一般情况下DNA、RNA的提取主要是采用强力变性剂如盐
酸胍或异硫氰胍或尿素-氯化锂等来溶解蛋白质，从而破坏细
胞、病毒，并使核蛋白从核酸上解离下来，并灭活可能存在的
RNA酶。在此基础上可采用硅藻、玻璃粉吸附和解吸附或有机溶
剂抽提、乙醇(异丙醇)沉淀法提取核酸。这一方法是目前从事
RT-PCR的临床实验室常规应用的方法。
有机溶剂法的原理是强力变性剂与硫基乙醇联合作用溶解
蛋白灭活RNA酶，再加入乙酸钠、饱和酚、氯仿-异戊醇抽取
以变性蛋白，经高速离心后得到上清，再以乙醇或异丙醇沉淀
浓缩核酸再以75％乙醇洗涤沉淀和容器去除残余盐份，再经烘干
去除残余乙醇，从而得到纯净的核酸。从以上实验过程我们可
以看到其优点在与能有效去除蛋白，排除一些溶于有机溶剂的
干扰反应的物质，而且可以有效地浓缩核酸，但是其缺点也非
常明显，首先是操作非常繁琐，有机溶剂抽提后取上清的过程
必须小心谨慎，通常的小体积操作时很容易吸到或碰到导致实
验失败的界面处的蛋白及有机溶剂；为了浓缩核酸，往往要加
入一定量的助沉淀剂，有时会造成或大或小的影响；乙醇的洗
涤过程仍属小心操作，以免沉淀的丢失；整个过程中至少需要
三次较长时间的离心。
硅藻、玻璃粉吸附的原理是高盐的强力变性剂作用下溶解
蛋白、灭活RNA酶，核酸与同步加入的硅藻或玻璃粉吸附，经
离心后小心吸尽上清，再以高盐的强力变性剂溶液洗涤，经离
心后小心吸尽上清，再以乙醇、丙酮等有机溶剂洗涤，经离心
后小心吸尽上清，烘干后即得吸附的核酸样品，加入低盐的反
应体系即可使核酸解吸附进入反应液。这一方法的优点在于所
有的离心步骤都是一分钟以内的短时间，从而大大提高了实验
速度；不用酚氯仿的有机溶剂处理，从而避免了导致实验失败
的一个重要影响因素。但这一方法仍有较大的缺点；其仍然需
要离心步骤；上清的吸取必须彻底，否则可能导致实验失败，
所以对操作的要求较高；由于吸附物质性质较为疏松，吸尽上
清时很容易吸走吸附物质而导致实验失败，因此有时需要反复
操作；核酸浓度太低时，解吸附的比率较低，所以有时仍需加
入tRNA等辅助核酸，以提高目标核酸的得率，有时会造成或大
或小的影响。
上述两种方法最大的缺点在于其需要多次离心，它极大地
限制了单位时间内可处理的样品数，而某些步骤需要的精心操
作，不仅限制了单位时间内可处理的样品数，增大了操作人员
的劳动强度，而且使得实验的稳定性受到威胁。
RNA抽提的方法还有采用去污剂与蛋白酶联合作用标本后，
经有机溶剂抽提，乙醇或异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤最后得到纯
净的核酸。该方法不仅有与强力变性剂方法同样的缺点，比如
多次离心，操作精度要求较高；有时需加助沉淀剂；操作失败
而导致假阴性的可能性较高等等；而且该方法RNA的得率较低，
因为有可能标本中的RNA酶在被蛋白酶消化或抑制前有时间发
挥作用。
RNA抽提的简便方法还有去污剂与蛋白酶联合作用标本或
仅用去污剂作用标本，然后直接经100℃水浴煮沸后离心取上
清作为核酸制备物。但这一简便方法实际使用中发现其RNA酶
不完全失活而稳定性不高。
本发明的目的是研制一种试剂，用于核酸的抽提，从而取
得提高检测稳定性和提高检测效率的良好效果。
本发明研制出一种混合试剂，它们是50-90％浓度的乙醇和
1-10％(V/V)焦碳酸二乙酯(DEPC)的混合液。该混合液以(0.8-
1.2)∶(8-12)比例与血清或血浆或其它标本混合均匀，再经25-
