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1、10申请公布号CN104212805A43申请公布日20141217CN104212805A21申请号201310220040222申请日20130604C12N15/12200601C12N15/70200601C12N1/21200601C07K14/435200601A61K38/17200601A61P31/04200601C12R1/1920060171申请人香港理工大学地址中国香港九龙红磡72发明人李翼李智梁杏媚蓝希钳刘璇74专利代理机构深圳市顺天达专利商标代理有限公司44217代理人郭伟刚54发明名称一种家蚕抗菌肽ATTACIN2及其异源表达和应用57摘要本发明公开了一种家蚕抗菌。
2、肽ATTACIN2及其原核表达和应用。本发明通过设计引物进行PCR扩增获取编码家蚕抗菌肽ATTACIN2的基因、构建包含该编码基因的重组载体、采用该重组载体转化表达菌株后实现家蚕抗菌肽ATTACIN2的原核表达，经纯化和复性处理后得到家蚕抗菌肽ATTACIN2的成熟肽。本发明的家蚕抗菌肽ATTACIN2对细菌具有显著抑制作用，其可有效抑制黑胸败血病菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长，因此可应用于制备抑菌药物、制剂或添加剂。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表3页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表3页附图4页10申请公布号C。
3、N104212805ACN104212805A1/1页21一种家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因，其特征在于，所述编码基因的碱基序列如SEQIDNO1所示。2根据权利要求1所述的家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因，其特征在于，对所述编码基因进行PCR扩增使用的引物序列为ATTACIN228AF5CATGCCATGGGCCAAGCCGGCAGCTTCACAGT3ATTACIN228AR5CCGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGGAAGAATTTAGAGAAGGAGA3。3一种家蚕抗菌肽ATTACIN2的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如SEQIDNO1所示的家蚕抗菌。
4、肽ATTACIN2的编码基因。4一种含有重组载体的BL21菌株，其特征在于，所述重组载体包含如SEQIDNO1所示的家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因。5一种家蚕抗菌肽ATTACIN2，其特征在于，具有如SEQIDNO4所示的氨基酸序列。6根据权利要求5所述的家蚕抗菌肽ATTACIN2，其特征在于，所述家蚕抗菌肽ATTACIN2为成熟肽，所述成熟肽的家蚕抗菌肽ATTACIN2的N端包含6个组氨酸构成的检测标签。7一种家蚕抗菌肽ATTACIN2的生产方法，其特征在于，包括以下步骤获取家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因；构建重组载体将家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因的PCR扩增产物连接到P。
5、MD18T克隆载体中，构建得到重组质粒PMD18ATTACIN2；分别酶切重组质粒PMD18ATTACIN2和原核表达载体PET28A，构建得到包含家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因的重组载体PET28AATTACIN2；表达家蚕抗菌肽ATTACIN2将重组载体PET28AATTACIN2转化至BL21菌株中，利用IPTG诱导后收集包含家蚕抗菌肽ATTACIN2的菌液。8根据权利要求7所述的家蚕抗菌肽ATTACIN2的生产方法，其特征在于，所述方法还包括破碎BL21菌株，采用尿素溶液处理离心破碎后的细胞菌液，随后离心并收集沉淀，获得的上清加样于组氨酸蛋白纯化柱上，洗脱后获得纯化的家蚕抗菌肽A。
6、TTACIN2；以及纯化的家蚕抗菌肽ATTACIN2经PBS透析复性，并经冷冻干燥制得粉末态的所述家蚕抗菌肽ATTACIN2。9一种家蚕抗菌肽ATTACIN2在抑制黑胸败血病菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长中的应用。权利要求书CN104212805A1/5页3一种家蚕抗菌肽ATTACIN2及其异源表达和应用技术领域0001本发明属于基因工程技术领域，并涉及一种具有抑菌作用的家蚕抗菌肽ATTACIN2。更具体地，本发明涉及一种在原核生物中异源表达的家蚕抗菌肽ATTACIN2、编码该抗菌肽的基因序列、包含该基因序列的原核表达载体以及该抗菌肽在抑制细菌生长中的应用。背景技术0002抗菌。
