酵母中来自Tritirachium album的重组蛋白酶K的表达 本发明涉及以经济适当量制备可溶且活性形式的重组蛋白酶K的方法。
蛋白酶K(E.C.3.4.21.64，也已知为内肽酶K)是真菌Tritirachium album Limber合成的胞外内肽酶。它是具有典型催化三元组Asp39-His69-Ser224的丝氨酸蛋白酶类中的一员(Jany，K.D.等，(1986)FEBS Letters Vol.199(2)，139-144)。因为其长度为279个氨基酸的多肽链的序列(Gunkel，F.A.和Gassen，H.G.(1989)，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)Vol.179(1)，185-194)和三维结构(Betzel，C.等(1988)，Eur.J.Biochem.Vol.178(1)，155-71)与细菌枯草杆菌蛋白酶具有高度同源性，因此将蛋白酶K分类为枯草杆菌蛋白酶家族(Pahler，A.等(1984)EMBO J.Vol.3(6)，1311-1314；Jany，K.D.和Mayer，B.(1985).Biol.Chem.Hoppe-Seyler，Vol.366(5)，485-492)。以其水解天然角蛋白的能力为基础对蛋白酶K命名，而真菌在角蛋白上生长使角蛋白作为唯一碳源和氮源(Ebeling，W.等(1974)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)Vol.47(1)，91-97)。蛋白酶K具有高于30U/mg的特异活性，是已知的内肽酶中最有活性的之一(Betzel，C.等(1986)/FEBS Lett.Vol.197(1-2)，105-110)，并且非特异性水解天然的和变性的蛋白质。
来自Tritirachium album Limber的蛋白酶K在其天然宿主中翻译成前蛋白酶原。1989年Gunkel，F.A.和Gassen，H.G.(1989)Eur.J.Biochem.Vol.179(1)，185-194解码了编码蛋白酶K的基因的cDNA的序列。据此前蛋白酶K原基因由两个外显子组成，并且编码15个氨基酸长度的信号序列，90个氨基酸长度的序列原和279个氨基酸长度地成熟蛋白酶K。63bp内含子位于序列原区。前肽在易位过程中裂解为内质网(ER)。迄今，有关用肽原裂解形成成熟蛋白酶K的后加工还知之甚少。
结果成熟蛋白酶K由279个氨基酸组成。两个二硫桥和两个键合的钙离子使得紧密结构稳定。这解释了为什么与其他枯草杆菌蛋白酶相比蛋白酶K对极端pH值，高温，离液剂和去污剂具有高得多的稳定性(Dolashka，P.等(1992)Int.J.Pept.Protein.Res.Vol.40(5)，465-471)。蛋白酶K特征在于高热稳定性(达65℃，Bajorath等(1988)，Eur.J.Biochem.Vol.176，441-447)和宽pH-范围(pH7.5-12.0，Ebeling，W.等(1974)Eur.J.Biochem.Vol.47(1)，91-97)。在变性剂例如脲或SDS存在下其活性得以提高(Hilz，H.等(1975)J.Biochem.Vol.56(1)，103-108；Jany，K.D.和Mayer，B.(1985)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，Vol.366(5)，485-492)。
上述性质使得蛋白酶K在其中要求非特异性蛋白质降解的生物技术应用中特别令人感兴趣。特别例举的是从粗提取液中分离核酸(DNA或RNA)以及在DNA分析中预制备样品(Goldenberger，D.等(1995)PCR Methods Appl.Vol.4(6)，368-370；US5,187,083；US5,346,999)。其他应用是在蛋白质分析领域，例如结构释析。
通过真菌Tritirachium album Limber发酵商业上大量获得蛋白酶K(例如CBS348.55，Merck菌株No.2429或菌株ATCC22563)。但是在该过程中，葡萄糖或游离氨基酸抑制蛋白酶K的产生。因为含有蛋白质的介质也诱导蛋白酶的表达，所以需要使用蛋白质例如BSA，奶粉或大豆粉作为唯一氮源来源。一旦达到生长稳定期就开始分泌蛋白酶(Ebeling，W.等(1974)Eur.J.Biochem.Vol.47(1)，91-97)。
所以因为Tritirachium album Limber不适合大规模发酵，而且难以进行基因操作，曾进行过在其他宿主细胞中过量表达重组蛋白酶K的尝试。但是，由于没有表达，发生失活“包函体”或者与复性有关的问题，在这些实验中没有检测到显著活性(Gunkel，F.A.和Gassen，H.G.(1989)Eur.J.Biochem.Vol.179(1)，185-194；Samal，B.B.等(1996)Adv.Exp.Med.Biol.Vol.379，95-104)。
Tritirachium album Limber是缓慢生长着的真菌，其只向培养基中分泌少量蛋白酶。缺点是与酵母相比更短的细胞周期和在发酵罐中能实现的更低的光密度。另外，已知T.album除了蛋白酶K之外还产生污染制备的其他蛋白酶(Samal，B.B.等(1991).EnzymeMicrob.Technol.Vol.13，66-70)。
虽然原理上能在大肠杆菌中表达蛋白酶K，其不以可溶形式表达而是以所谓“包函体”表达，其中酶接着用一定方法溶解并且复性。该方法的缺点是在溶解和复性过程中损失很多蛋白质。
因此本发明的目的是提供以经济适当量制备重组蛋白酶K的方法。
令人惊奇地发现有可能在酵母中表达和分泌作为可溶形式的酶原母体(zymogene Vorstufe)的重组蛋白酶K，其中自动催化激活形成活性蛋白酶K。本发明的另一个主题是从培养基上清液纯化活性蛋白酶K。
因此本发明涉及制备重组蛋白酶K的方法，包括步骤：
