A.所使用的引物的详细情况(附图表示引物A，B，C，D的3-末端的核苷酸的位置)。
B.通过测定使用引物A和D从缺失的菌株DN286 spoIIACD3产生的PCR产物的序列而得到的spoIIAC基因的序列。
图2表示造成在spoIIAC中产生缺失的整合和切除反应。
图3表示一种来自spoIIAC缺失突变体培养物的典型细胞的薄切片，该突变体显示出流产性双孢担子上的孢子的表型(线条＝3mm)。
图4表示在地衣形芽孢杆菌DN286以及DN286 spoIIACD3中的生长，芽孢形成以及胞外酶的合成。
A和B；分别在基本培养基和脑心浸液中，菌株DN286的生长(■)及孢子(□)以及DN286 spoIIACD3的生长(●)。
C和D，分别在基本培养基和脑心浸液中，通过菌株DN286(■)进行的丝氨酸蛋白酶的合成以及通过菌株DN286 spoIIACD3(●)进行的合成。
E，在基本培养基(□，○)和脑心浸液(■，●)中，在菌株DN286(□)以及DN286 spoIIACD3(○)中进行的淀粉酶的合成。
发明详述
正如以上所指出的，本发明提供了一种用于生产转运多肽的方法，该方法包括
i)在有利于编码与所说代谢物的生产有关的多肽的DNA构建体表达以及所说代谢物生产的条件下，培养由于突变而不能形成芽孢的芽孢杆菌属的细菌，所说的细菌包含所说的DNA构建体，以及
ii)回收所说的代谢物，其前提是所说的细菌不属于枯草芽孢杆菌。
根据本发明，上述细菌优选属于包括地衣形芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等种的组。
本发明的方法是通过使用一种借助spoIIAC基因的缺失而使其不能形成芽孢的芽孢杆菌来举例说明的，但是诸如Spo-2突变以及Spo-3突变这样的以不可逆方式有效地破坏芽孢形成过程的任意其它的突变也包括在本发明当中。
如上所述，本发明的方法应当优选使用其中所说的突变为不可逆突变的细菌。
预计本发明的方法主要用于生产任意多肽、其中尤其是转运多肽。
对于上述细菌而言，所说的多肽可以是内源性或是外源性的，这意味着上述多肽最初分别是由其自身或由一些其它的生物体生产的。
但是也可以设想本发明的芽孢形成缺陷型菌株可以用于生产次级代谢物。
从本发明的方法得到的产物优选为酶、尤其是诸如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、氧化还原酶、淀粉酶等工业用酶。
其它可以通过本发明的方法生产的产物为药用酶。
术语“转运多肽”欲指被表达的多肽携带了一个可以使其跨过细胞膜运输的信号序列。更具体地讲，转运多肽可以是一种分泌多肽或是一种涉及上述芽孢杆菌细胞的分泌机理的多肽。
本发明也提供了一种生产属于芽孢杆菌属的细菌的方法，其中上述细菌由于通过部分或者完全地缺失了涉及芽孢形成过程的一个或者多个基因的突变而不能形成芽孢。
对于在枯草芽孢杆菌以及其它的革兰氏阳性细菌(10，24，25)中产生具有特异性的突变而言，基因整合及切除是一种常用的方法。此处，我们指出对于向诸如地衣形芽孢杆菌之类的其它芽孢杆菌的染色体中引入所限定的突变而言，该方法也是一种有效的方法。
假定在枯草芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌之间为近亲(26)的话，那么人们便对检验使用异源的等位基因来把基因引入染色体的可能性产生了兴趣。根据本发明，以上述方式就可能在诸如地衣形芽孢杆菌之类的其它芽孢杆菌中使用大量来自枯草芽孢杆菌的已测序的基因进行基因组操作。尽管整合的频率低于同源反应的频率，但是同源性仍足以使地衣形芽孢杆菌的spoIIAC等位基因整合到枯草芽孢杆菌的染色体上，并且由于这些整合体是无孢子的，所以估计整合可能发生在正确的位点上。
