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1、10申请公布号CN104178585A43申请公布日20141203CN104178585A21申请号201410400016122申请日20140814C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/11200601C12R1/9420060171申请人福建省农业科学院作物研究所地址350000福建省福州市郊新店埔党72发明人李华伟汤浩罗文彬纪荣昌许泳清邱思鑫刘中华邱永祥74专利代理机构福州市鼓楼区京华专利事务所普通合伙35212代理人王美花54发明名称马铃薯病毒检测引物及方法57摘要本发明根据马铃薯X病毒、马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒及马铃薯S病毒5种病毒。
2、的外壳蛋白序列保守区域，分别设计合成出了5对用以检测马铃薯病毒的引物；并同时揭露了利用该5对引物对马铃薯病毒进行检测的方法，具体地，采用多重RTPCR方法，应用5对特异性引物同时对马铃薯叶片中的5种病毒进行扩增检测，并将扩增产物克隆测序比对进行验证；从而建立了一种通过一次反应能够同时可靠的检测出5种马铃薯病毒的检测方法，且具有检测效率高、灵敏度高、成本低的特点。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表5页附图1页10申请公布号CN104178585ACN104178585A1/1页21一种马铃薯病毒检。
3、测引物，其特征在于具体包括如下五个引物对马铃薯X病毒引物对上游引物5CTGGCAAGCACAAGGTTT3，下游引物5TGGGCAGCATTCATTTCA3；马铃薯M病毒引物对上游引物5GCCGACTGAGCACGTGCAGCAGGT3，下游引物5GTCAGCATATGATTCCATGTCACCGG3；马铃薯Y病毒引物对上游引物5AGAGCAAGGCAGCATCCAGT3，下游引物5TGTTCATCCCCATCCATCAT3；马铃薯A病毒引物对上游引物5ATTTAGGTACTGCTGGGACT3，下游引物5TCAGGTTGCGTTGAAGAC3；马铃薯S病毒引物对上游引物5TGTAGAGGAG。
4、CATAGAGTTGG3，下游引物5CTTGTGGGCATTGTGAGC3。2根据权利要求1所述的马铃薯病毒检测引物，其特征在于所述马铃薯X病毒引物对对马铃薯X病毒PCR扩增出138BP的产物；所述马铃薯M病毒引物对对马铃薯M病毒PCR扩增出213BP的产物；所述马铃薯Y病毒引物对对马铃薯Y病毒PCR扩增出369BP的产物；所述马铃薯A病毒引物对对马铃薯A病毒PCR扩增出468BP的产物；所述马铃薯S病毒引物对对马铃薯S病毒PCR扩增出657BP的产物。3一种马铃薯病毒检测方法，其特征在于根据马铃薯X病毒、马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒及马铃薯S病毒五种病毒的外壳蛋白序列保守区域分别。
5、设计合成出如权利要求1中所述马铃薯X病毒引物对、马铃薯M病毒引物对、马铃薯Y病毒引物对、马铃薯A病毒引物对及马铃薯S病毒引物对；然后建立RTPCR检测体系，并利用所述马铃薯X病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯X病毒、马铃薯M病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯A病毒、马铃薯S病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯S病毒进行RTPCR反应，最后将反应产物进行1琼脂糖凝胶电泳分析和PCR产物克隆测序比对。4根据权利要求3所述的马铃薯病毒检测方法，其特征在于所述RTPCR反应的反应体系和反应程序如下反应体系反应体系的。
6、总体积为25L，含20L模板、015L5UL1的EXTAQ酶，20L25MMOLL1的DNTP，25L的10PCRBUFFER、030L10MOLL1的马铃薯X病毒上游引物、030L10MOLL1的马铃薯X病毒下游引物、005L10MOLL1的马铃薯M病毒上游引物、005L10MOLL1的马铃薯M病毒下游引物、030L10MOLL1的马铃薯Y病毒上游引物、030L10MOLL1的马铃薯Y病毒下游引物、015L10MOLL1的马铃薯A病毒上游引物、015L10MOLL1的马铃薯A病毒下游引物、02L10MOLL1的马铃薯S病毒上游引物、02L10MOLL1的马铃薯S病毒下游引物、其余成分为DDH。