a)用包含编码蛋白酶K的酶原母体的DNA的载体转化宿主细胞，其中所述编码序列的DNA在读框中与编码信号肽的序列向上游(stromaufwrts)融合并且处于该宿主细胞的合适的启动子的调控之下，
b)蛋白酶K的酶原母体的表达，
c)蛋白酶K的分泌和自动催化激活，
d)蛋白酶K的分离和纯化
其特征在于宿主细胞是酵母细胞，并且这种表达宿主分泌可溶形式的蛋白质。
在根据本发明方法的一个具体实施方案中，宿主细胞选自：毕赤氏酵母属(Pichia)的种，汉逊氏酵母属(Hansenula)的种，例如多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)，糖酵母属(Saccharomyces)的种，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)的种，Yarrowia属的种，例如Yarrowia lipolytica，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)的种和曲霉属(Aspergillus)的种。根据本发明特别优选的是巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)被用作宿主细胞。
此外还证明当用编码酶原母体的DNA转化宿主细胞并且在分泌到培养基期间或分泌到培养基中之后马上自动催化激活蛋白酶K时根据本发明的方法的优点。
当使用巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)作宿主细胞时，优选将编码蛋白酶K的酶原母体的基因克隆到下面的载体中：pPICZ，pPICZα，pGAPZ，pGAPZα，pPICZαA和pPIC9K。在这种情况下，特别优选载体pPICZαA和pPIC9K。根据本发明，载体pPICZαA是特别优选。上述载体可商业购得(Invitrogen)。
此外，当用甲醇诱导蛋白酶K或蛋白酶K的酶原母体的表达(pPIC载体)时，优选根据本发明方法制备重组蛋白酶K。另一种方法是甘油醛磷酸诱导表达(pGAP载体)。
在制备重组蛋白酶K的本发明方法中，优选的是通过来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子的信号肽的N-末端融合引发蛋白质分泌。这意味着例如上述α-标记的载体具有用于来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子的信号肽的核苷酸序列。然后在翻译过程中产生得自N-末端的信号肽和目标蛋白质的融合蛋白。另一种可能的信号肽会是蛋白酶K的天然信号序列。
此外对于制备重组蛋白酶K特别有利的是用包含编码酶原母体的DNA的表达载体pPICZαA和pPIC9K转化宿主细胞巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)并且该基因受AOXl启动子的调控并且任选地有AOXl中止子。
本发明还涉及包含编码蛋白酶K的酶原母体的DNA的载体，其中所述编码序列在读框中与编码合适的信号肽的序列向上游融合并且其中编码基因处于该宿主细胞的合适的启动子和任选的中止子的调控之下，并且其中该载体适合这种宿主细胞的转化。根据本发明，所述宿主细胞是酵母。
因此本发明还涉及包含上面定义的重组DNA的一个或多个拷贝的重组载体。所述载体优选是具有宿主细胞的强启动子和宿主细胞用于分泌蛋白质的合适信号肽的质粒。此外还可以使前蛋白酶K原的天然信号肽与如在SEQ.ID.NO.：21(信号序列1-15(15个氨基酸)；序列原16-104(90个氨基酸，成熟蛋白酶K的序列106-384(279个氨基酸))中所示的肽原的N-末端融合。用来产生表达载体的方法是本领域技术人员公知的，并且例如Sambrook等(1989)有所描述。
本发明的另一个主题是用上面列出的载体之一转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母。宿主细胞优选选自：毕赤氏酵母属(Pichia)的种，汉逊氏酵母属(Hansenula)的种，例如多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)，糖酵母属(Saccharomyces)的种，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)的种，Yarrowia属的种，例如Yarrowia lipolytica，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)的种和曲霉属(Aspergillus)的种。巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)特别优选被用作宿主细胞。当几个载体(每一个都有一个ppK基因的拷贝)被整合到基因组中时它是特别优选的。
另外，本发明涉及纯化蛋白酶K的方法。为了纯化蛋白酶，在第一步骤中通过微量过滤法或离心去除酵母细胞。得到的澄清溶液含有蛋白酶。接着为了使产物与阳离子交换剂结合而利用超滤再次缓冲，所述阳离子交换剂是例如SP-Sepharose或SP-Sephadex(Pharmacia)或SP-Toyopearl(Tosoh Corporation)。洗脱之后，利用超滤再次缓冲并且与阴离子交换剂结合，所述阴离子交换剂是例如DEAE-Sepharose或Q-Sepharose(Pharmacia)或DEAE-Fraktogel(Merck)。再次洗脱之后，利用超滤将纯蛋白酶转移到稳定的缓冲体系中(蛋白质纯化，原理和实验(Protein Purification，Principlesand Practice)，Robert K.Scopes，Springer Verlag，1982)。然而本领域技术人员能使用现有技术中其他纯化方法。
