培养装置 【技术领域】
本发明涉及一种用于对取自患者的体液中的细胞进行培养的培养装置。
背景技术
近年来，通过在骨瘤切除或外伤造成的骨缺损部位等人体组织缺损部位填补骨填补材料等人体组织填料，使骨等人体组织再生以修复人体组织缺损部位已经成为可能。虽然已知的骨填补材料包括羟磷灰石(HAP)和磷酸三钙(TCP)，但是，出于不在体内残留异物的考虑，使用含有如β-TCP这样的多孔磷酸钙材料形成的基础材料作为骨填补材料。例如，使β-TCP与骨缺损位部位的骨细胞接触的情况下，破骨细胞会消耗β-TCP，进而骨芽细胞形成新骨，结果发生所谓的再成型的过程。也就是说，填补在骨缺损部位的骨填补材料随着时间的推移而被转化成自身地骨。
另一方面，为了提高术后骨缺损部位的修复速度，不是直接使用骨填补材料，而是将取自患者的骨髓液添加到骨填补材料中，然后再填补到骨缺损部位。在这种情况下，从患者处采取含有大量间叶干细胞的骨髓液，在将骨填补材料浸入这种骨髓液之后，再将骨填补材料填补在骨缺损部位。然而，将骨填补材料只简单地浸入骨髓液中仍然存在无法使足够数量的间叶干细胞附于骨填补材料上的问题。因此，已经考虑通过培养提取的骨髓液，使增长繁殖后的间叶干细胞附在骨填补材料上，以使在骨填补材料上附着足够数量的间叶干细胞。
在骨髓液的培养中包括培养步骤、培养基更换步骤、感染检测步骤等各种的步骤，以往所有这些步骤为手工操作。
然而，在这些步骤及步骤间传递过程中有手的存在时，手增加了混入细菌、真菌和其它微生物的可能性的问题。
【发明内容】
鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种培养装置，其可以减少细菌、真菌和其它微生物污染的机会，提供健康的培养细胞。
为达到上述目的，本发明提供一种培养装置，其在无菌箱里配置分别储藏培养基和人体组织填补材料的储藏单元、从采取的体液中提取用于培养的细胞的细胞提取单元、在培养基中培养提取的细胞并由培养的细胞和人体组织填补材料制成人体组织填补物的细胞培养单元，以及将制成的人体组织填补物密封于容器里的密封单元，所述细胞培养单元连接在储藏单元和细胞提取单元上。
通过这样的培养装置，采取的体液被送到细胞提取单元，在该细胞提取单元将待培养的细胞提取出来。提取出的细胞被送到细胞培养单元，与储藏在储藏单元的培养基混合后，培养预定的一段时间使细胞生长。另外，通过使生长的细胞附于储藏在储藏单元的人体组织填补材料而制成人体组织填补物。制成的人体组织填补物被送到密封单元而被密封在容器中。在这种情况下，因为所有步骤都在无菌箱中操作，降低了整个培养过程中细菌或其它微生物感染的机会，由此可以提供健全状态的人体组织填补物。
另外，本发明还提供一种如上所述的培养装置，其还在无菌箱里配有检测单元，所述检测单元连接细胞提取单元和细胞培养单元，并且至少对体液和细胞的感染情况进行检测。
通过这样的培养装置，可以对体液和保存于细胞培养单元的细胞进行感染情况的检测。因为感染情况的检测也是在无菌箱中进行的，所以这样的培养装置还减少了在检测步骤中细菌或其它微生物感染的机会。
另外，本发明还提供一种如上所述的培养装置，其中利用从细胞培养单元废弃的培养基检测所述细胞的感染情况。
通过这样的培养装置，因为使用的是从细胞培养单元废弃的培养基，所以在对细胞的感染情况进行检测时不会污染培养中的细胞。在细胞培养单元中要定期或连续地更换培养基，此时不再需要的培养基被丢弃，所以用这种丢弃的培养基检测感染情况，可以可靠地检测出在丢弃前接触这些培养基的细胞的感染情况。