7、2O；反应程序94预变性5MIN；94变性30S，56退火30S，72延伸1MIN，循环30次；最后72延伸L0MIN，4保存。权利要求书CN104178585A1/6页3马铃薯病毒检测引物及方法【技术领域】0001本发明涉及生物学领域的植物病毒检测引物及方法，具体涉及一种马铃薯病毒检测引物及方法。【背景技术】0002马铃薯SOLANUMTUBEROSUM是全世界主要的粮食作物，我国种植面积居全世界第一位FAO2006。马铃薯为无性繁殖作物，容易受到病毒的侵染，其一旦受到病毒浸染后，则会严重降低其产量和品质，一般会减产3050，严重时甚至减产90以上。据报道，能侵染马铃薯的有40余种病毒和2个。
8、类病毒，其中有9种病毒和1个类病毒对马铃薯影响最为严重。我国马铃薯各个产区均有马铃薯病毒病的发生，其中常见马铃薯病毒主要为马铃薯X病毒POTATOVIRUSX，PVX，马铃薯M病毒POTATOVIRUSM，PVM、马铃薯Y病毒POTATOVIRUSY，PVY、马铃薯A病毒POTATOVIRUSA，PVA、马铃薯S病毒POTATOVIRUSS，PVS、马铃薯卷叶病毒POTATOLEAFROLLVIRUS，PLRV和马铃薯纺锤块茎类病毒POTATOTUBERVIROID，PSTVD等，病毒病已成为制约马铃薯生产的重要因素之一，目前尚无有效的化学方法防治马铃薯病毒病，利用茎尖分生组织培育健康无毒的马。
9、铃薯已经成为预防马铃薯病毒病病最为有效的手段之一。在种薯生产过程中，病毒检测尤为重要，因此，建立一套快速、高效和稳定的马铃薯检测技术有利于加速育种进程，保证种薯质量和调运的安全。0003马铃薯病毒检测主要有指示植物检测法，电镜技术检测法、血清学检测法和核酸介导的分子生物学检测方法。传统的生物学检测方法对专业技术要求高，且费时费力，而一般的免疫学方法难以检测含量极少的韧皮部病毒如PLRV。基于核酸分子检测的聚合酶链式反应具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，目前广泛地用于马铃薯病毒检测。近年来，国内外研究者逐步将多重RTPCR技术运用到马铃薯病毒检测，与普通PCR检测方法相比，多重PCR检测技。
10、术具有在一个RTPCR反应中可同时检测多种病毒，操作更为简单，缩短了检测的时间与降低了实验成本等优点。但是，尚未有关能够检测包含PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的多重RTPCR反应体系的报道。【发明内容】0004本发明所要解决的技术问题在于提供一种马铃薯病毒检测引物及方法。0005本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种马铃薯病毒检测引物，其具体包括如下五个引物对0006马铃薯X病毒引物对上游引物5CTGGCAAGCACAAGGTTT3，下游引物5TGGGCAGCATTCATTTCA3；0007马铃薯M病毒引物对上游引物00085GCCGACTGAGCACGTGCAGCAGGT3，。
11、下游引物50009GTCAGCATATGATTCCATGTCACCGG3；说明书CN104178585A2/6页40010马铃薯Y病毒引物对上游引物5AGAGCAAGGCAGCATCCAGT3，下游引物5TGTTCATCCCCATCCATCAT3；0011马铃薯A病毒引物对上游引物5ATTTAGGTACTGCTGGGACT3，下游引物5TCAGGTTGCGTTGAAGAC3；0012马铃薯S病毒引物对上游引物5TGTAGAGGAGCATAGAGTTGG3，下游引物5CTTGTGGGCATTGTGAGC3。0013进一步地，所述马铃薯X病毒引物对对马铃薯X病毒PCR扩增出138BP的产物；所述马。
12、铃薯M病毒引物对对马铃薯M病毒PCR扩增出213BP的产物；所述马铃薯Y病毒引物对对马铃薯Y病毒PCR扩增出369BP的产物；所述马铃薯A病毒引物对对马铃薯A病毒PCR扩增出468BP的产物；所述马铃薯S病毒引物对对马铃薯S病毒PCR扩增出657BP的产物。0014进一步地，利用上述5个引物对对马铃薯病毒进行检测，检测方法如下根据马铃薯X病毒、马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒及马铃薯S病毒五种病毒的外壳蛋白序列保守区域分别设计合成出上述马铃薯X病毒引物对、马铃薯M病毒引物对、马铃薯Y病毒引物对、马铃薯A病毒引物对及马铃薯S病毒引物对；然后建立RTPCR检测体系，并利用所述马铃薯X病毒引。
