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1、10申请公布号CN104212861A43申请公布日20141217CN104212861A21申请号201310207965322申请日20130529C12P21/06200601C07K5/113200601C07K1/36200601C07K1/34200601C07K1/20200601C07K1/18200601A61K38/07200601A61P35/0020060171申请人浙江海洋学院地址316000浙江省舟山市定海区文化路105号72发明人杨最素徐律丁国芳孙瑜黄芳芳郁迪李连军74专利代理机构宁波诚源专利事务所有限公司33102代理人袁忠卫54发明名称一种菲律宾蛤仔寡肽的制。
2、备方法及其在抗前列腺癌中的应用57摘要本发明涉及一种菲律宾蛤仔寡肽，其氨基酸序列为ASPTRPPROHIS，公开了该种寡肽的制备方法，即利用胰蛋白酶酶解获得目标寡肽酶解液，再经超滤、阴离子交换、及反相高效液相色谱进一步分离纯化获得目标寡肽；同时还公开了该种寡肽在抗前列腺癌中的应用，具体的，可有效抑制体外培养前列腺癌PC3、DU145细胞生长，诱导凋亡，改变细胞周期。与现有技术相比，本发明制备菲律宾蛤仔寡肽的方法，工艺过程简单，杂质少，效率高，同时在现有技术的基础上，揭示了该种寡肽在抗前列腺癌上的效用。51INTCL权利要求书1页说明书9页序列表1页附图13页19中华人民共和国国家知识产权局12。
3、发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表1页附图13页10申请公布号CN104212861ACN104212861A1/1页21一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤将菲律宾蛤仔洗净，取肉后加超纯水搅拌，然后去杂质匀浆，制得匀浆样品；取适量的所述匀浆样品，加入适量体积的超纯水，此时原料与超纯水的比值为1114，加入蛋白酶在水浴箱中进行酶解反应，其中加酶量为300UG1500UG,酶解反应的PH值为89，酶解时间为4H12H，酶解温度为4060；酶解反应结束后灭活、离心、取上清液备用；将所述上清液加入超滤膜中进行超滤，收集分子量小于3KDA的酶解物质进行冷冻干燥备用；利用DEAE。
4、SEPHAROSEFF阴离子交换，采用磷酸缓冲液和NACL溶液对所得酶解液进行阶段洗脱，在280NM波长处收集最高肽峰冷冻干燥后贮存备用；将DEAESEPHAROSEFF阴离子交换收集的最高肽峰利用反相高效液相色谱法进行进一步纯化，在220NM波长处出现唯一峰，收集该峰，冷冻干燥制得所述菲律宾蛤仔寡肽。2根据权利要求1所述的菲律宾蛤仔寡肽的制备方法，其特征在于所述步骤中原料与超纯水的比值为12。3根据权利要求1所述的菲律宾蛤仔寡肽的制备方法，其特征在于所述步骤中所述蛋白酶为胰蛋白酶，所述加酶量为1200UG，酶解PH值为80，酶解时间为8H，酶解温度为50。4根据权利要求1所述的菲律宾蛤仔寡肽。
5、的制备方法，其特征在于所述步骤中为沸水浴中灭活15MIN，4下10000R/MIN离心15MIN。5根据权利要求1所述的菲律宾蛤仔寡肽的制备方法，其特征在于所述步骤中NACL溶液的浓度为01MOL/L、03MOL/L、05MOL/L三种。6根据权利要求1所述的菲律宾蛤仔寡肽的制备方法，其特征在于所述步骤中色谱柱为C18反相柱，填料为ODS，流动相为乙腈与水，且乙腈与水的比例为1585，流速为08MLMIN1，上样体积为20UL，检测波长为220NM，洗脱条件为15乙腈，20MIN。7一种由权利要求17任一权利要求所述的菲律宾蛤仔寡肽的制备方法所得的菲律宾蛤仔寡肽，其特征在于所述菲律宾蛤仔寡肽的。