另外，本发明还提供一种如上所述的培养装置，其中还对细胞培养单元中制成的人体组织填补物进行所述感染情况的检测。
通过这样的培养装置，利用切取等方法采取作为最终产物的人体组织填补物的一部分进行所述的感染检测，或使用在与最终产物相同条件下制成的检测用人体组织填补物进行感染检测，这样可以更可靠地提供健全的人体组织填补物。
另外，本发明还提供如上所述的培养装置，其进一步包括连接到检测单元的记录单元，该记录单元在密封单元中密封有人体细胞填补物的容器上记录至少包括检测结果的信息。
通过这样的培养装置，由于记录单元的操作，有感染检测结果的信息被记录在密封有人体组织填补物的容器上，这样，接受制成的人体组织填补物的人就可以从记录在容器上的信息了解上述人体组织填补物的检测结果。因此，密封于容器中的人体组织填补物的质量就有了保证。
另外，本发明还提供一种如上所述的培养装置，其中所述细胞培养单元包括将提取的细胞在培养基中培养的初级培养单元，和将培养的细胞和人体组织填补材料一起在培养基中培养的二次培养单元。
通过这样的培养装置，在初级培养单元可以获得生长的培养细胞，而在二次培养单元用人体组织填补材料作为基础材料，培养细胞生长，得到生长的人体组织填补物。因此，可以获得作为产品的培养细胞或人体组织填补物。另外，因为在初级和二次培养单元均能进行感染检测，所以可以更可靠地获得健全性。
另外，本发明还提供一种如上所述培养装置，其中所述密封单元密封初级培养单元中培养的细胞。
通过这样的培养装置，可以提供避免了细菌和其它微生物感染的健全状态的人体组织填补物和初级培养单元培养的细胞。
【附图说明】
图1是表明本发明第一个实施方案中的培养装置的输入和输出的示意图。
图2是表明图1培养装置的一般组成的框图。
图3是用来阐明图2的培养装置的各步骤的流程图。
图4A和4B是用来阐明图1的培养装置中使用的骨填补材料补给装置的操作。
图5是用来阐明本发明第二个实施方案中的培养装置的各步骤的流程图。
图6是表明本发明另一个培养装置实施例的示意图。
【具体实施方式】
以下参照图1到图4A和4B，对本发明的一个实施方案中的培养装置进行说明。
如图1所示，供给采自患者的骨髓液2、附着有所述骨髓液2所含的细胞的骨填补材料3和培养基4，本实施方案所述的培养装置可输出附着有培养的细胞的骨填补物5和表明各个步骤的感染检测结果的数据。
更明确地讲，如图2所示，本实施方案所述的培养装置1的无菌箱11内配有储藏单元6、细胞提取单元7、细胞培养单元8a和8b、密封单元9和检测单元10。
上述储藏单元6由多个容器组成，可分开保存骨填补材料3和培养基4。如图3所示，培养基4包括如最小必须培养基(MEM)、胎牛血清(FBS)和抗生素，这些以混合状态保存或被分别保存于容器12、13和14中。另外，储藏培养基4的容器保存在未图示的冷藏装备中，例如在4℃保存。抗生素可以为如青霉素类抗生素。
骨髓液2被提供给细胞提取单元7。例如，上述细胞提取单元7是离心机，从保存骨髓液2的容器中获得骨髓液2，然后离心分离该骨髓液2，可以从骨髓液2提取比重大的骨髓细胞。