13、物对对马铃薯叶片中的马铃薯X病毒、马铃薯M病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯A病毒、马铃薯S病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯S病毒进行RTPCR反应，最后将反应产物进行1琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。0015进一步地，所述RTPCR反应的反应体系和反应程序如下0016反应体系反应体系的总体积为25L，含20L模板、015L5UL1的EXTAQ酶，20L25MMOLL1的DNTP，25L的10PCRBUFFER、030L10MOLL1的马铃薯X病毒上游引物、030L10MOLL1的马铃薯X病毒下游引。
14、物、005L10MOLL1的马铃薯M病毒上游引物、005L10MOLL1的马铃薯M病毒下游引物、03L10MOLL1的马铃薯Y病毒上游引物、03L10MOLL1的马铃薯Y病毒下游引物、015L10MOLL1的马铃薯A病毒上游引物、015L10MOLL1的马铃薯A病毒下游引物、02L10MOLL1的马铃薯S病毒上游引物、02L10MOLL1的马铃薯S病毒下游引物、其余成分为DDH2O；0017反应程序94预变性5MIN；94变性30S，56退火30S，72延伸1MIN，循环30次；最后72延伸L0MIN，4保存。0018本发明的有益效果在于0019针对马铃薯X病毒、马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒、马。
15、铃薯A病毒及马铃薯S病毒5种病毒的外壳蛋白序列保守区域，分别设计合成了5对相应的特异性引物，并利用该5对特异性引物同时对马铃薯X病毒、马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒及马铃薯S病毒5种病毒进行RTPCR反应，建立了一种通过一次反应能够同时可靠的检测出5种马铃薯病毒的检测方法，具有检测效率高、灵敏度高及成本低的特点。【附图说明】0020下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。0021图1是本发明中实施例1的1琼脂糖凝胶电泳图。说明书CN104178585A3/6页50022图2是本发明中实施例2的1琼脂糖凝胶电泳图。0023图3是本发明中实施例4的1琼脂糖凝胶电泳图。【具体实施方式。
16、】0024本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于说明本发明的实施方法。0025实施例10026本发明马铃薯病毒检测方法，是根据马铃薯X病毒PVX、马铃薯M病毒PVM、马铃薯Y病毒PVY、马铃薯A病毒PVA及马铃薯S病毒PVS五种病毒的外壳蛋白序列保守区域分别设计合成出上述马铃薯X病毒引物对、马铃薯M病毒引物对、马铃薯Y病毒引物对、马铃薯A病毒引物对及马铃薯S病毒引物对；然后建立RTPCR检测体系，并利用所述马铃薯X病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯X病毒、马铃薯M病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯M病毒、马铃薯Y病毒引物对对马铃薯叶片中。
17、的马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯A病毒、马铃薯S病毒引物对对马铃薯叶片中的马铃薯S病毒进行RTPCR反应，最后将反应产物进行1琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。0027其中，马铃薯X病毒引物对如SEQIDNO1、2所示上游引物00285CTGGCAAGCACAAGGTTT3，下游引物00295TGGGCAGCATTCATTTCA3；马铃薯M病毒引物对如SEQIDNO3、4所示上游引物5GCCGACTGAGCACGTGCAGCAGGT3，下游引物5GTCAGCATATGATTCCATGTCACCGG3；马铃薯Y病毒引物对如SEQIDNO5、6所示上游引物5AGAGCAAG。
18、GCAGCATCCAGT3，下游引物5TGTTCATCCCCATCCATCAT3；马铃薯A病毒引物对如SEQIDNO7、8所示上游引物5ATTTAGGTACTGCTGGGACT3，下游引物5TCAGGTTGCGTTGAAGAC3；马铃薯S病毒引物对如SEQIDNO9、10所示上游引物5TGTAGAGGAGCATAGAGTTGG3，下游引物5CTTGTGGGCATTGTGAGC3。0030且本发明马铃薯病毒检测方法的具体操作步骤如下0031步骤1、根据GENBANK公布的马铃薯X病毒PVX、马铃薯M病毒PVM、马铃薯Y病毒PVY、马铃薯A病毒PVA及马铃薯S病毒PVS五种病毒的外壳蛋白CP序列保。