7、肽是一类天然小分子多肽。近年来，研究者普遍认为抗菌肽最有可能成为现有抗生素的替代品，这是因为其在具有广谱抗菌作用的同时并不会诱导细菌产生耐药性。抗菌肽最早发现于昆虫体内，随后在植物、真菌和其他动物中也相继发现存在抗菌肽。目前，家蚕体内已发现并报道的抗菌肽包括CECROPIN、MORICIN、ATTACIN、GLOVERIN、DEFENSIN、ENBOCIN和LEBOCIN。0003ATTACIN又称攻击素，是一类富含甘氨酸的抗菌肽，分子量通常为20KD左右。研究表明，ATTACIN主要对革兰氏阴性细菌有较强的抑菌作用，可以广泛应用于医学领域。家蚕被外源细菌感染后诱导所产生的抗菌肽ATTACIN。
8、的含量较少，很难从家蚕体内直接分离纯化。因此，只有通过异源表达才能获得大量的家蚕抗菌肽ATTACIN。0004常用的异源表达方式有酵母表达、细胞表达和原核表达，其中原核表达的方法因操作简单、耗时短且表达量高等得到最为普遍的应用。但现有技术中尚缺少有关如何通过异源表达制备家蚕抗菌肽ATTACIN2的方法。发明内容0005本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中难以从家蚕体内直接分离得到家蚕抗菌肽ATTACIN2且尚不存在家蚕抗菌肽ATTACIN2的异源表达方法的缺陷，提供用于异源表达家蚕抗菌肽ATTACIN2的基因、原核表达载体和表达菌株，从而实现家蚕抗菌肽ATTACIN2的量化生产。与此同时。
9、，本发明还提供采用异源表达方法制得的家蚕抗菌肽ATTACIN2及其在抑菌细菌生长方面的应用。0006本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现提供一种家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。0007优选地，对所述编码基因进行PCR扩增使用的引物序列为0008ATTACIN228AF5CATGCCATGGGCCAAGCCGGCAGCTTCACAGT30009ATTACIN228AR5CCGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGGAAGAATTTAGAGAAGGAGA3。0010根据本发明的另一方面，提供一种家蚕抗菌肽ATTACIN2的重组载体，。
10、该重组载体包含如SEQIDNO1所示的家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因。0011根据本发明的另一方面，提供一种含有重组载体的BL21菌株，该重组载体包含如SEQIDNO1所示的家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因。说明书CN104212805A2/5页40012根据本发明的另一方面，提供一种家蚕抗菌肽ATTACIN2，其具有如SEQIDNO4所示的氨基酸序列。0013优选地，所述家蚕抗菌肽ATTACIN2为成熟肽，所述成熟肽的家蚕抗菌肽ATTACIN2的N端包含6个组氨酸构成的检测标签。0014根据本发明的另一方面，提供一种异源表达家蚕抗菌肽ATTACIN2的生产方法，该方法包括以下步骤0。
11、015获取家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因；0016构建重组载体将家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因的PCR扩增产物连接到PMD18T克隆载体中，构建得到重组质粒PMD18ATTACIN2；分别酶切重组质粒PMD18ATTACIN2和原核表达载体PET28A，构建得到包含家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因的重组载体PET28AATTACIN2；0017表达家蚕抗菌肽ATTACIN2将重组载体PET28AATTACIN2转化至BL21菌株中，利用IPTG诱导后收集包含家蚕抗菌肽ATTACIN2的细菌。0018优选地，所述方法还包括0019破碎BL21菌株，采用尿素溶液处理离心破碎后的细胞。
12、菌液，随后离心并收集沉淀，获得的上清加样于组氨酸蛋白纯化柱上，洗脱后获得纯化的家蚕抗菌肽ATTACIN2；0020以及纯化的家蚕抗菌肽ATTACIN2经PBS透析复性，并经冷冻干燥制得粉末态的所述家蚕抗菌肽ATTACIN2。0021根据本发明的另一方面，本发明还提供家蚕抗菌肽ATTACIN2在抑制黑胸败血病菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长中的应用。0022实施本发明可以获得以下有益效果本发明采用原核表达载体构建包含家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因的重组载体，从而可实现家蚕抗菌肽ATTACIN2的原核表达，不仅操作简单、耗时短，而且可获得大量家蚕抗菌肽ATTACIN2，便于本领。