6、氨基酸序列为ASPTRPPROHIS。8一种如权利要求7所述菲律宾蛤仔寡肽的应用，其特征在于所述菲律宾蛤仔寡肽在抗前列腺癌中的应用。权利要求书CN104212861A1/9页3一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法及其在抗前列腺癌中的应用技术领域0001本发明涉及一种菲律宾蛤仔寡肽，尤其涉及这种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法及其在抗前列腺癌领域中的应用。背景技术0002菲律宾蛤仔（RUDITAPESPHILIPPINARUM）属软体动物门双壳纲帘蛤目帘蛤科，一种广温性的小型双壳贝类，南方俗称花蛤，与牡蛎、缢蛏、蚶类并列为我国四大养殖贝类，是近岸滩涂和浅海的主要贝类之一，其味道鲜美，营养丰富，蛋白含量高。000。
7、3研究表明，菲律宾蛤仔提取物具有很多生理功效，如抗肿瘤、抗氧化、抑菌和增强免疫力等，近年来对菲律宾蛤仔提取物的抗肿瘤研究有很大进展，如范秀萍等（食品工业科技，2003）利用菲律宾蛤仔糖胺聚糖的粗制品（CRG）作用于体外培养的HL60细胞，发现CRG在10MG/ML浓度下对HL60细胞具有显著抑制作用，在24H、48H、72H抑瘤率分别可达598、677和962。张莉等（海洋与湖沼，2007）利用菲律宾蛤仔肉提取两种蛋白聚糖PG1和PG2，其中PG1在200UG/ML浓度时对人肝癌细胞SMMC7721的生长抑制率达到7330，且不影响人正常肝细胞HL7002的生长与功能。前列腺癌是男性最常见的恶。
8、性肿瘤之一，在欧美国家由前列腺癌导致的死亡人数占恶性肿瘤引起死亡人数的第二位，仅次于肺癌。近年来随着人民平均寿命的延长和诊断技术的提高，我国前列腺癌的发病率呈显著增长的趋势，已经严重影响着我国50岁以上男性的生活质量和寿命，成为泌尿外科领域一个越来越重要的研究课题，但关于菲律宾蛤仔活性提取物对前列腺癌癌细胞抑制作用的报道较少，且关于菲律宾蛤仔活性肽的抗前列腺癌上的应用的更少。0004目前，生物活性肽的制备主要有三种方式一是从自然界的生物体中提取其本身固有的各种天然活性肽类物质；二是通过蛋白质降解的途径获得具有各种生理功能的生物活性物质；三是利用生物合成的方法来制备生物活性肽。其中，第一种方式中。
9、自然界生物体重活性肽类物质的含量较低，提取过程中产率较低，且需要较多的原料个体，使得成本较高；第三种方式中生物合成的过程复杂难控，中间产物较多，不适合大规模产生；综合而言，由于蛋白酶的酶解特异性和高效性，使得酶解法制取生物活性肽的方法安全性高，产率高。发明内容0005本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种利用蛋白酶酶解法制备菲律宾蛤仔寡肽的方法。0006本发明所要解决的另一个技术问题是提供该种菲律宾蛤仔寡肽在抗前列腺癌中的应用。0007本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种菲律宾蛤仔寡肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤说明书CN104212861A2/9页40008将菲律宾蛤。
10、仔洗净，取肉后加超纯水搅拌，然后去杂质匀浆，制得匀浆样品；0009取适量的所述匀浆样品，加入适量体积的超纯水，此时原料与超纯水的比值为1114，加入蛋白酶在水浴箱中进行酶解反应，其中加酶量为300UG1500UG,酶解反应的PH值为89，酶解时间为4H12H，酶解温度为4060；0010酶解反应结束后灭活、离心、取上清液备用；0011将所述上清液加入超滤膜中进行超滤，收集分子量小于3KDA的酶解物质进行冷冻干燥备用；0012利用DEAESEPHAROSEFF阴离子交换，采用磷酸缓冲液和NACL溶液对所得酶解液进行阶段洗脱，在280NM波长处收集最高肽峰冷冻干燥后贮存备用；0013将DEAESE。