令人惊奇地，根据本发明的方法使能够制备重组蛋白酶K，其中异源宿主细胞产生可溶和活性形式的酶。表达蛋白酶K，接着将酶分泌到培养基中是特别有利的，这样防止了蛋白酶K对宿主细胞的细胞溶胶产生强毒性作用。此外，这保证正确形成二硫桥，而这在细胞溶胶还原环境下不太容易发生。因此，根据本发明的方法的一个重要的优点是提供了产生可溶和活性形式的重组蛋白酶K。非常令人吃惊而意料不到的是分泌的蛋白酶K不水解根据本发明的表面蛋白。这样的预期的蛋白酶K对表面蛋白的水解会干扰宿主细胞的生命周期。
用根据本发明的方法获得蛋白酶K，它是同源的并因此特别适合分析和诊断应用。根据本发明的蛋白酶K的酶原母体能任选地含有另外的N-末端修饰，特别是有利于目标蛋白质纯化的序列(“亲和性标记”)。另外，酶原母体能包含提高翻译效率，提高折叠效率的序列，和/或导致目标蛋白质分泌到培养基中的序列(天然前序列和其他信号肽)。
就本发明意义来说，蛋白酶K意指SEQ.ID.NO.：1所示的Gassen等人(1989)的序列，以及来自Tritirachium album Limber的蛋白酶K的其他变体，如Ch.Betzel等(生物化学(Biochemistry)40(2001)，3080-3088)公开的氨基酸序列，特别是蛋白酶T(Samal，B.B.等(1989)Gene Vol.85(2)，329-333；Samal，B.B.等(1996)高级实验药物生物学(Adv.Exp.Med.Biol.)Vol.379，95-104)和蛋白酶R(Samal，B.B.等(1990)分子微生物学(Mol.Microbiol.)Vol.4(10)，1789-1792；US5,278,062)，和重组方法产生的另外的变体(例如如WO96/28556中所述)。SEQ.ID.NO.：1包括序列原(1-90；90个氨基酸)和成熟蛋白酶K的序列(91-368；279个氨基酸)。Betzel等(生物化学(Biochemistry)40(2001)，3080-3088)公开的蛋白酶K氨基酸序列特别在活性蛋白酶的207位具有代替丝氨酸残基的特定天冬氨酸。
本发明意义的蛋白酶K原特别指其N-末端与其根据SEQ.ID.NO.：1的序列原连接的蛋白酶K。在与蛋白酶K紧密相关的枯草杆菌蛋白酶E和相应变体情况下，序列原对活性蛋白酶的折叠和形成有重要影响(Ikemura，H.等(1987)生物化学(Biol.Chem.)Vol.262(16)，7859-7864)。特别地假设序列原作为分子内陪伴分子而起作用(Inouye，M.(1991)酶(Enzyme)Vol.45，314-321)。折叠之后，通过前肽自身催化裂解将其加工成成熟枯草杆菌蛋白酶(Ikemura，H.和Inouye，M.(1988)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)Vol.263(26)，12959-12963)。这个过程在分子内发生在枯草杆菌蛋白酶E.(Samal，B.B.等(1989)Gene Vol.85(2)，329-333；Volkov，A.和Jordan，F.(1996)J.Mol.Biol.Vol.262，595-599)，枯草杆菌蛋白酶BPN′(Eder，J.等(1993)生物化学(Biochemistry)Vol.32，18-26)，木瓜蛋白酶(Vernet，T.等(1991)J.Biol.Chem.Vol.266(32)，21451-21457)和嗜热芽孢菌蛋白酶(Marie-Claire，C.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273(10)，5697-5701)的情况下。
只有通常是疏水性的序列原的一定的核心区显示对于作为陪伴分子的功能是必需的，因为很多区域的突变对活性没有影响(Kobayashi，T.和Inouye，M.(1992)J.Mol.Biol.Vol.226，931-933)。另外，已知前肽可以在各种枯草杆菌蛋白酶变体之间互换。因此例如枯草杆菌蛋白酶BPN′也识别枯草杆菌蛋白酶E的序列原(Hu，Z.等(1996)J.Biol.Chem.Vol.271(7)，3375-3384)。
因此本发明涉及长度是90个氨基酸的根据SEQ.ID.NO.：1的序列原，和促进折叠功能的其他变体。还涉及为成熟蛋白酶K折叠而外源加入的并促进上述功能的前肽。
因此，根据本发明的方法的重要的优点是表达宿主将重组蛋白酶K以可溶和活性形式分泌到培养基中。此外，非常有活性和非特异蛋白酶不损害或其以其它方式负面影响在根据本发明的方法中使用的表达宿主，即特别地，其连续生长没有问题，并且没有发现增加的细胞溶胞作用。此外，与Tritirachium album相比，根据本发明的表达宿主更容易操作，并且特征在于更高的生长速度。
【附图说明】
图1是表达质粒pPICPK-1。克隆到起始载体pPICZαA(Invitrogen)中的对于蛋白酶K的酶原前体编码的序列。
图2是表达质粒pPICPK-2。克隆到起始载体pPIC9K(Invitrogen)中的对于蛋白酶K的酶原前体编码的序列。
实施例
实施例1
基因合成
利用基因合成的方法制备用于没有信号序列和没有内含子的来自Tritirachium album Limber的成熟蛋白酶K的基因。Gunkel和Gassen，1989的368个氨基酸长度的序列(没有天然信号肽)被用作模板。通过再次翻译氨基酸序列获得用于在大肠杆菌和酵母中表达的密码子优化核酸序列。SEQ.ID.NO.：1给出氨基酸序列，SEQ.ID.NO.：2给出核苷酸序列。
关于基因合成，将基因分为有义和反义，交替序列中互补配对寡核苷酸的18个片段(SEQ.ID.NO.：3-20)。分别至少15bp区连接5′-端和连接3′-端，在各种情况下相邻的寡核苷酸重叠。限制性内切核酸酶的识别位点与用来接着克隆到表达载体中的编码区外部的合成基因的5′-和3′-端连接。包含EcoRI切割位点的SEQ.ID.NO.：3中所示寡核苷酸被用作克隆蛋白酶K原基因的5′引物。SEQ.ID.NO.：20是包含HindIII切割位点的3′-引物。3′引物在天然终止密码子之后包含另外的终止密码子，以保证翻译的安全终止。