用于培养上述骨髓细胞的细胞培养单元由初级培养单元8a和二次培养单元8b组成。如图3所示，初级培养单元8a分别连接上述的细胞提取单元7和保存培养基4的容器。该初级培养单元8a具有培养容器15、搅拌装置(未图示)和恒温恒湿器16，所述培养容器15接受在细胞提取单元7提取的骨髓细胞和储藏在容器中的培养基；所述搅拌装置对在培养容器15中的骨髓细胞和培养基进行搅拌；所述恒温恒湿器16可以使搅拌混合过的骨髓液2和培养基4保持在预定的温度(如，37±0.5℃)、CO2浓度(如，5体积％)等培养条件，所述初级培养单元8a能够在设定的培养条件下对细胞进行预定一段时间的培养。另外，初级培养单元8a上连接储藏蛋白酶如胰蛋白酶的容器17。因此，在初级培养单元8a的培养步骤期间，在培养容器15中加入胰蛋白酶，可以将附着在培养容器15底部的细胞与培养容器15分离开来。此外，初级培养单元8a还可以连接离心机18，这样可以将与胰蛋白酶混合的细胞提取出来。
二次培养单元8b连接初级培养单元8a，同时还连接保存骨填补材料3的容器(未图示)。与上述初级培养单元8a类似，该二次培养单元8b具有培养容器19、未图示的搅拌装置和恒温恒湿器20。例如，在保存骨填补材料3的容器中设有如图4A和4B所示的骨填补材料补给装置21。该骨填补材料补给装置21由闸门23和控制装置24构成，所述闸门23设置在保存骨填补材料3的容器22中，所述控制装置24只允许最下方的骨填补材料3a落下，此上的骨填补材料3被所述控制装置压住。控制装置24由活塞25和控制杆26组成。
也就是说，如图4A所示，关闭闸门23。将全部的骨填补材料3装在该闸门23上，然后进行如图4B所示的控制装置24的如下操作，在从底部数第二个骨填补材料3b被控制杆26拦住的状态，打开闸门23，只有最低的骨填补材料3a可以落下。因此，可以与根据培养的骨髓细胞数量而决定的骨填补材料3的数量一致，通过操纵控制装置24和闸门23的开启和关闭，将所需数量的骨填补材料3装入培养容器19中。
另外，在这些初级培养单元8a和二次培养单元8b中配置用于定期更换培养容器15和19中的培养基的培养基更换装置27和28。培养基更换装置27和28具有例如可使培养容器15和19绕水平轴旋转的容器旋转装置(未图示)。也就是说，操纵容器旋转装置，通过绕水平轴旋转培养容器15和19，使培养容器15和19倾斜或翻转，从而可以从培养基容器15和19中排出内部的培养基4。
另外，在培养基更换装置27和28中配置保存排出培养基4’的废培养基容器29。
密封单元9被连接到二次培养单元8b上，并将上述二次培养单元8b中产生的骨填补物密闭输出到密闭容器30中。
此外，样本提取单元31被连接到二次培养单元8b上，可以从作为最终产品的骨填补物上取得检测用样本。
另外，检测单元10是一个全自动实时聚合酶链式反应(PCR)装置，其被连接到上述的骨髓液2的容器、初级培养单元8a的废培养基容器29、二次培养单元8b的废培养基容器29和样本提取单元31上。在该全自动实时PCR装置中，使用对真菌、细菌、内毒素、病毒和支原体等全部能够检测的底物。
在本实施方案所述的培养装置1中，这些储藏单元6、细胞提取单元7、细胞培养单元8a和8b、密封单元9和检测单元10被配置在无菌箱11中。例如与结晶室相似，无菌箱11内部保持固定的正压，且通过颗粒计数器等限制单位体积的灰尘数等。
以下说明本实施方案中所述的培养装置1的操作。
根据本实施方案中所述的培养装置1，当将采自患者的骨髓液2投入装骨髓液的容器时，将上述骨髓液2的一部分送到检测单元10，进行感染检测。剩余的骨髓液2被送到细胞提取单元7，在细胞提取单元7中进行离心分离，提取待培养的骨髓细胞。