但是，通过位于整合交换点处的第二位点重组现象一定会在枯草芽孢杆菌宿主中发生切除并且得不到缺失。估计在该区域中高的同源性可能引入了一个重组的热点，结果所有的子代(从几个整合体中检验了至少2000个)都保留了一个原封不动的spoIIAC基因。
相反的条件似乎可能适合于地衣形芽孢杆菌；并且被迫进入地衣形芽孢杆菌染色体的枯草芽孢杆菌的基因会准确地切除。
假设枯草芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌遵循着类似的发育途径，那么可以根据枯草芽孢杆菌的模型来讨论地衣形芽孢杆菌中spoIIAC缺失的效果。的确，地衣形芽孢杆菌DN286 spoIIACD3分化成为一种极其类似于在枯草芽孢杆菌的spoIIAC突变体中所看到(4)的流产性双孢担子上的孢子细胞，这完全支持了上述假设。
通常在指数生长的晚期以及在形成芽孢的第II阶段之前的早稳定期中合成胞外酶(在27中进行了回顾)。因此可以估计到spoIIAC的突变应对上述基因的表达影响极小或者没有影响，并且的确除了令人费解的β-葡聚糖酶之外，平板测试揭示出与母体菌株相比突变体中的胞外酶产率没有总体的变化。
在隔膜完全形成之前将在spoIIA细胞中表达被表达的基因。这包括所有处于0阶段的基因和一些第II阶段的基因以及诸如abrB，hpr，sen和sin之类的调节基因(12)。影响着其中至少存在9种独立的基因或者系统的枯草芽孢杆菌中aprE表达的大多数或者所有的控制(12)呈现出早稳定期的现象并且可能在spoIIAC突变体中有效地发挥作用。它遵循丝氨酸蛋白酶合成的模式并且正如在图4中所看到的在突变体中酶的产率与母体的相符。的确，Arbidge等人(13)使用一种未限定的无孢子的突变体已经报道了在枯草芽孢杆菌中丝氨酸蛋白酶合成的类似结果。
amyE的表达所受到的枯草芽孢杆菌中调节基因的支配远远少于aprE。尽管sen(28)和pai(29)也涉及对基因的控制，但分解代谢物的抑制以及DegSU系统是该基因主要的控制系统(12)。而淀粉酶的合成受到spoIIAC突变影响的原因并不是显而易见的。
早期形成芽孢的σ因子σH可能在spoIIAC突变体中积累，这是因为阻断阻止了σF和σE的合成；前者是由于缺失，而后者是由于来自前体原-σE的活性σE的生产取决于σF(11)。
的确有证据表明在spoIIA突变体中σH的积累有所增加(Errington，J；个人交流)。因此，α-淀粉酶产率的下降可能是由于E-σA部分被E-σH代替所至。
本发明的一个主要目的在于提供一种适于工业用酶生产目的的细菌。此处所描述的突变体在实验室条件下完全无孢子并且芽孢形成的分子生物学预示着上述突变体应当不能生成内生孢子。横跨了几乎400bp的缺失的回复突变的可能性极小并且没有证据表明抑制会带来问题。最后，上述细菌例如在碱性蛋白酶合成方面等同于其母体。材料和方法菌株及生长条件
DN286是一种地衣形芽孢杆菌的野生型菌株。
地衣形芽孢杆菌NCIMB6346可以从NCIMB得到。
枯草芽孢杆菌168是从D.A.Smith(伯明翰大学，英国)处获得的。
使用大肠杆菌JM83来构建所有的质粒。
按常规使用Luria肉汤和Luria肉汤琼脂(16)，并采用合适的抗生素选择：氨苄青霉素(100mg/ml)和红霉素(1mg/ml)。也使用Spizizen基本盐培养基(16)，Schaefer芽孢形成培养基(16)以及脑心浸液(BHI)肉汤(Oxoid)。除非另作声明，均在37℃下温育。质粒
使用质粒pUC19在大肠杆菌JM83中克隆。