13、域技术人员对进行进一步研究。本发明制得的家蚕抗菌肽ATTACIN2为成熟肽，可显著抑制多种细菌的生长；例如，其可抑制黑胸败血病菌、粘质沙雷氏菌、金黄葡萄球菌和大肠杆菌的生长，因此在制备抑菌药物和添加剂方面具有广泛应用前景。附图说明0023以下将结合附图和具体实施例对发明做进一步详细说明。附图中0024图1是对家蚕抗菌肽ATTACIN2成熟肽的编码基因进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测；0025图2是重组载体PET28AATTACIN2的PCR鉴定的示意图；0026图3示出了家蚕抗菌肽ATTACIN2的原核表达检测及WESTERNBLOT鉴定结果，其中A表示SDSPAGE检测结果，B表示WES。
14、TERNBLOT鉴定结果；0027图4示出了琼脂板孔穴扩散法测定原核表达的家蚕抗菌肽ATTACIN2对粘质沙雷氏菌（SERRATIAMARCESCENS）的抑菌作用；0028图5是原核表达的家蚕抗菌肽ATTACIN2对粘质沙雷氏菌的抑菌作用检测；0029图6是原核表达的家蚕抗菌肽ATTACIN2对黑胸败血病菌（BACILLUSBOMBYSEPTICUS）的抑菌作用检测；说明书CN104212805A3/5页50030图7是原核表达的家蚕抗菌肽ATTACIN2对金黄葡萄球菌（STAPHYLOCOCCUSAUREUS）ATCC25923的抑菌作用检测；以及0031图8是原核表达的家蚕抗菌肽ATTA。
15、CIN2对大肠杆菌ATCC25922的抑菌作用检测。具体实施方式0032为使本发明的目的、技术方案和效果更清楚明白，以下将结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。应该理解的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不对本发明做任何限制。0033本发明通过原核表达方法获得具有抑菌作用的家蚕抗菌肽ATTACIN2。该方法包括通过引物设计获取编码家蚕抗菌肽ATTACIN2的基因、构建包含该编码基因的重组载体、转化菌株实现家蚕抗菌肽ATTACIN2的原核表达、以及纯化分离获得所需的家蚕抗菌肽ATTACIN2的成熟肽。0034一、获取编码家蚕抗菌肽ATTACIN2的基因00351、引物设计0036根据家蚕。
16、基因组数据库HTTP/SILKWORMGENOMICSORGCN/获得家蚕抗菌肽ATTACIN2（BGIBMGA002739TA）的CDNA序列，并通过SIGNALP（HTTP/WWWCBSDTUDK/SERVICES/SIGNALP/）在线预测获得的家蚕抗菌肽ATTACIN2的成熟肽序列，然后根据该序列设计引物如下0037ATTACIN228AF5CATGCCATGGGCCAAGCCGGCAGCTTCACAGT3（SEQIDNO2）0038ATTACIN228AR5CCGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGGAAGAATTTAGAGAAGGAGA3（SEQIDNO3）。00。
17、392、诱导后家蚕脂肪体RNA的提取及CDNA模板的合成0040用大肠杆菌DH5诱导五龄家蚕，24小时后取诱导后家蚕的脂肪体并提取脂肪体总RNA从诱导后家蚕取出脂肪体，液氮速冻后放入遇冷的研钵中，加入液氮后快速磨成粉末状；将粉末转移至15ML离心管中，加入TRIPURE1000L，在4下12000RPM离心10MIN；取上清液转移至15ML离心管，加氯仿200L，摇匀后静置5MIN，随后在4下10000RPM离心10MIN；取上清液转移至15ML离心管，加入异丙醇800L，摇匀后静置10MIN，随后在4下12000RPM离心10MIN；弃上清液，加入75乙醇1000L洗涤沉淀，随后在4下100。
18、00RPM离心5MIN，重复该洗涤操作一次；最后弃上清液，用100LDEPC处理过的水溶解沉淀，即得总RNA。再按照如下方法获得CDNA模板004130L反应体系00421第一阶段总RNA变性解链在PCR管中加入下列反应液4L约2G的总RNA、3L的OLIGODT18和5L的DEPC水，随后在70下保温10MIN，接着在冰上浴冷2MIN；00432第二阶段逆转录反应在冰浴后的解链反应体系中加入以下反应液，轻轻混匀后在42温育处理60MIN；0044说明书CN104212805A4/5页600453第三阶段取42温度后的产物，在70下温育10MIN后冰上冷却，得到的产物保存于20，用于后续的PC。
19、R扩增。00463、家蚕抗菌肽ATTACIN2的编码基因的PCR扩增0047以诱导后家蚕脂肪体CDNA为模板进行PCR扩增。0048PCR反应体系如下004900500051按照以下程序进行PCR扩增，94预变性5MIN，然后94变性50S、55退火40S、72延伸1MIN，共35个循环，再72终延伸10MIN。PCR产物用琼脂糖电泳检测获得与预期大小符合的条带（图1中M代表标记物，1代表PCR扩增产物）。0052二、构建包含家蚕抗菌肽ATTACIN2编码基因的重组载体0053通过胶回收获得家蚕抗菌肽ATTACIN2编码基因的PCR产物，将该PCR产物连接到TA克隆载体PMD18TSIMPLE。