利用PCR反应将寡核苷酸彼此连接并且扩增得到的基因。为此，首先将基因分为各自6个寡核苷酸的三个片段，在第二轮PCR循环中将这三个片段彼此连接。
片段1由如SEQ.ID.NO.：3-8中所示的寡核苷酸组成，片段2由如SEQ.ID.NO.：9-14中所示的寡核苷酸组成，片段3由如SEQ.ID.NO.：15-20中所示的寡核苷酸组成。
使用下面的PCR参数：
PCR反应1(三个片段的产生)
5分钟 95℃ 热起始
PCR反应2(连接片段形成全长基因)
加入末端引物
实施例2
克隆由基因合成得到的合成的蛋白酶K片段
对琼脂糖凝胶施用PCR混合物，并且从琼脂糖凝胶(Bio 101，Inc.CA USA的Geneclean II试剂盒)分离大约1130bp PCR片段。用EcoRI和HindIII限制性内切核酸酶(Roche Diagnostics GmbH，德国)在37℃下将片段切割1小时。同时用EcoRI和HindIII限制性内切核酸酶在37℃下将pUC18质粒切割1小时，通过琼脂糖凝胶电泳分离混合物，并且分离2635bp载体片段。接着使用T4-DNA连接酶将PCR片段和载体片段相互连接在一起。对于1微升(20ng)载体片段和3微升(100ng)PCR片段，用移液管加入1微升10x连接酶缓冲液(Maniatis等，1989 B.27)，1微升T4 DNA连接酶，4微升无菌H2O，小心混合并且在16℃下温育过夜。
通过限制性(内切核酸酶酶切)分析并且通过两条链的多次测序来检查克隆的基因。
实施例3
载体构建
首先从pUC质粒再次分离合成基因。为此目的，1微克质粒DNA首先根据生产商说明与限制性内切核酸酶HindIll(RocheDiagnostics GmbH)温育，接着通过加热至65℃维持20分钟将限制性内切核酸酶灭活。然后用Klenow聚合酶根据生产商说明(RocheDiagnostics GmbH) 补平得到的DNA突出端，并且通过在75℃温育10分钟将Klenow聚合酶灭活。最后用限制性内切核酸酶EcoRI(RocheDiagnostics GmbH)根据生产商说明切割现在线性化的上述pUC质粒的载体片段，将反应混合物施加给1％琼脂糖凝胶，并且通过施加电流(100V/150mA)根据大小相互分离片段。从琼脂糖凝胶(QIAquick GelExtraction Kit/Qiagen)分离包含对于蛋白酶K原的基因(ppk基因)的大约1120bp片段。
用限制性内切核酸酶Asp718I(Roche Diagnostics GmbH)根据生产商说明切割pPICZαA载体(Invitrogen)，并且通过将温育混合物加热至65℃维持20分钟将限制性内切核酸酶灭活。然后用Klenow聚合酶根据生产商说明(Roche Diagnostics GmbH)补平得到的DNA突出端，并且然后通过在75℃温育10分钟将Klenow聚合酶灭活。最后用限制性内切核酸酶EcoRI(Roche Diagnostics GmbH)根据生产商说明切割现在线性化的pPICZαA的载体片段，将反应混合物施加给1％琼脂糖凝胶，并且通过施加电流(100V/150mA)根据大小分离片段。从琼脂糖凝胶(QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen)分离大约3550bp载体片段。
通过标准方法(Sambrook等，1989)将用这种方法获得的片段彼此连接在一起。在该载体中，ppk基因受AOX1启动子(甲醇可诱导的来自巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的醇氧化酶1的启动子)的控制，并且利用这种克隆策略在来自啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的α-因子的信号肽后面的正确的读框(leserahmen)中克隆。然后用限制性(内切核酸酶酶切)分析和测序对用这种方法插入的基因片段检查没有错误的基础序列。得到的包含编码蛋白酶K原的ppk基因的表达载体命名为pPICPK-1(参见图1)。
随后也将ppk基因克隆到pPIC9K(Invitrogen)中。为此目的，使用限制性内切核酸酶PmeI和NotI(Roche Diagnostics GmbH)根据生产商说明切割载体pPICPK-1。在1％琼脂糖凝胶中根据大小从限制性(酶切)混合物中分离片段，从凝胶上分离含有AOX1-启动子区的3′-部分的大约1960bp片段，α-因子信号肽序列和ppk基因(QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen)。同时使用限制性内切核酸酶PmeI和NotI(Roche Diagnostics GmbH)根据生产商说明切割载体pPIC9K，在1％琼脂糖凝胶中根据大小从限制性酶切混合物中分离片段，从凝胶上分离大约8450bp载体片段(QIAquick Gel ExtractionKit/Qiagen)。
接着通过标准方法(Sambrook等，1989)将用这种方法获得的片段彼此连接在一起。在该载体中，ppk基因也受AOX1启动子(甲醇可诱导的来自巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的醇氧化酶1的启动子)的控制。通过筛选标记物并且通过本领域公知的在转化之前基于载体线性化将其整合到毕赤氏酵母基因组中的三种可能性来区别载体pPIC9K与载体pPICZαA，而pPICZαA整合到AOX1位点的整合作用是固定的。然后用限制性(内切核酸酶酶切)分析和测序对插入的基因片段检查没有错误的基础序列。
得到的包含编码蛋白酶K原的ppk基因的表达载体命名为pPICPK-2(参见图2)。
实施例4
在巴斯德毕赤氏酵母中转化pPICPK-1