来自在pUC13(17)中克隆的地衣形芽孢杆菌的完整的spoIIA操纵子是由M.Yudkin(牛津大学，英国)提供的，以及
pE194的突变体pE194ts在复制中对温度敏感，它是来自P.Youngman(佐治亚大学，雅典，Ga，美国)的赠品。DNA操作
大多数方法都按照Sambrook等人(18)的方法或者以前就已描述了这些方法(21)。从琼脂糖凝胶中切除DNA并且在连接反应之前使用基因-清除II试剂盒(生物101公司)进行纯化。采用ABI 373A DNA测序仪，通过由英国伦敦大学Kings学院分子医学系提供的自动DNA测序装置进行PCR产物的DNA测序。测序引物SEQ ID NO.1：
5′-CGATCATGGAAAATTTCATGGATG-3′互补于位于所设计的重组接头上游的大约100个碱基的区域，其中的接头对应于已公开序列的第943至第966个碱基。酶测定
酶分泌的定性测定基于以前所述的平板检测方法(22)。
在培养上清液中使用偶氮酪蛋白作为底物来测定碱性蛋白酶。在37℃下平衡磷酸钾缓冲溶液(50mM，pH9.0，1ml)和培养上清液(1.0 ml)3分钟并且通过在磷酸缓冲溶液中加入0.5ml 0.8％的偶氮酪蛋白溶液来引发反应。在合适的时间段内，用0.5ml冰冷的20％TCA沉淀0.5ml的反应混合物，离心该混合物并在405nm下测量上清液的吸光值。以每分钟每毫升上清液的吸光值的变化来表示活性。
在37℃下，在培养上清液中使用Phadebas淀粉酶底物(Pharmacia)来测定淀粉酶并且使用由Phacebas和Nelson-Somogyi还原糖测定所测定的淀粉酶的稀释建立的标准曲线将其换算成从可溶淀粉中的还原糖(麦芽糖)的释放。单位为mM释放的麦芽糖当量/min/ml上清液。所有的分批培养至少进行两次；所提供的附图为上述结果可重复形式的代表。电镜术
在含有0.5％的麦芽糖作为碳源的基本培养基中生长的细胞经离心收集并在pH8的含有50mM NaCl的10mM Tris缓冲溶液中洗涤细胞。用含水的乙酸双氧铀(4％，2小时)给细胞染色并且根据Robards和Wilson(23)用柠檬酸铅复染。在Jeol 100S透射显微镜下观察薄切片。
实施例实施例1spoIIAC缺失的制备
使用了通过重叠延伸(SOE)反应的拼接(19)。在使用引物A(SEQID NO.2)：
5′-GCGGCGAATTCAGCTTGACCCGACGATGGATGAACTG-3′和引物B(SEQ ID NO.3)：
5′-CACGACCTCTTCTGAACTGAAGTTCTTTCACTTCATGGTCTTTAAGCTG-3′的反应中扩增spoIIAC基因的启动子近侧区域并且在使用引物C(SEQ IDNO.4)：
5′-GACCATGAAGTGAAAGAACTTCAGTTCAGAAGAGGTCGTGATGGCC-3′和引物D(SEQ ID NO.5)：
5′-GCGGCGGATCCTGCCTGCAACATGAGCAGCCTCAGC-3′(Fig.1).的单独的反应中扩增spoIIAC基因的启动子远侧区域。在引物A和D中带有下划线的序列分别表示EcoRI和BamHI位点。该反应混合物包括200ng的模板DNA(地衣形芽孢杆菌的克隆的spoIIA操纵子)，100pmol的每种引物，最终浓度为125mM的每种dNTP，6ml的MgCl2(25mM)，10ml(×10)的Taq缓冲溶液以及无菌的Millipore水(至100ml)。
扩增的程序由在加入1单位的Taq聚合酶(Promega)后在95℃下进行10分钟变性的起始循环组成，并用100ml的轻质矿物油覆盖该反应混合物。随后在95℃下变性2分钟、在55℃下退火2分钟共35个循环并在72℃下延伸3分钟。95℃/2分钟、55℃/2分钟的另外的循环以及72℃/6分钟的延伸步骤完成了该程序。