11、PHAROSEFF阴离子交换收集的最高肽峰利用反相高效液相色谱法进行进一步纯化，在220NM波长处出现唯一峰，收集该峰，冷冻干燥制得所述菲律宾蛤仔寡肽。0014作为优选，所述原料与超纯水的比值为12，这样可使原料在水溶液中充分分离，在不过分稀释蛋白酶浓度的前提下，增加了蛋白酶与酶解对象的接触面积，提高了酶解效率，同时也可保证原料的生物活性。0015所述蛋白酶可有多种选择，作为优选，所述蛋白酶为胰蛋白酶，且蛋白酶的最佳酶解条件组合为加酶量为1200UG，酶解PH值为80，酶解时间为8H，酶解温度为50。0016作为优选，所述步骤中为沸水浴中灭活15MIN，4下10000R/MIN离心15MIN，。
12、沸水浴即100可使蛋白酶充分灭活，且4下高速离心可保证酶解液中相关物质的生物活性。0017所述步骤中NACL溶液的浓度为01MOL/L、03MOL/L、05MOL/L三种，可对酶解液分阶段进行充分洗脱。0018所述高效液相色谱法的色谱条件为色谱柱为C18反相柱，填料为ODS，流动相为乙腈与水（1585），流速为08MLMIN1，上样体积为20UL，检测波长为220NM，洗脱条件为15乙腈，20MIN。0019由上述方法所得的菲律宾蛤仔寡肽的氨基酸序列为ASPTRPPROHIS，该种菲律宾蛤仔寡肽在抗前列腺癌中的应用，尤其能抑制体外培养前列腺癌PC3、DU145细胞的生长，作用24H后，PC3、。
13、DU145细胞的早、晚期凋亡细胞便开始增多，且随着药液浓度的增加，凋亡细胞逐渐增多。0020与现有技术相比，本发明的优点在于利用胰蛋白酶酶解获得目标寡肽酶解液，再经超滤、阴离子交换、及反相高效液相色谱进一步分离纯化获得目标寡肽，工艺过程简单效率高，且获得的目标寡肽具有抗前列腺癌活性，可有效抑制体外培养前列腺癌PC3、DU145细胞生长，诱导凋亡，改变细胞周期。附图说明0021图1为实施例1中温度对胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影响关系示意图；0022图2为实施例1中时间对胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影响关系示意图；0023图3为实施例1中PH对胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影响关。
14、系示意图；0024图4为实施例1中加酶量对胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影响关系示意说明书CN104212861A3/9页5图；0025图5为实施例2中DEAESEPHAROSEFF洗脱峰示意图；0026图6为图5中峰I1经RPHPLC色谱柱洗脱纯化结果示意图；0027图7为目标寡肽氨基酸分子结构示意图；0028图8为实施例3中PRO对PC3细胞的增殖抑制作用柱状图；0029图9为实施例3中DU145对PC3细胞的增殖抑制作用柱状图；0030图10为实施例3中对照组PC3细胞AO/EB染色结果示意图；0031图11为实施例3中PC3细胞经10MG/MLPRO作用24H后AO/EB染色结果示。
15、意图；0032图12为实施例3中PC3细胞经20MG/MLPRO作用24H后AO/EB染色结果示意图；0033图13为实施例3中PC3细胞经30MG/MLPRO作用24H后AO/EB染色结果示意图；0034图14为实施例3中对照组DU145细胞AO/EB染色结果示意图；0035图15为实施例3中DU145细胞经10MG/MLPRO作用24H后AO/EB染色结果示意图；0036图16为实施例3中DU145细胞经20MG/MLPRO作用24H后AO/EB染色结果示意图；0037图17为实施例3中DU145细胞经30MG/MLPRO作用24H后AO/EB染色结果示意图；0038图18为实施例3中对照。
16、组中PC3细胞凋亡率示意图；0039图19为实施例3中10MG/MLPRO组中PC3细胞凋亡率示意图；0040图20为实施例3中20MG/MLPRO组中PC3细胞凋亡率示意图；0041图21为实施例3中30MG/MLPRO组中PC3细胞凋亡率示意图；0042图22为实施例3中对照组中DU145PRO细胞凋亡率示意图；0043图23为实施例3中10MG/MLPRO组中DU145PRO细胞凋亡率示意图；0044图24为实施例3中20MG/MLPRO组中DU145PRO细胞凋亡率示意图；0045图25为实施例3中30MG/MLPRO组中DU145PRO细胞凋亡率示意图；0046图26为实施例3中RP。