为了在巴斯德毕赤氏酵母X-33中转化pPICPK-1并且接着整合到基因组中，首先用PmeI(Roche Diagnostics GmbH)将载体线性化。利用电穿孔使用Gene Pulser II(Biorad)进行转化作用。
为此目的，用巴斯德毕赤氏酵母野生型菌株的菌落接种5毫升YPD培养基，并且振荡下在30℃下温育过夜。接着在200毫升新鲜YPD培养基(根据Invitrogen目录)中以1∶2000比例再接种过夜培养物，并且振荡下在30℃下温育过夜，直到OD600达到1.3-1.5。将细胞离心(1500xg/5分钟)并且将沉积物(pellet)重新悬浮于200ml冰冷无菌水(0℃)中。再次离心细胞(1500xg/5分钟)并且再次悬浮于100ml冰冷无菌水(0℃)中。再次离心细胞并且再次悬浮于10毫升冰冷(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。再次离心细胞并且再次悬浮于0.5毫升冰冷(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。用这种方法得到的细胞保存在冰上并且立即用于转化。
向80微升的细胞加大约1微克线性化pPICPK-1载体DNA，并且将全部混合物转移到冰冷(0℃)的电穿孔小池(küvette)中并且在冰上又温育5分钟。接着将小池转移给Gene Pulser II(Biorad)，在1kV，1kΩ和25μF下进行转化作用。电穿孔之后，向混合物加入1毫升1M山梨糖醇(ICN)，并且接着在含有100微克/毫升Zeocin(Invitrogen)的YPDS琼脂板(根据Invitrogen目录)上平板培养100-150微升。平板接着在30℃下温育2-4天。
用克隆接种最小葡萄糖格板并且进一步分析克隆。
取生长的克隆，重新悬浮于20微升无菌水中并且用17.5U溶细胞酶(Roche Diagnostics GmbH)溶解(1小时，37℃)并且通过PCR方法直接检查ppk表达盒的正确整合作用。
然后在表达实验中使用转化到基因组的过程中整合了完整表达盒的克隆。
实施例5
在巴斯德毕赤氏酵母中转化pPICPK-2
为了在巴斯德毕赤氏酵母GS115中转化pICPK-2并且接着整合到基因组中，首先针对变体I用PmeI(Roche Diagnostics GmbH)将载体线性化，将它整合到AOXI-位置，并且针对变体II用SaII(RocheDiagnostics GmbH)线性化，将它整合到His4位置。利用电穿孔使用Gene Pulser II(Biorad)进行转化作用。
为此目的，用巴斯德毕赤氏酵母GS115野生型菌株的菌落接种5毫升YPD培养基(根据Invitrogen目录)，并且振荡下在30℃下温育过夜。接着在200毫升新鲜YPD培养基(根据Invitrogen目录)中以1∶2000比例再接种过夜培养物，并且振荡下在30℃下温育过夜，直到OD600达到1.3-1.5。将细胞离心(1500xg/5分钟)并且将沉积物重新悬浮于200ml冰冷无菌水(0℃)中。再次离心细胞(1500xg/5分钟)并且再次悬浮于100ml冰冷无菌水(0℃)中。再次离心细胞并且再次悬浮于10毫升冰冷(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。再次离心细胞并且再次悬浮于0.5毫升冰冷(0℃)1M山梨糖醇(ICN)中。用这种方法得到的细胞保存在冰上并且立即用于转化。
向80微升的细胞加大约1微克线性化pPICPK-2载体DNA，并且将全部混合物转移到冰冷(0℃)的电穿孔小池并且在冰上又温育5分钟。接着将小池转移给Gene Pulser II(Biorad)中，在1kV，1kΩ和25μF下进行转化作用。电穿孔之后，向混合物加入1毫升1M山梨糖醇(ICN)，并且接着在没有组氨酸的MM琼脂板(根据Invitrogen目录的最小培养基)上平板培养100-150微升。平板接着在30℃下温育2-4天。当它们已整合带有具有功能His4基因作为插入物的载体pPICPK-2时，具有突变(组氨醇脱氢酶)引起的缺损His4基因的巴斯德毕赤氏酵母GS115克隆只能在这些板上生长，而且因此能补偿(aufhebt)组氨酸合成中的缺陷。
用克隆接种最小葡萄糖格板并且进一步分析克隆。取生长的克隆，重新悬浮于20微升无菌水中并且用17.5U溶细胞酶(RocheDiagnostics GmbH)溶解(1小时，37℃)，并且通过PCR方法直接检查ppk表达盒的正确整合作用。
然后在表达实验中使用转化到基因组的过程中整合了完整表达盒的克隆。
实施例6
蛋白酶K的表达
用阳性克隆接种10毫升BMGY培养基(根据Invitrogen目录)，并且振荡下在30℃下温育过夜。接着测定600nm下的光密度(OD)，并且用这样一种方式接种10毫升BMMY培养基(根据Invitrogen目录)，使OD600达到1。BMMY培养基(根据Invitrogen目录)含有甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)，它通过AOX1启动子诱导蛋白酶K的表达。
振荡下在30℃下温育振荡瓶，每24小时取样，测定OD600，对蛋白酶K的表达进行活性测定，并且每一次再次添加0.5％甲醇(Mallinckrodt Baker B.V.)用于进一步诱导。表达实验进行168小时。
实施例7
分泌的重组蛋白酶K的活性测定
对于重组蛋白酶K的活性测定，需要CaCl2x2H2O(Merck ID-No.102382)，DMSO(Merck ID-No.109678)，底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Roche Diagnostics ID-No.0716766)和Tris-Base(RocheDiagnostics ID-No.0153265)。
溶液组成如下：
溶液1：50毫摩尔/升Tris-Base；10mmol/L CaCl2 pH8.2
溶液2：溶解于1毫升DMSO中的125毫克Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