通过乙醇沉淀来浓缩上述464bp以及382bp的PCR产物，采用基因-清除试剂盒进行纯化，并且在SOE反应中(条件与上面的相同)上述产物与引物A和D一起用作模板(每种取300ng)，从而生成了包括片段AD的806个碱基对的spoIIAC缺失(图1)。实施例2向地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中引入缺失
通过包含在引物A和D中的BamHI和EcoRI限制酶切位点分别把片段AD克隆至pUC19中，把上述片段转化到大肠杆菌JM83中并且在含有40mg/mlX-半乳糖(gal)的LB氨苄青霉素平板上筛选含有携带插入片段的质粒的菌落。
在用牛小肠碱性磷酸酶处理来自一个克隆的重组质粒之后，通过在每个复制子中唯一的PstI位点把上述重组质粒连接到pE194ts上。把连接反应的混合物转化到大肠杆菌JM83中并且通过小量制备的琼脂糖凝胶电泳来检测该重组体。然后使用从大肠杆菌制备的质粒来转化地衣形芽孢杆菌DN286(10)的原生质体以及枯草芽孢杆菌168(20，7)的感受态细胞。
于28℃下，在50ml含有红霉素的LB肉汤中培育含有以pE194为基础缺失的spoIIAC等位基因的地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌过夜。用3ml含有红霉素的软琼脂稀释并混合样品，将其涂覆在LB琼脂Em平板上并在28℃(允许复制)及40℃(不允许复制)下温育。整合的频率为在允许的温度下生长的菌落数量与那些在不允许的温度下生长的菌落数量之比。在40℃下分离出来的整合体随后在37℃下进行常规培育。
整合质粒的切除是通过在30℃下、在没有抗生素选择的LB肉汤中培育细胞来实现的。把稀释的样品铺在LB琼脂上并在37℃下温育过夜，在含有红霉素以及不合红霉素的LB琼脂上平板接种上述菌落。以菌落的总数与Emr菌落的数目之比来测定切除的频率。实施例3制备spoIIAC中的缺失
在地衣形芽孢杆菌的spoIIAC基因中的缺失是通过重叠序列延伸(SOE)技术使用拼接来制备的。使用在材料和方法中所述的引物，从克隆的spoIIA操纵子中实现了两种独立的PCR扩增。一种产物(AB)包括下游基因(spoIIAB)的远侧末端以及spoIIAC基因的近侧区域。第二产物(CD)覆盖了spoIIAC的远侧区域以及上游非编码区的一部分。使用在引物B和C中具有同源性的广大区域(重叠区)来引发包括产物AB和CD并插入了引物A和D的第三PCR扩增。于是得到了一个含有包括372bp缺失的spoIIAC基因的末端片段(片段AD，见图1)。
把片段AD克隆到pUC19中并通过在每个复制子中唯一的PstI位点将其连接到pE194ts上，从而生成了转化入大肠杆菌的穿梭质粒pHWM2(图2)。然后使用从大肠杆菌制备的质粒来转化地衣形芽孢杆菌DN286的原生质体以及枯草芽孢杆菌168的感受态细胞。通过限制性内切酶分析证实了来自每种转化的克隆都含有pHWM2并且使用上述克隆可以进行整合及切除研究。实施例4缺失的spoIIAC等位基因的整合及切除