提取出的骨髓细胞被送到初级培养单元8a并被培养，生长繁殖到预定的细胞数量。
如图3所示，在初级培养单元8a中，已被送至该初级培养单元8a的骨髓细胞和储藏在储藏单元6中的含有MEM、FBS、抗生素等的培养基4在培养容器15中被混合。在混合前移出一部分培养基4，并送往检测单元10检测感染情况。
混合的骨髓细胞和培养基4在保持预定培养条件的恒温恒湿器中培养预定的一段时间。接着，判断是否到了更换培养基的时间，当到了预定更换培养基的时间时，将培养基4’排到废培养基容器29中。将排到废培养基容器29的培养基4’的一部分送至检测单元10以检测感染情况。另一方面，判断保留在培养容器中的细胞是否达到完成初级培养的时间，如果还没有达到完成的时间，再次混入培养基4，继续初级培养。重复进行混入培养基4、培养、排出培养基4’，直到完成初级培养。
在达到初级培养完成的时间的情况下，进行质量检测以确定细胞的数量是否已经达到预定数，如果细胞数还没足够多时，再次进行初级培养步骤。在质量检测中确定细胞数已足够多时，将胰蛋白酶加到培养容器15中，剥离生长在培养容器15底部的培养细胞。通过离心分离机18仅提取培养细胞。然后，用血球计数器调整培养细胞的数量，随后送至二次培养单元8b。
在二次培养单元8b中，除了已送至该二次培养单元8b中的培养细胞被装入培养容器19中，保存在储藏单元6中的骨填补材料3也被装入培养容器19中，这样使得培养细胞接种在骨填补材料3中。接着，与初级培养的情况类似，从储藏单元6将培养基4加入到培养容器19中，并在此混合。加入的培养基4与在初级培养中使用的培养基4不同，除了MEM、FBS和抗生素外，还混合了地塞米松或β-甘油磷酸酯等分化诱导因子和维生素C等营养物质。随后，将接种了培养细胞的骨填补材料3浸渍在培养基4内，在这种情况下开始二次培养。在该二次培养步骤中，也在每次预定的培养基更换时间将培养基4’排到废培养基容器29中，然后检测感染情况。当到达完成二次培养的时间时，再进行质量检测，完成二次培养。
当二次培养完成后，从二次培养单元8b中输出以骨填补材料3为基础材料、具有充分生长繁殖细胞的骨填补物。当输出的骨填补物通过样本提取单元31时，取出骨填补物的一部分作为检测样本，送至检测单元10进行感染情况的检测。另外，剩余的骨填补物被送至密封单元9，因此被密封于封闭容器30中。从密封单元9输出并被密封于封闭容器30中的骨填补物是本实施方案所述培养装置1的最终输出之一。另外，各步骤的废弃培养基4’和被送至检测单元10的样本在检测单元10中检测感染情况的检测结果也是本实施方案所述培养装置1的最终输出之一。
这样，通过本实施方案所述的培养装置1，只需投入采自患者的骨髓液2，就可同时获得密封的骨填补物和在培养过程中进行感染检测的结果。因此，与在现有手工操作的步骤比较，大大降低了被细菌、真菌和其它微生物感染的机率。因此，除了可以提供可存活的骨填补物外，还可以减少工人操作，容易地生产出大量骨填补物。
此外，在初级培养单元培养之后，细胞也可以被送到密封单元9并以密封状态输出(图2中虚线路线表示)。
其次，参照图5，说明本发明第二个实施方案所述的培养装置40。
在本实施方案的说明中，与前述的第一个实施方案所述的培养装置具有相同组成的那些位置使用相同的符号，省略了它们的说明。
本实施方案所述的培养装置40与第一个实施方案所述的培养装置1不同之处在于，检测单元10上连接了记录单元41。记录单元41例如配有数据库和识别代码的打印机，所述数据库对应地储存每个骨填补物的检测结果的数据组和用于识别这些组的识别代码42。这样可以在封有骨填补物的密封容器30上打印该密封容器30内骨填补物相应的识别代码42。