19、守区域，并应用PRIMERPREMIER50引物设计软件设计5对特异性引物对即所述马铃薯X病毒引物对、马铃薯M病毒引物对、马铃薯Y病毒引物对、马铃薯A病毒引物对、及马铃薯S病毒引物对，再利用CLUSTALX软件对所设计的5对特异性引物对进行序列比对，且由上海生物工程有限公司合成上述5对特异性引物对。0032步骤2、RNA提取将同时被PVX、PVM、PVY、PVA和PVS5种病毒复合侵染的马铃薯叶片01G、健康叶片01G分别进行RNA提取，并以健康叶片为阴性对照。RNA提取参照TAKARAMINIBESTPLANTRNAEXTRACTIONKIT方法01G马铃薯带病毒叶片或健康叶片放入研钵中，加。
20、入液氮研磨成粉状，接着将粉状转入15ML第一离心管中，加入450MLBUFFERRL裂解液，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；然后将第一离心管于12000RPM下离心5MIN，将上清移至第二离心管中，往第二离心管中加入上清液1/2体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混匀得混合液，将所得混合液全部转入到RNASPINCOLUMN含2MLCOLLECTIONTUBE中，接着在4、12000RPM下离心1MIN，弃滤液；将RNASPINCOLUMN放说明书CN104178585A4/6页6回到2MLCOLLECTIONTUBE中，加入500ULBUFFERRWA至RNASPINCOLUMN中，之后。
21、于4、12000RPM下离心30S，弃滤液；加入600ULBUFFERRWB至RNASPINCOLUMN中，4、12000RPM下离心30S，弃滤液，重复加入600ULBUFFERRWB至RNASPINCOLUMN中，4、12000RPM下离心30S，弃滤液；然后将RNASPINCOLUMN重新安置于2MLCOLLECTIONTUBE中，并于12000RPM下离心2MIN；再把RNASPINCOLUMN安置于15ML新的无RNA酶的离心管中，且在RNASPINCOLUMN中加入50ULDEPC处理水，室温静置5MIN，1最后于2000RPM下离心2MIN洗脱RNA。0033步骤3、反转录CDN。
22、A按照试剂盒THERMOSCIENTICREVERTAIDFIRSTSTRANDCDNASYNTHESISKIT操作将步骤2提取所得的RNA反转录为CDNA，具体内容为将反应管置于冰上，加入1ULPRIMEROLIGODT、9ULDEPC处理水、2ULRNA样品至反应管中，轻轻混匀再进行稍微离心，接着将反应管置于PCR仪中65反应5MIN后，立即将反应管置于冰上5MIN，之后于上述反应液再加入4UL5反转录酶缓冲液、10UL40U/UL的RNAASE抑制剂、10UL200U/UL反转录酶至反应管中，加入20ULDNTP混合液10MMEACH，轻轻混匀，再稍微离心，然后将反应管置于PCR仪中42。
23、反应60MIN，70反应5MIN，反应结束后冰上冷却。0034步骤4、PCR扩增以经步骤3处理所得的CDNA为模板，并以步骤1中获得的5对引物为引物对同时进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。0035为了进行对比，本实施例同时进行了单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应，其中，单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应的反应程序一致但反应体系不同。PCR扩增反应的反应体系和反应程序具体如下0036单重PCR反应体系反应体系的总体积为25L，包含20L模板、015L5UL1的EXTAQ酶、20L25MMOLL1的DNTP、25L10PCRBUFFER、10L10MOLL1的PVX或PVM或PVY或。
24、PVA或PVS的上游引物、10L10MOLL1的PVX或PVM或PVY或PVA或PVS的的下游引物、其余成分为DDH2O。0037多重PCR反应体系反应体系的总体积为25L，含20L模板、015L5UL1的EXTAQ酶，20L25MMOLL1的DNTP，25L的10PCRBUFFER、030L10MOLL1的马铃薯X病毒上游引物、030L10MOLL1的马铃薯X病毒下游引物、005L10MOLL1的马铃薯M病毒上游引物、005L10MOLL1的马铃薯M病毒下游引物、030L10MOLL1的马铃薯Y病毒上游引物、030L10MOLL1的马铃薯Y病毒下游引物、015L10MOLL1的马铃薯A病毒上。