17、O对PC3细胞周期影响示意图；0047图27为实施例3中RPO对DU145细胞周期影响示意图；0048图28为实施例3中对照组PC3细胞SUBG1峰细胞凋亡示意图；0049图29为实施例3中10MG/MLPRO组PC3SUBG1峰细胞凋亡示意图；0050图30为实施例3中30MG/MLPRO组PC3SUBG1峰细胞凋亡示意图；0051图31为实施例3中对照组DU145细胞SUBG1峰细胞凋亡示意图；0052图32为实施例3中10MG/MLPRO组DU145细胞SUBG1峰细胞凋亡示意图；0053图33为实施例3中30MG/MLPRO组DU145细胞SUBG1峰细胞凋亡示意图。具体实施方式005。
18、4以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。说明书CN104212861A4/9页60055实施例1酶解条件的优化0056蛋白酶的筛选将新鲜菲律宾蛤仔洗净后去壳取肉，然后将蛤仔肉放入匀浆机中，倒入适量的超纯水匀浆。称取适量匀浆样品，加入2倍重量的超纯水，选用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶作供选酶，采用福临酚法测定酶活力（参见杨永芳贻贝酶解多肽制备工艺及抗前列腺癌活性研究D舟山浙江海洋学院,2011），按照表1所示蛋白酶各自的最适作用温度和PH值，加入1000U/G的蛋白酶，酶解反应6H，反应完成后于沸水浴灭活15MIN，冷却后于4，10000R/MIN预冷的离心机离心15MIN。
19、，取上清液备用。0057样品酶解液制备完成后，通过酶解液中游离ANN氨基氮含量和酶解液腥味值作为酶的筛选指标，ANN含量越高、腥味值越低蛋白酶效果越佳。其中采用甲醛电位滴定法来测定（参见杨永芳贻贝酶解多肽制备工艺及抗前列腺癌活性研究D舟山浙江海洋学院,2011）酶解液中ANN含量，具体方法如下在60ML的蒸馏水中加入5ML水解液，检测PH值。先用01MOL/L的NAOH溶液滴定PH82，加入已中和的甲醛溶液20ML，记录滴定至PH92时所消耗的005MOL/LNAOH溶液的体积，计算其含氮量。0058X（V1V2）C0014100/5V0059其中X为样品中ANN的含量（G/100ML）；V1。
20、为加入甲醛稀释后消耗的NAOH标准液（ML）；V2为空白试验加入甲醛后消耗的NAOH标准液体积（ML）；V为样品液取用量（ML）；C为NAOH标准液的浓度（MOL/L）；0014为氮的毫摩尔质量（G/MMOL）。酶解液的腥味评价及感官评定由10名食品专业的老师和学生组成感官评定小组，对菲律宾蛤仔酶解液的腥味和其他感官特征如颜色、混浊度等进行综合评定。腥味评价以蒸馏水作为参照（无腥味分值为0分），按照腥味很轻、腥味轻、腥味一般、腥味较重和腥味很重5个级别来进行评分，满分为10分，分数越大，则表明腥味越重，当菲律宾蛤仔酶解液的腥味值在4分及以下时认为其可接受。0060四种蛋白酶酶解菲律宾蛤仔肉后酶。
21、解液中的ANN含量和感官腥气味评价结果见表2，从表2可见胰蛋白酶酶解效果最佳，经过6H酶解后酶解液中ANN含量最高，且腥味较轻，在可以接受的范围之内，而且感官颜色也最好；其次是碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果最差且腥味较重，感官颜色也最差，因此，综合考虑本实施例1中选择胰蛋白酶作为水解蛋白酶。0061酶解条件的确定采用单因素实验筛选出胰蛋白酶的最佳作用条件（温度、时间、PH、加酶量），分四组实验进行。0062实验一温度单因素分别称取适量相同量（10G）的菲律宾蛤仔5份，调节PH至80，加入1000U/G的胰蛋白酶，在不同温度下（40，45，50，55，60）酶解6H；0063实验二。