通过这样构成的本实施方案所述的培养装置40，接受印有识别代码42的密封容器30的人，仅需读取印在密封容器30上的上述识别代码42就可以从数据库中得到对应该识别代码42的检测结果数据组，这样的作用是，对于每个骨填补物，可以以对应于上述骨填补物的形式，很容易地知道每个骨填补物培养过程中各阶段的检测结果。
此外，对应识别代码42的数据库中储存的信息不仅包括上述骨填补物的感染检测结果，还可以包括鉴别患者的姓名、性别、年龄、出生日期等其它识别数据，或者显示培养日志的培养条件和培养时间以及除感染检测外的检测结果，如质量检测的结果等。
另外，在无菌箱11中配置的培养装置1和40各单元间的运输装置等，虽然没有特别指出，但可以由一般的运输装置如传送带或机械手组成。另外，作为液态的培养基等的供给装置，可以采用如滚子泵等。
另外，作为可加到培养基4的成分的例子有，生长因子如细胞因子、浓缩的血小板、BMP、FGF、TGF-β、IGF、PDGF、VEGF、HGF和这些的混合物等促进生长的物质。另外，还可以将雌激素等激素制品或维生素等营养物质混合在培养基4中。
在这种情况下，这些生长因子，激素制品或营养物质的混合比例应该根据待培养的骨髓液2的活性程度决定。另外，虽然作为抗生素采用了青霉素类抗生素，但也可以采用头孢类、大环内酯类、四环素类、磷霉素类、氨基糖甙类、新喹诺酮类等其它任何抗生素代替青霉素类抗生素。
另外，虽然上述实施方案的说明使用了骨髓液2作为待培养的体液的例子，但也可以使用末梢血或脐带血代替。另外，在该说明书中，为了方便，将含有胚胎干细胞(ES细胞)、体干细胞、间叶干细胞、骨细胞和软骨细胞等体细胞的液体也称作体液。此外，细胞可以是自体的，也可以是异体的。
另外，虽然上述实施方案中使用骨作为人体组织的一个例子，但也可以生产其它人体组织的填补物。在这种情况下，可以使用任何与人体组织有亲和力的材料作为人体组织填补材料，更优选能被人体吸收的材料。另外，该材料也可以是多孔的。所谓多孔材料是有生物适应性的多孔陶瓷、胶原、聚乳酸或多孔金属等，只要其是有大量的气孔的材料，可以不限定于这些材料。作为多孔材料通常可以使用磷灰石或β-磷酸三钙(β-TCP)等磷酸钙类陶瓷、胶原或聚乳酸等。另外，可以将磷酸钙类陶瓷与胶原组合使用，或者将磷酸钙类陶瓷与聚乳酸组合使用。β-TCP、胶原和聚乳酸具有能因生物降解而被人体吸收的特性，而磷灰石具有强度高的特性。不言而喻，在本领域专业人员可以根据移植部位等恰当地选择和使用适当种类的多孔材料。
另外，在上述各实施方案的培养过程中完全排除了手的存在，但这可以用如图6所示的方案代替，即从培养装置1中输出骨填补物5、用于检测的细胞43和用于检测的培养基44，在培养装置1外配置的检测装置45中检测真菌、细菌和其它微生物感染。
另外，在上述各实施方案中骨填补材料补给装置21等各构成装置的具体结构是构成本发明的一种方式的例子，但本发明不限于此。
如上所阐明，通过本发明所述的培养装置，只需投入体液即可在没有手的存在下制造人体组织填补物，所以起到了可以减少感染机率，提供健全的人体组织填补物的作用。
另外，因为在得到人体组织填补物的同时还可以知道检测结果，所以可以有提高对所提供的人体组织填补物的质量可信性，因此具有可以让使用者更加安心地使用的效果。