在28℃下培养含有pHWM2的地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的细胞过夜并将其平板接种在选择性(含有Em)和非选择性的培养基上，在45℃下温育。地衣形芽孢杆菌的整合频率大约为10-4，而枯草芽孢杆菌(含有地衣形芽孢杆菌的等位基因)的整合频率要低100倍(表1)，其中的整合频率以能够于45℃下在红霉素平板上生长的细胞的比例计算。当在经28℃下培养在整合质粒中激活滚环复制后，对几个整合体的质粒切除进行测定时，地衣形芽孢杆菌的频率在10-2与10-3之间。表I携带地衣形芽孢杆菌的缺失spoIIAC等位基因的pE194ts的切除频率 生物体 整合体 过度生长阶段 (小时) 测试克隆 的数目 切除频率 Spo-菌落地衣形芽孢杆菌 1 24 150 9×10-2 0 2 24 100 2×10-2 0 3 24 150 6×10-2 44 4 24 150 7×10-2 20 5 24 150 5×10-2 25枯草芽孢杆菌 1 24 560 1×10-1 0 48 114 2×10-1 0 2 24 358 1×10-1 0 48 152 2×10-1 0 3 24 442 2×10-1 0 48 184 3×10-1 0
在两个克隆(整合体1和2)中，切除一定会通过整合位点并且回收了野生型的Spo+子代。但对于其它三个克隆而言，切除也通过第二位点重组的现象(见图2)造成了在Ems衍生物中spoIIAC基因的缺失。令人感兴趣的是，在枯草芽孢杆菌中插入是非常不稳定的，但在插入点处一定会发生切除，甚至在延长过度生长阶段至48小时后仍回收不到Spo-子代(表I)。实施例5地衣形芽孢杆菌DN286 spoIIACD3的特征确定
选择来自地衣形芽孢杆菌整合体3(表1)的缺失菌株进行进一步的研究。来自地衣形芽孢杆菌的标记的spoIIA操纵子杂交到来自野生型并且已用EcoRI切割的缺失菌株的Southern印迹的染色体DNA上，这表明与母体中的4.2kb片段(数据未显示)相比，在突变体中有一个3.8kb的更小的杂交片段。使用引物A和D从突变体和母体菌株的染色体DNA中进行的PCR扩增表明突变体具有一个大约370bp的缺失。当测定来自该突变体的PCR产物的序列时，表明在引物B和C之间的连接点处精确地定位了一个缺失(图1B)。spoIIA突变的形态学验证是由电镜术提供的。可以明显地看到代表枯草芽孢杆菌spoIIAC突变体在“流产性双孢担子上的孢子”细胞中的两个不对称隔膜(图3)。
上述缺失生成了完全无孢子的培养物，在该培养物中是检测不到孢子的。在BHI、基本培养基(图4)以及Schaeffer芽孢形成培养基(数据未显示)中生长72小时后，在每种情况下母体的芽孢形成的频率大约为2％。
通过与在同样的三种条件下表明有90％至100％形成了芽孢的地衣形芽孢杆菌NCIMB6346相比证明DN286的芽孢形成率生来就低。
在任意一种培养基中，在spoIIAD3衍生物中均未检测到孢子。尽管没有孢子，但是当在BHI上生长时却没有证据表明在突变体菌株中存在明显的生存力的损失或者细胞裂解，并且在整个温育期间细胞群保持稳定在大约4×109cfu/ml。但在基本培养基中，当温育突变体超过36小时时却存在一些生存力的损失，并且在细胞群最高高于10倍之后，最终的细胞群达到3×109cfu/ml。在生长于基本培养基的母体菌株的生存力的损失不太显著。实施例6地衣形芽孢杆菌DN286 spoIIACD3中胞外酶的合成
原始平板测试暗示着突变体菌株在合成胞外酶的数量上与母体之间有一些较小的差别。更具体地讲，与母体菌株相比在突变体中β-1，3-葡聚糖酶和羧甲基纤维素酶的水解区有所减少，但是α-淀粉酶、DNA酶、多聚半乳糖醛酸裂合酶、蛋白酶、RNA酶以及木聚糖酶的合成大部分不受影响。
在丰富(BHI)和基本培养基中培养上述突变体及其母体72小时。检测芽孢形成以及丝氨酸蛋白酶的合成(图4)。在母体和突变体中，蛋白酶的生产是类似的。在基本培养基中，在培养大约40小时后上述两种菌株中酶的产率达到最高值然后便保持稳定。在BHI中，上述两种菌株中酶的产率稍受抑制并在培养大约48小时后达到最高值。随后在BHI中酶产率的下降比在盐培养基中的下降更不显著。在上述两种培养基中，丝氨酸蛋白酶的产率不受spoIIAC缺失的影响。