将细胞离心(10000rpm，5分钟，Eppendorf-Tisch离心机)，并且在溶液1中以1∶500稀释上清液。
用移液管将2毫升溶液1吸移到小池中并且加入0.02毫升的溶液2。混合两种溶液，并且在25℃的反应温度下温育。通过加入0.05毫升如上所述的稀释的上清液并且反复混合开始反应，测定405nm下的吸收变化并且测定线性区域中ΔA/分钟。然后用下式计算：
2.07＝样品体积
ε405＝10.4[mmol-1x1xcm-1]
1＝小池路径长度
0.05＝加入的样品的体积
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
<120>来自酵母中Tritirachium album的重组蛋白酶K的表达
<130>5441/00/DE
<140>
<141>
<160>21
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>369
<212>PRT
<213>Tritirachium album Limber
<400>1
Ala Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys
35 40 45
Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu
50 55 60
Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala
85 90 95
Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile
115 120 125
Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln
130 135 140
Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly
145 150 155 160
Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys
165 170 175
Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly
180 185 190
Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys
195 200 205
Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly
210 215 220
Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser
225 230 235 240
Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala
245 250 255
Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala
260 265 270
Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val
275 280 285
Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly
290 295 300
Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val
305 310 315 320
Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala
325 330 335
Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser
340 345 350
Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln
355 360 365
Ala
<210>2
<211>1124
<212>DNA
<213>Tritirachium album Limber
<400>2
gaattcgctc ctgccgttga gcagcgctcc gaggctgctc ctctgatcga ggcccgcggc 60
gagatggttg ccaacaagta catcgtcaag ttcaaggagg gtagcgctct ttccgctctg 120
gatgctgcca tggagaagat ctctggcaag cccgaccacg tctacaagaa cgtcttcagc 180
ggtttcgctg cgaccctgga cgagaacatg gttcgggttc tccgcgccca ccccgatgtt 240
gagtacatcg agcaggatgc tgttgtcacc atcaacgctg cgcagaccaa cgctccctgg 300
ggcctggctc gcatctccag caccagcccc ggtacctcta cctactacta tgacgaatct 360
gccggccaag gctcctgcgt ctacgtgatc gacaccggta tcgaggcatc gcaccccgag 420
ttcgagggtc gtgcccagat ggtcaagacc tactactact ccagtcgcga cggtaacggt 480
cacggcaccc actgcgctgg taccgttggc tcccgtacct acggtgtcgc caagaagacc 540
cagctgttcg gtgtcaaggt cctggatgac aacggcagtg gccagtactc caccatcatc 600