25、游引物、015L10MOLL1的马铃薯A病毒下游引物、020L10MOLL1的马铃薯S病毒上游引物、020L10MOLL1的马铃薯S病毒下游引物、其余成分为DDH2O0038PCR反应程序为94预变性5MIN；94变性30S，56退火30S，72延伸1MIN，循环30次；最后72延伸10MIN，4保存。0039步骤5、取5LPCR产物以1琼脂糖凝胶荧光染料为电泳支持介质，在1TAE和120V电压下电泳30MIN，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图1。0040本实施例1琼脂糖凝胶电泳实验结果如图1所示，由PVX引物对、PVM引物对、PVY引物对、PVA引物对、PVS引物对5对引物参与的多重PCR。
26、扩增反应结果如图1中的标识1所示，PVS引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识2所示，PVA引物对的单重说明书CN104178585A5/6页7PCR扩增反应结果如图1中的标识3所示，PVY引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识4所示，PVM引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识5所示，PVX引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识6所示，健康叶片的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识N所示。由图1可知，PVS引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为657BP的条带，PVA引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为468BP的条带，PVY引物对的单重PCR扩增反应得。
27、到扩增片段长度为369BP的条带，PVM引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为213BP的条带，PVX引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为138BP的条带；由PVX引物对、PVM引物对、PVY引物对、PVA引物对、PVS引物对5对引物参与的多重PCR扩增反应，可同时得到扩增片段长度138BP、213BP、369BP、468BP和657BP的5条明亮清晰的条带，与单一RTPCR检测结果一致；可见，本发明可以一次性同时检测出马铃薯的PVX、PVM、PVY、PVA和PVS5种病毒，且特异性好、检测效率高。0041实施例20042选取复合感染5种病毒PVX、PVM、PVY、PVA、PVS。
28、的马铃薯总RNA即实施例1步骤1提取所得RNA的反转录产物为试验模板，按照10倍梯度稀释法依次将试验模板稀释，稀释倍数分别为100、101、102、103、104、105和106倍，然后进行多重RTPCR扩增反应反应体系与反应程序同实施例1，再进行1琼脂糖凝胶电泳实验，实验结果如图2所示，由图2可知，5种马铃薯病毒PVX、PVM、PVY、PVA、PVS在试验模板浓度稀释104倍时均仍能扩增出特异性条带，即试验模板浓度稀释104倍时均仍能检测到所述的5种马铃薯病毒的扩增产物，由此可见本发明检测方法具有较高的灵敏度。0043实施例30044将实施例1步骤4中的多重PCR反应体系得到的PCR扩增产物。
29、经割胶回收，然后分别与PMD18TVECTOR进行体外连接，再挑取阳性克隆，最后提取质粒测序，以检查PVX、PVM、PVY、PVA和PVS5种病毒的扩增结果。0045测序结果为PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的扩增产物分别是由138、213、369、468和566个核苷酸组成的序列，其中所述PVX扩增产物序列如SEQIDNO11所示，所述PVM扩增产物序列如SEQIDNO12所示，所述PVY扩增产物序列如SEQIDNO13所示，所述PVA扩增产物序列如SEQIDNO14所示，所述PVS扩增产物序列如SEQIDNO15所示。用NCBI分析同源性结果表明，所得的扩增产物序列SEQIDNO11。
30、与参考序列即PVX的外壳蛋白基因序列的同源率达到99，序列SEQIDNO12与参考序列PVM的外壳蛋白基因序列的同源率达到98，序列SEQIDNO13与参考序列PVY的外壳蛋白基因序列的同源率达到99，序列SEQIDNO14与参考序列PVA的外壳蛋白基因序列的同源率达到99，序列SEQIDNO15与参考序列PVS的外壳蛋白基因序列的同源率达到97；由此可见，所得的扩增产物SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14和SEQIDNO15序列分别为PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的外壳蛋白基因的部分序列，从而证明了本发明检测方法结果的可靠性。0046实施例4。