与母体相比，在突变体的分批培养过程中α-淀粉酶的合成始终开始得较晚，结果这种淀粉酶的发酵比蛋白酶的发酵(84小时)会持续更长的一段时间。在上述两种培养基中，突变体的酶的产率大约为母体菌株的70％。但是，如果以每单位的生物物质的比活性来表达酶的产率时，上述突变体的表现几乎与母体的相当，特别是当在基本培养基中生物物质下降时在生长循环的后期更是这样。
通过仅仅显示本发明的具体实施方案的实施例已经解释了本发明。由于对于本领域的普通技术人员来说在阅读实施例的基础上许多其它的实施方案都是显而易见的，所以这些实施例不构成对本发明的限制。
说明书中引用的参考文献
1.Diderchsen，B.，G.B.Poulsen and P.L.Jrgensen.1991.来自嗜热脂肪芽孢杆菌的染色体的α-淀粉酶基因的克隆与表达，微生物学研究142：793-796.
2.Leen，R.W.van，J.G.Ba khuis，R.F.W.C.van Beckhoven，M.Bruge，L.C.J.Dors sers，R.W.J.Hommes，P.J.Lemson，B.Noordam，N.L.M.Persoon and G.Wagemaker.使用工业微生物生产人-白细胞介素3，生物/技术9：47-52.
3.de Boer，A.S.，F.Priest and B.Diderichsen.1994.地衣形芽孢杆菌在工业上的使用：综述，应用微生物学和生物技术.40：595-598.
4.Errington，J.1993.枯草芽孢杆菌的芽孢形成：基因表达的调节以及形态发生的控制，微生物学回顾57：1-33.
5.Lewis，P.J.，S.R.Partridge and J.Errington.1994.σ-因子，不对称性以及枯草芽孢杆菌中细胞命运的测定，美国科学院学报.91：3849-3853.
6.Kuroda，A.，Y.Asami and J.Sekiguchi.1993.枯草芽孢杆菌的对芽孢形成具有特异性的细胞壁水解酶基因的分子克隆，微生物学杂志.175：6260-6268.
7.Coppelecchia，R.，H.de Grazia and C.P.Moran Jr.1991.spoIIAB的缺失阻断了在早期枯草芽孢杆菌中内生孢子的形成，微生物学杂志.173：6678-6685.
8.Sun，D.P.Stragier，and P.Setlow.1989.在枯草芽孢杆菌的形成孢子的过程中鉴定涉及区室化基因表达的一种新的σ因子.Genes Dev.3：141-149.
9.Fort，P.，and P.J.Piggot.1984.在枯草芽孢杆菌中芽孢形成基因座spoIIA的核苷酸序列，基因微生物学杂志.130：2147-2153.
10.Tangney，M.，P.L.Jrgensen，B.Diderichsen and S.T.Jrgensen，1995.一种用于在不易转化的芽孢杆菌中整合及稳定地进行DNA扩增的新方法.FEMS Microbiol.Letts.125：107-114.
11.Patrridge，S.R.，D.Foulger and J.Errington.1991.在枯草芽孢杆菌的对前孢子具有特异性的转录中SF的作用，分子微生物学.5：757-767.
12.Smith，I.1993.控制晚期生长发展的调节性蛋白质，p.785-800.InA.L.Sonenshein，R.Losick and J.A.Hoch(ed.)，枯草芽孢杆菌及其它的革兰氏阳性细菌：生物化学，生理学及分子遗传学，美国微生物学协会，华盛顿特区.