22、时间单因素分别称取适量相同量（10G）的菲律宾蛤仔5份，调节PH至80，加入1000U/G的胰蛋白酶，在50下恒温酶解不同时间（4H，6H，8H，10H，12H）；0064实验三PH值单因素分别称取适量相同量（10G）的菲律宾蛤仔5份，不同PH值（7，75，8，85，9），加入1000U/G的胰蛋白酶，在50下恒温酶解6H；0065实验四加酶量单因素分别称取适量相同量（10G）的菲律宾蛤仔5份，调节PH至80，加入不同量（300U/G，600U/G，900U/G，1200U/G，1500U/G）的胰蛋白酶，在50下恒温酶解6H。0066在初步确定酶解条件的基础上，选择酶解时间、温度、PH值、加。
23、酶量四个因素设立说明书CN104212861A5/9页7三个水平设计正交实验L9（34）正交表，确定胰蛋白酶酶解解菲律宾蛤仔制备寡肽的最佳酶解条件。0067实验结果如图14所示，从图1中可以看出游离ANN含量随着温度的升高先是增加然后达到一个最大值后接着开始下降，在温度为4050时不断地增加，到达50时达到最大值，接着随着温度升高开始下降，这也正好符合酶促反应中温度对酶活力的变化规律；酶解液的腥味随着温度的升高不断下降。因此，综上考虑，本实施例最初选择50作为参考。0068从图2中可以得知，酶解液中的ANN含量随着时间的增加不断增加，开始增速比较缓慢，810H之间增速突然增大，急剧增加，随后1。
24、012H之间增速又变得很缓慢。腥味值同样随着时间的增加变小，到达10H后随着时间的推移开始维持不变。因此，本实施例最初选取10H酶解时间作为参考。0069从图3可以看出，游离ANN含量随着PH的升高先增后减，在PH为80时达到最大，这也正符合酶活和PH之间的关系。酶解液的腥味随着PH的升高与ANN含量和PH的关系正好相反，先下降后升高，酶解液在PH值为80时达到最小，随后随着PH升高腥味又增加且有一定的异味产生。因此，选取PH80最为本实施例的最初PH值。0070从图4中可以得知酶解液中游离ANN含量随着酶量的增加会不断地增加，而且增速由快到慢，酶解液的腥味随着酶量的增加刚开始会减小达到一个最。
25、小值后又开始增加。因此，综合考虑本实施例选用1200U/G的酶量为最初选用酶量。0071表3为胰蛋白酶酶解正交实验结果，由表3可知，从酶解液中游离ANN含量可知，温度、时间、PH、加酶量四个因素皆会影响胰蛋白酶的酶解效果，其中B（温度）D（加酶量）A（PH）C（时间），且A2B2C1D3组合效果更好，得到的游离ANN含量最高；从酶解液腥味值可知看，四种因素的影响也还比较显著，由极差R可知知B（温度）D（加酶量）A（PH）C（时间），且A2B2C1D2或A2B2C1D3组合效果更好，得到的酶解液腥味值最低。综合考虑，得出最佳组合为A2B2C1D3，即蛋白酶的最佳酶解条件为酶解PH为80，温度为5。
26、0，酶解时间为8H，加酶量为1200U/G。在此条件组合下，酶解得到的酶解液中游离ANN含量为3125MG/G，腥味值为78之间。0072为了验证该优化实验条件的可靠性，将该优化条件参数放大数倍，每个实验均重复3次，测得酶解液中游离ANN含量均值在2968MG/G左右，腥味值在78之间，验证了正交试验的可靠性。0073实施例2酶解寡肽的制备与分离纯化0074根据实施例1获得的酶解条件制备菲律宾蛤仔寡肽，即将新鲜菲律宾蛤仔洗净后去壳取肉，然后将蛤仔肉放入匀浆机中，倒入适量的蒸馏水匀浆。称取适量匀浆样品，加入2倍重量的水，加入1200U/G的胰蛋白酶，于酶解PH80，温度50条件下酶解反应8H，反。
27、应完成后于沸水浴灭活15MIN，冷却后于4，10000R/MIN预冷的离心机离心15MIN，取上清液。用截取分子量为3KDA的超滤膜，在20环境中超滤11H获得酶解液，冷冻干燥后备用。用DEAESEPHAROSEFF阴离子交换，柱型为2650CM，上样体积3ML，分别用磷酸缓冲液、01MOL/L、03MOL/L、05MOL/L的NACL溶液进行阶段洗脱，洗脱速度为1ML/MIN，280NM下紫外监测，自动部分收集器每管4ML进行收集。如图5所示，取3KDA以下的酶解液经DEAESEPHAROSEFF柱洗脱后，出现2个峰，即峰1（I1）和峰2（I2），分别为磷酸缓冲液和01MOL说明书CN104。