20、，转化后鉴定获得重组质粒PMD18ATTACIN2。利用设计的限制性酶切位点，分别酶切PMD18ATTACIN2和原核表达载体PET28A，回收纯化后，将ATTACIN2基因与线性化载体PET28A连接，重组转化后，获得包含家蚕抗菌肽ATTACIN2编码基因的重组载体PET28AATTACIN2。如图2所示，该重组载体PET28AATTACIN2经过PCR扩增初步鉴定，具有与预期大小相同的条带（该附图中标号2表示该重组载体的PCR扩增产物），将重组质粒载体送到生物公司进行测序验证。0054三、家蚕抗菌肽ATTACIN2的原核表达0055提取重组质粒PET28AATTACIN2，转化BL21感受。
21、态细胞，获得含有重组载体的BL21菌株BL21/PET28AATTACIN2。挑取单克隆接入LB试管中，IPTG诱导后，破碎BL21细菌（ATTACIN2以包涵体的形式在BL21细菌中表达），收集菌液。离心菌液后收集沉淀，经说明书CN104212805A5/5页7SDSPAGE检测证明家蚕抗菌肽ATTACIN2在大肠杆菌BL21菌株中有表达（如图3A中箭头所示），随后采用WESTERNBLOT分析进一步验证家蚕抗菌肽ATTACIN2的表达（如图3B中箭头所示）。0056四、家蚕抗菌肽ATTACIN2的纯化分离0057离心破碎后的细胞菌液并收集沉淀，用尿素溶液处理后离心，获得的上清加样于组氨酸蛋。
22、白纯化柱上，洗脱后获得纯化的家蚕抗菌肽ATTACIN2。随后将纯化获得的家蚕抗菌肽ATTACIN2用PBS透析复性，然后再用冷冻干燥法将家蚕抗菌肽ATTACIN2的蛋白浓度浓缩为100G/ML，并最终制得粉末态的终产品。0058本发明通过原核表达法可制得大量家蚕抗菌肽ATTACIN2，且制备得到的该抗菌肽具有显著的抑菌作用。以下通过琼脂板空穴扩散法和最小抑菌浓度法对该家蚕抗菌肽ATTACIN2的抑菌效果进行测定。0059黑胸败血病菌（BACILLUSBOMBYSEPTICUS）和粘质沙雷氏菌（SERRATIAMARCESCENS）是家蚕饲养中常见的两种家蚕致病菌，所以选为本发明中原核表达的家蚕。
23、抗菌肽ATTACIN2的抑菌测试的实验菌种。除此之外，还选用大肠杆菌ATCC25922和金黄葡萄球菌（STAPHYLOCOCCUSAUREUS）ATCC25923作为抑菌测试的实验菌种。0060（1）琼脂板孔穴扩散法测定0061LB固体培养基经高压灭菌后冷却到5060，备用。在LB中培养粘质沙雷氏菌（SERRATIAMARCESCENS），取适量加入到备用的LB固体培养基中，振荡混匀并冷却。用打孔器打孔，每孔注入10L浓度为100G/ML纯化后的家蚕抗菌肽ATTACIN2溶液，同时以PBS为阴性对照，并以工作浓度的氨苄青霉素和卡那霉素为阳性对照。4放置待蛋白完全吸收后，倒置培养，37培养过夜，。
24、每一测试做3个重复。结果表明原核表达并纯化后的家蚕抗菌肽ATTACIN2对粘质沙雷氏菌（SERRATIAMARCESCENS）的生长有明显的抑制作用（如图4所示）。0062（2）最小抑菌浓度法（MINIMUMINHIBITORYCONCENTRATION，MIC）测定0063将原核表达并纯化的家蚕抗菌肽ATTACIN2用灭菌水1/2倍数梯度稀释。取LB中培养的以上四种实验菌种，加入各种浓度的10L的家蚕抗菌肽ATTACIN2，同时以加10LPBS的细菌菌液作为阴性对照，10L工作浓度的氨苄青霉素作为阳性对照，混匀后在96孔平板上37孵育18H后，测定各个样品的吸光度（OD），每个处理重复3次。。
25、结果表明，当原核表达的家蚕抗菌肽ATTACIN2的浓度为5G/ML时对这四种选用的实验菌种的细菌都有一定的抑制作用，其中对粘质沙雷氏菌（SERRATIAMARCESCENS）和黑胸败血病菌（BACILLUSBOMBYSEPTICUS）的抑制作用最为明显（图5图8）。0064以上的抑菌测试进一步表明本发明中原核表达的家蚕抗菌肽ATTACIN2在抑制黑胸败血病菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和金黄葡萄球菌的生长方面具有显著作用，因此可应用于抑菌制剂、药物或添加剂的制备。0065以上所述仅为本发明的优选实施例，其目的并不在于将本发明限制或约束于上述实现方式。凡在本发明的范围内对本发明所做出的任何修改和替换均应包含在本发明权利要求所限定的范围内。说明书CN104212805A1/3页800010002序列表CN104212805A2/3页90003序列表CN104212805A3/3页10序列表CN104212805A101/4页11图1图2图3说明书附图CN104212805A112/4页12图4图5说明书附图CN104212805A123/4页13图6图7说明书附图CN104212805A134/4页14图8说明书附图CN104212805A14。