13.Arbidge，M.V.，B.A.Balthus，J.Schultz and D.Crabb.1993.细菌的发酵，p.871-895.In A.L.Sonenshein，R.Losick and J.A.Hoch(ed.)，枯草芽孢杆菌及其它的革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学及分子遗传学，美国微生物学协会，华盛顿特区。
14.Waites，W.M.，D.Kay，I.W.Dawes，D.A.Wood，S.C.Warren andJ.Mandlestam.1970.枯草芽孢杆菌中芽孢的形成，在无孢子的突变体中形态学改变的生化现象的修正，生物化学杂志.118：667-676.
15.Coote，J.G.1992.枯草芽孢杆菌中芽孢的形成，少孢子突变体的表征及其与无孢子突变体的表型的比较，基因微生物学杂志.71：1-15.
16.Harwood，C.R.and s.M.Cutting.1990.附录1-培养基p.545-550.In，C.R.Harwood and S.M.Cutting(eds.)芽孢杆菌的分子生物学方法.Wiley，Chichester，UK.
17.Yudkin，M.D.，L.Appleby and A.J.Smith.1989.枯草芽孢杆菌的芽孢形成基因座spoIIA的地衣形芽孢杆菌同源染色体的核苷酸序列，基因微生物学杂志.135：767-775.
18.Sambrook，J.，E.F.Fritsch and T.Manniatis.1989.分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约.
19.Horton，R.M.，H.D.Hunt，S.N.Ho，J.K.Pullen and L.R.Pease.1989.未使用限制性内切酶的改造的杂合体基因：通过重叠序列延伸进行基因拼接，基因.77：61-68.
20.Cutting，S.M.and P.B.Van der Horn.1990.基因分析，P.27-74.In，C.R.Harwood and S.M.Cutting(eds.).芽孢杆菌的分子生物学方法.Wiley，Chichester，UK.
21.Aquino de Muro，M.，W.J.Mitchell and F.G.Priest.1992.通过核糖体RNA基因限制模式分化非毒性变种的球形芽孢杆菌的蚊子-致病菌株，基因微生物学杂志.138：1159-1166.
22.Priest，F.G.and R.Grigorova.1990.用于研究内生孢子形成细菌的生态学方法，微生物学方法.22：565-591.
23.Robards，A.W.and A.J.Wilson(eds.).1993.电镜术中的方法.Wiley，Chichester，UK.
24.Youngman，P.1990.在枯草芽孢杆菌中使用转座子与整合载体进行诱变以及构建基因融合体.p.221-226.In，C.R.Harwood and S.M.Cutting(eds.).芽孢杆菌的分子生物学方法.John Wiley&Sons，纽约.
25.Biswas，I.，A.Gruss，S.D.Ehrlich and E.Maguin.1993.高效基因，革兰氏阳性细菌的灭活及置换系统，细菌学杂志.175：3628-3635.
26.Priest，F.G.1993.芽孢杆菌的分类学及生态学.p.3-16.In A.N.Sonenshein，R.Losick and J.A.Hoch(eds.).枯草芽孢杆菌及其它的革兰氏阳性细菌：生物化学，生理学及分子遗传学，美国微生物学协会，华盛顿特区。
27.Priest，F.G.1977.芽孢杆菌属中胞外酶的合成，细菌学综述.
28.Wang，S.L.，L.F.Wang and R.H.Doi.1988.一种调节胞外蛋白质基因表达的新的纳豆芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)基因senN的克隆及核苷酸序列，基因微生物学杂志.134：3264-3276.
29.Honjo，M.，A.Nakayama，K.Fukazawa，K.Kawamura，K.Ando，M.Mori and Y.Furutani.1990.一种涉及负面控制芽孢形成以及降解酶生产的新的枯草芽孢杆菌的基因，细菌学杂志.172：1783-1790.
序列表(1)一般信息： (i)申请人：
(A)姓名：NOVO NORDISK A/S
(B)街道：Novo Alle
(C)城市：Bagsvaerd
(E)国家：丹麦
(F)邮政编码(ZIP)：DK-2880
(G)电话：+45 4442 2668
(H)传真：+45 4442 6080 (ii)发明名称：用于生产有用蛋白质的方法 (iii)序列数：5 (iv)计算机可读形式：
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