28、212861A6/9页8L1NACL溶液的洗脱组分，03MOLL1和05MOLL1的NACL溶液没有明显的洗脱峰。收集I1，冷冻干燥后得到13G干燥样品，得率为033。0075对收集到的峰1（I1）利用反相高效液相色谱法进一步纯化及检测，色谱条件为C18反相柱，填料为ODS；柱型是10250MM；以乙腈/水（1585）作为流动相，流速是08MLMIN1，上样体积为20L，波长220NM。洗脱条件为乙腈浓度15，洗脱时间为20MIN，重复上样。如图6所示，保留时间约为600MIN时，出现单一峰，峰高为10221，峰面积为51913，收集该峰，冷冻干燥后得到037G样品，得率为01。0076氨基酸。
29、序列检测，目标肽的氨基酸序列分析检测采用N末端降解检测方法，用氨基酸测序仪进行测定，得到菲律宾蛤仔酶解寡肽RUDITAPESPHILIPPINARUMOLIGOPEPTIDES，RPO，该目标肽的氨基酸序列为ASPTRPPROHIS，分子量为6076DA，命名为菲律宾蛤仔酶解寡肽RUDITAPESPHILIPPINARUMOLIGOPEPTIDES，RPO，分子结构式见图7。0077实施例3抗前列腺癌活性检测0078前列腺癌PC3、DU145细胞培养配制1000MLF12培养液，加入1176GNAHCO3，各10万IU的青霉素、链霉素，进行无菌抽滤，超净平台中分装后于20冰箱中低温保存，临用前。
30、100ML培养液中每加入10ML的胎牛血清。常规培养人前列腺癌PC3、DU145细胞株，置于37，5CO2培养箱中培养，23天传代一次。0079细胞增殖抑制实验采用MTT法检测体外培养前列腺癌PC3、DU145细胞存活率。实验时选用细胞生长到80以上且形态较好，处于对数生长期的PC3、DU145细胞悬液，以1104/ML接种至96孔板，每孔200L，培养24H后吸弃上清液。设对照组及10MG/ML、15MG/ML、20MG/ML、25MG/ML和30MG/MLRPO加药组，每组设3个复孔，分别培养24H、48H和72H后弃培养液，加药组加入200L1MG/MLMTT，继续培养4H。吸弃MTT，。
31、每孔加入150L的DMSO，振荡10MIN，置酶标仪在490NM波长处测吸光度，计算细胞增殖抑制指数（IR），实验重复3次，IR对照组A值加药组A值/（对照组A值调零孔A值100。如图8和图9所示，经不同浓度的RPO分别作用于PC3、DU145细胞后，结果表明随着RPO浓度的增加和作用时间的延长，增殖抑制指数明显上升，与对照组相比有统计学意义P005。因此，MTT结果显示PC3、DU145细胞经RPO作用后，呈现出明显的增殖抑制现象，并随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制指数明显增加，与时间和剂量呈依赖性。0080AO/EB荧光染色于6孔培养板内放入经经处理过的盖玻片，将PC3、DU145。
32、细胞浓度调至1105/ML，接种于培养板中的盖玻片上，每孔2ML，24H后观察并换液，设立对照组及10MG/ML、20MG/ML、30MG/MLRPO加药组，24H后用PBS清洗3次，再用95乙醇固定30MIN。取AO和EB各1MG分别溶解于10MLPH72的PBS缓冲液中，摇匀混合，现配现用，避光保存。观察前于载玻片上滴加40LPBS和10LAO/EB混合液，1020荧光显微镜下观察并拍照。如图1017所示，PC3、DU145细胞经RPO作用24H后AO/EB染色，在荧光显微镜下观察可见四种细胞，即活细胞核染色质均匀，呈绿色；早期凋亡细胞细胞膜完整，核染色质固缩，呈较强绿色；晚期凋亡细胞核染。