40℃水浴1-12分钟后，在沸水浴中置放5-20分钟，再打开试管
盖置于55-70℃水浴10-30分钟即可发挥掉乙醇与DEPC及水份，
目的是适当浓缩样品，最后经12000-16000转/分高速离心，一般
5-15分钟即可，所得上清即可用于PCR或RT-PCR的核酸溶液。
上述混合液中，乙醇更为合适的浓度是70-85％(V/V)，DEPC
更为合适的浓度是5-9％(V/V)。
应用该种溶液进行样品处理，可有效抑制临床标本中所含
RNA酶，其核酸溶液的质量应用于RT-PCR扩增的效果不差于
强烈变性剂处理-有机溶剂抽提-乙醇沉淀法所得的核酸，甚
至PCR检测的灵敏度更高，从而使弱酸阳性的标本检出率稳定
更高。利用该方法进行样品处理，操作的均一性较好，从而提
高了实验的稳定性，使由于操作引起的假阴性率大大降低。该
方法中离心只需一次，从而使单位时间内样品处理数得以提高，
为大批标本的处理提供了可能性，该方法中不引入tRNA等辅助
核酸，从而避免了对实验潜在的影响。该方法的操作时间比常
规处理的方法大大缩短，使得实验结果能更早得到，进一步体
现出PCR的优越性。该方法同样适用DNA的抽提，从而仅进行
一次处理，可同时进行DNA及RNA的检测，为多种并发的病例
的诊断提供了方便。
实施例1：
一、核酸制备：
配制90％乙醇、10％DEPC溶液，取5μl临床标本的50μl血
清或血浆中，混合均匀，置37℃水浴10分钟，然后转入100
℃沸水浴20分钟，打开离心管盖后置68℃水浴20分钟后以
15000转/分离心15分钟，上清液即为核酸溶液。
二、反应液配方：
10×逆转录缓冲液：Tris.cl 250mM pH8.20
(NH4)2SO4 200mM
明胶 1mg/ml
10×逆转录底物：HCV逆转录引物质：5μM
dATP dTTP dGTP dCTP各2mM
二硫苏糖醇DTT 10mM
Mncl2 20mM
耐热逆转录酶为复旦大学遗传所自己研制的FDTRT。
5×PCR缓冲液：Tris.cl 125mM pH8.20
Kcl 250mM
明胶 0.5mg/ml
Mgcl2 10mM
Formamide 25％
10×PCR底物：HCV扩增引物P3、P4各5μM
dATP dTTP dGTP dCTP各2mM
EGTA 6mM
耐热DNA聚合酶为复旦大学遗传所自己研制的Taq DNA
Polymerase。
引物P2、P3、P4由Applied Biosgstems公司的381A型DNA
合成仪合成PAGE纯化，其核苷酸顺序如下：
P2 5′-d(GGTGCACGGTCTACGAGACCT)-3′
P3 5′-d(CTGTGAGGAACTACTGTCTTTC)-3′
P4 5′-d(CCCTATCAGGCAGTACCACAA)-3′
三、反应过程
1、按下列顺序配制反应系统：加入灭菌的DEPC处理重蒸水14μl
至离心管，再加入2μl10×逆转录缓冲液，2μl10×逆转录底
物，耐热逆转录酶4u，2μl制备的核酸溶液，混合均匀后离心
片刻，加入液体石蜡30μl。
2、置65℃～68℃水浴3～20分钟后100℃沸水浴5分钟备
用。
3、按下述顺序配制反应系统：加入灭菌重蒸水12μl至离心管，
再加入4μl 5×PCR缓冲液2μl 10×PCR底物，耐热DNA聚合
酶1u，2μl上述沸水浴后的下层水相中的逆转录产物混合均匀
后离心片刻，加入液体石蜡30μl。
4、置91～94℃ 30秒。
5、按下述条件进行30～40次循环：