31、0047本发明检测方法同时检测PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的应用0048步骤1、选取福建省马铃薯主产区龙海、南安、长乐、福清、福安中疑似病毒症状例如，轻花叶、重花叶、卷叶等的马铃薯样品进行检测，7个采自田间的样品和8个茎说明书CN104178585A6/6页8尖脱毒苗样品进行RNA提取，15个马铃薯样品均为01G，接着对各样品进行RNA提取操作同实施例1的步骤2，并将RNA反转录成CDNA操作同实施例1的步骤3。0049步骤2以处理所得的CDNA为模板，并以本发明所述的5对引物为引物对同时进行多重PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。PCR扩增反应的反应体系和反应程序具体内容如下005。
32、0多重PCR反应体系反应体系的总体积为25L，含20L模板、015L5UL1的EXTAQ酶，20L25MMOLL1的DNTP，25L的10PCRBUFFER、030L10MOLL1的马铃薯X病毒上游引物、030L10MOLL1的马铃薯X病毒下游引物、005L10MOLL1的马铃薯M病毒上游引物、005L10MOLL1的马铃薯M病毒下游引物、030L10MOLL1的马铃薯Y病毒上游引物、030L10MOLL1的马铃薯Y病毒下游引物、015L10MOLL1的马铃薯A病毒上游引物、015L10MOLL1的马铃薯A病毒下游引物、02L10MOLL1的马铃薯S病毒上游引物、02L10MOLL1的马铃薯S。
33、病毒下游引物、其余成分为DDH2O；PCR反应程序94预变性5MIN；94变性30S，56退火30S，72延伸1MIN，循环30次；最后72延伸10MIN，4保存。0051步骤3、取5LPCR产物以1琼脂糖凝胶荧光染料为电泳支持介质，在1TAE和120V电压下电泳30MIN，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图3。0052本实施例1琼脂糖凝胶电泳实验结果如图3所示，利用多重RTPCR体系对15份马铃薯样品进行检测，图3中标识17为田间的样品分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、标识815为茎尖脱毒苗样品分别为样品8、样品9、样品10、样品11、样品12、样品13、样品14。
34、、样品15；且由图3可知，其中，样品1和样品6受PVX、PVM、PVY和PVA4种病毒的复合侵染，样品3、样品4和样品7受PVM、PVY、PVA和PVS4种病毒复合侵染，样品2受PVY、PVA和PVS3种病毒复合侵染，样品5受PVM、PVA和PVS3种病毒复合侵染；8个茎尖脱毒苗样品中，4份样品未检测到5种病毒，4份样品检测出5种病毒中的其中1种或2种，具体地，样品10中PVM未脱除，样品11和样品12中PVM、PVA均未脱除，样品13中PVS未脱除。可见，本发明所建立的多重RTPCR检测体系可以高效、快速地检测出马铃薯受侵染的5种病毒。此外，为了验证本发明检测的可靠性，申请人在进行本发明多重。
35、RTPCR检测的同时，运用单一RTPCR进行验证，结果显示单一RTPCR和多重RTPCR检测结果一致。0053本发明针对PVX、PVM、PVY、PVA和PVS5种病毒的外壳蛋白序列保守区域，分别设计合成了5对相应的特异性引物，并利用该5对特异性引物同时对马铃薯叶片中的PVX、PVM、PVY、PVA和PVS进行RTPCR反应，建立了一种新的PCR反应体系和反应程序，使RTPCR反应得到了大小差异明显，长度分别为138BP、213BP、369BP、468BP和657BP的5条PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的扩增片段序列；本发明实现了一次反应就能同时检测出5种马铃薯病毒即PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的目标，因而本发明检测效率高、灵敏度高、且检测结果可靠，此外，本发明所用试剂为分子生物学常用试剂，所需成本低。说明书CN104178585A1/5页900010002序列表CN104178585A2/5页100003序列表CN104178585A103/5页110004序列表CN104178585A114/5页120005序列表CN104178585A125/5页13序列表CN104178585A131/1页14图1图2图3说明书附图CN104178585A14。