gccggtatgg acttcgttgc cagcgacaag aacaaccgca actgccccaa aggtgtcgtt 660
gcctccttat ccctgggcgg tggttactcc tcctccgtga acagcgccgc tgcccgcctc 720
cagagctctg gtgtcatggt cgccgtcgct gccggtaaca acaacgctga cgcccgcaac 780
tactcccctg cttctgagcc ctcggtctgc accgtcggtg cttctgaccg ctacgaccgc 840
cgctccagct tctccaacta cggcagcgtt ttggacatct tcggccctgg taccagcatc 900
ctctccacct ggatcggcgg cagcacccgc tccatctctg gtacctccat ggctactccc 960
cacgttgccg gtctcgctgc ctacctcatg actcttggaa agactaccgc cgccagcgct 1020
tgccgataca ttgccgacac cgccaacaag ggcgacttaa gcaacattcc cttcggcact 1080
gtcaacttgc ttgcctacaa caactaccag gcttaatgaa gctt 1124
<210>3
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>3
cgcgaattcg ctcctgccgt tgagcagcgc tccgaggctg ctcctctgat cgaggcccgc 60
ggcgagatgg ttgccaaca 79
<210>4
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>4
atcttctcca tggcagcatc cagagcggaa agagcgctac cctccttgaa cttgacgatg 60
tacttgttgg caaccatctc 80
<210>5
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>5
tgccatggag aagatctctg gcaagcccga ccacgtctac aagaacgtct tcagcggttt 60
cgctgcgacc ctggacgaga 80
<210>6
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>6
tgctcgatgt actcaacatc ggggtgggcg cggagaaccc gaaccatgtt ctcgtccagg 60
gtcg 64
<210>7
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>7
tgagtacatc gagcaggatg ctgttgtcac catcaacgct gcgcagaccg ctgcgcagac 60
caacg 65
<210>8
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>8
agtaggtaga ggtaccgggg ctggtgctgg agatgcgagc caggccccag ggagcgttgg 60
tctgcgcagc 70
<210>9
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>9
gtacctctac ctactactat gacgaatctg ccggccaagg ctcctgcgtc tacgtgatcg 60
acaccggtat cgaggcatcg 80
<210>10
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>10
ttaccgtcgc gactggagta gtagtaggtc ttgaccatct gggcacgacc ctcgaactcg 60
gggtgcgatg cctcgatacc g 81
<210>11
<211>78
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>11
ccagtcgcga cggtaacggt cacggcaccc actgcgctgg taccgttggc tcccgtacct 60
acggtgtcgc caagaaga 78
<210>12
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>12
atggtggagt actggccact gccgttgtca tccaggacct tgacaccgaa cagctgggtc 60
ttcttggcga cac 73
<210>13
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>13
ggccagtact ccaccatcat cgccggtatg gacttcgttg ccagcgacaa gaacaaccgc 60
aactgcccca aaggtgtcgt t 81
<210>14
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>14
gctctggagg cgggcagcgg cgctgttcac ggaggaggag taaccaccgc ccagggataa 60
ggaggcaacg acacctttgg g 81
<210>15
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>15