91℃～94℃ 20～30秒
55℃ 20～30秒
70℃～75℃ 20～30秒
6、循环后置70～75℃ 0～5分钟。
四、产物检测：
样品取下层水相101μl加2μl 50％蔗糖、溴酚蓝溶液，
2％Agarose TAE电泳缓冲液电泳。
五、结果及讨论：
经扩增后有257bpDNA片段为HCV阳性标本，无257bpDNA
片段者为HCV阴性标本。
本实验结果说明利用“快速核酸抽提液”获得的核酸溶液。
可以有效地应用于RT-PCR检测RNA样品。
实施例2：
一、核酸制备：
配制70％乙醇、5％DEPC溶液，取5μl加入临床标本的50μl
血清或血浆中，混合均匀，置30℃水浴1分钟，然后转入100
℃沸水浴5分钟，打开离心管盖后置60℃水浴10分钟后13000
转/分离心5分钟，上清液即为核酸溶液。
二、反应配方：
10×逆转录缓冲液：Tris.cl 250mM pH8.20
(NH4)2SO4 200mM
明胶 1mg/ml
10×逆转录底物：HCV逆转录引物质：5μM
dATP dTTP dGTP dCTP各2mM
DTT 10mM
Mncl2 20mM
耐热逆转录酶为复旦大学遗传所自己研制的FD TRT。
5×PCR缓冲液：Tris.cl 125mM pH8.20
Kcl 250mM
明胶 0.5mg/ml
Mgcl2 10mM
Formamide 25％
10×PCR底物：HCV扩增引物P3、P4各5μM
HBV扩增引物P5、P6各5μM
dATP dTTP dGTP dCTP各2mM
EGTA 6mM
耐热DNA聚合酶为复旦大学遗传所自己研制的Taq DNA
Polymerase。
引物P5 P6由Applied Biosgstems公司的381A型DNA合成仪
合成PAGE纯化，其核苷酸顺序如下：
P5 5′-d(CTCGGATCCTTGTGACTTCTTTCCTT)-3′
P6 5′-d(CGGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCT)-3′
三、反应过程：
1、按下述顺序配制反应系统：加入灭菌的DEPC处理重蒸水14μl
至离心管，再加入2μl10×逆转录缓冲液，2μl10×逆转录底
物，耐热逆转录酶4u，2μl制备的核酸溶液，混合均匀后离心片
刻，加入液体石蜡30μl。
2、置65℃～68℃水浴3～20分钟后100℃沸水浴5分钟备
用。
3、按下述顺序配制反应系统：加入灭菌重蒸水12μl至离心管，
再加入4μl5×PCR缓冲液，2μl10×PCR底物，耐热DNA聚合
酶1u，2μl上述沸水浴后的下层水相中的逆转录产物，混合均
匀后离心片刻，加入液体石蜡30μl。
4、置91℃～94℃ 30秒
5、按下述条件进行30～40次循环：
91℃～94℃ 20～30秒
55℃ 20～30秒
70℃～75℃ 20～30秒
6、循环后置70℃～75℃ 0～5分钟
四、产物检测
样品取下层水相10μl加2μl 50％蔗糖溴酚蓝溶液
2％Agarose TAE电泳缓冲液电泳
五、结果及讨论
经扩增后有257bp 441bp两条DNA片段者为HBV HCV皆阳
性标本，仅有257bp DNA片段者为HBV阴性，HCV阳性标本，
仅有441bp DNA片段者为HBV阳性HCV阴性标本，无257bp 441
bpDNA片段者为HBV、HCV皆阴性标本。
本实验说明利用“快速核酸抽提液”获得的核酸溶液，可
以有效地应用于RT-PCR或PCR同时检测DNA及RNA样品。