33、色质固缩，呈橘黄或橘红色；坏死细胞细胞呈均一橘红色；其中图1013为PC3细胞AO/EB细胞染色形态变化，而图1417为DU145细胞AO/EB细胞染色形态变化。对照组中细胞形态饱满呈上皮样生长，核形态正常呈亮绿色，如图10和图14；10MG/ML组的PC3和DU145细胞出现少许早期凋说明书CN104212861A7/9页9亡细胞，核呈绿色，染色质固缩成团块状位于细胞核一侧或出现新月形等异常变化，如图11和图15；20MG/ML组的PC3和DU145细胞早期凋亡细胞增多，细胞变圆，核仁数目减少，染色质固缩，分别呈橘黄色和黄绿色，如图12和图16；30MG/ML组的PC3和DU145细胞出现晚。
34、期凋亡和死亡细胞增多，细胞变圆，核染色质出现明显的固缩，颜色加深呈橘黄色；胞膜向外突出形成凋亡小体并且部分细胞核破碎呈橘红色，如图13和图17。0081流式细胞仪检测细胞凋亡PC3、DU145细胞按照1105/ML接种于6孔培养板中，24H后换液。设立对照组和10MG/ML、20MG/ML和30MG/MLRPO加药组，继续培养24H。用025胰蛋白酶消化液消化细胞，加入PBS缓冲液，吹打成单细胞悬液，室温下1200R/MIN离心5MIN后弃上清液，再用PBS重复洗涤1次。加入400L的试剂盒专用缓冲液，吹打成细胞悬液，然后向细胞悬液中加入5LANNEXINVFITC，混匀后再加入5L的PI，室。
35、温下放入暗室中静置5MIN后上机分析。0082流式细胞仪检测细胞周期取PC3、DU145单细胞悬液，将细胞浓度调至1105/ML，接种于6孔培养板，每孔2ML，培养24H后换液，设立对照组及10MG/ML、30MG/ML的RPO加药组，培养24H，收集各组细胞。用预冷的75乙醇溶液固定，并吹打成单细胞悬液，4下放置30MIN，1000R/MIN离心20MIN；PBS重悬细胞，加入PI和RNASEA至终浓度为50G/ML，37水浴30MIN且避光。上机测试，记录激发波长488NM处的红色荧光。每个样本利用亚二倍峰即亚G1期SUBG1法分析凋亡细胞，测定细胞的凋亡率，数据处理采用CELLQUEST。
36、软件分析检测结果。ANNEXINVFITC/PI双标记流式细胞术可以将实验样本中正常、坏死和凋亡细胞等分开，细胞分为四个区左上象限ANNEXINVFITCPI，代表的是机械损伤细胞；左下象限ANNEXINVFITC/PI，代表的是正常细胞；右上象限ANNEXINVFITC/PI为晚期凋亡；右下象限ANNEXINVFITC/PI，代表的是早期凋亡细胞。图1821为PRO对PC3细胞凋亡率的影响，图2225为PRO对DU145细胞凋亡率的影响，由图1825所示随着药物浓度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐上升，经统计加药组与对照组相比，差异有统计学意义P005。0083如图2633所示RPO作用于。
37、PC3、DU145细胞后，在细胞周期G0/G1期峰前出现SUBG1期峰（凋亡峰），记录SUBG1峰细胞凋亡百分率即为凋亡率。经寡肽作用后，G0/G1期细胞变化不大，S期减少，G2/M期细胞增多，加药组与对照组之间比较，有统计学意义（P001）。其中流式细胞术PI单染检测PC3细胞周期发现，对照组中SUBG1峰细胞凋亡百分率为069，如图28所示；10MG/ML组SUBG1峰细胞凋亡百分率为423，如图29所示；30MG/ML组SUBG1峰细胞凋亡百分率为563，如图30所示。流式细胞术PI单染检测DU145细胞周期发现，对照组中SUBG1峰细胞凋亡百分率为066，如图31所示；10MG/ML组。
38、SUBG1峰细胞凋亡百分率为367，如图32所示；30MG/ML组SUBG1峰细胞凋亡百分率为574，如图33所示。0084综上，由实施例3可知由胰蛋白酶酶解获得的菲律宾蛤仔寡肽ASPTRPPROHIS，0085在体外能抑制前列腺癌PC3和DU145细胞生长，诱导凋亡，改变细胞周期，使S期细胞减少，G2/M期细胞增加，细胞停滞于G2/M期。0086除特别说明外，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以通过其他方式实现本发明，其他说明书CN104212861A8/9页10在本发明范围内的技术方案与改进将对本发明所属领域的技术人员。