gcccgcctcc agagctctgg tgtcatggtc gccgtcgctg ccggtaacaa caacgctgac 60
gcccgcaact actcccctgc tt 82
<210>16
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>16
gttggagaag ctggagcggc ggtcgtagcg gtcagaagca ccgacggtgc agaccgaggg 60
ctcagaagca ggggagtagt 80
<210>17
<211>83
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>17
ctccagcttc tccaactacg gcagcgtttt ggacatcttc ggccctggta ccagcatcct 60
ctccacctgg atcggcggca gca 83
<210>18
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>
tcatgaggta ggcagcgaga ccggcaacgt ggggagtagc catggaggta ccagagatgg 60
agcgggtgct gccgccgatc c 81
<210>19
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>19
ctgcctacct catgacctta ggaaagacca ccgccgccag cgcttgccgt tacatcgccg 60
acaccgccaa caagggcgac t 81
<210>20
<211>87
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>20
atataagctt ctattaagcc tggtagttgt tgtaggctaa caggttgacg gtgccgaagg 60
gaatgttgct taagtcgccc ttgttgg 87
<210>21
<211>384
<212>PRT
<213>Tritirachium album Limber
<400>21
Met Arg Leu Ser Val Leu Leu Ser Leu Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg
20 25 30
Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly Ser
35 40 45
Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys Pro
50 55 60
Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu Asp
65 70 75 80
Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr Ile
85 90 95
Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro
100 105 110
Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr
115 120 125
Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp
130 135 140
Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met
145 150 155 160
Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
165 170 175
His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys
180 185 190
Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln
195 200 205
Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys Asn
210 215 220
Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly
225 230 235 240
Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser
245 250 255
Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg
260 265 270
Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Ser
275 280 285
Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu
290 295 300
Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly
305 310 315 320
Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala
325 330 335
Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser
340 345 350
Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn
355 360 365
Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala
370 375 380