39、而言是显而易见的，根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此都在本发明的范围之内。0087表1不同蛋白酶的最适酶解温度和PH00880089表2四种蛋白酶酶解菲律宾蛤仔比较00900091表3胰蛋白酶酶解正交试验结果00920093注实施例1中使用的原料菲律宾蛤仔购于舟山市某菜市场；说明书CN104212861A109/9页110094实施例3中使用的人前列腺癌PC3、DU145细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所，由申请人所在实验室传代培养；0095各实施例中所用试剂和主要仪器信息如下0096木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和DEAESEPHAROSEFF阴离子交换柱（北京亚太恒信。
40、生物科技有限公司）；胰蛋白酶、MTT和碘化丙啶（PI）（SIGMA公司）；F12培养基（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；青霉素、链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司）；反相高效液相色谱柱C18由KROMASIL公司生产；（SIGMA公司）；AO/EB（杭州昊天生物技术有限公司）；ANNEXINFITC/PI双染试剂盒晶美生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。0097CF16RX型高速冷冻离心机（日本日立公司）；BSA124S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；PPSQ31A氨基酸测序仪SHIMADZUCORPORATION，日本。U2800型紫外可见分光光度计（上海美谱达公。
41、司）；BSZ40LCD自动部分收集器与HD2188蛋白检测仪（上海琪特分析仪器有限公司）；依利特P1201型高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）；MSC300超滤杯（超滤膜3KDA，上海摩速科学器材有限公司）；FORMA3111CO2培养箱（美国THERMO公司）；CKX41倒置相差显微镜和BX51荧光显微镜（OLYMPUS公司）；超净台（上海智城分析仪器制造有限公司）；酶标仪（美国BIORAD）；FACSCALBUR流式细胞仪（美国BD公司）。说明书CN104212861A111/1页120001序列表CN104212861A121/13页13图1图2说明书附图CN104212861。
42、A132/13页14图3图4说明书附图CN104212861A143/13页15图5图6说明书附图CN104212861A154/13页16图7图8说明书附图CN104212861A165/13页17图9图10说明书附图CN104212861A176/13页18图11图12说明书附图CN104212861A187/13页19图13图14说明书附图CN104212861A198/13页20图15图16说明书附图CN104212861A209/13页21图17图18图19说明书附图CN104212861A2110/13页22图20图21图22图23说明书附图CN104212861A2211/13页23图24图25图26说明书附图CN104212861A2312/13页24图27图28图29说明书附图CN104212861A2413/13页25图30图31图32图33说明书附图CN104212861A25。