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用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和病毒学领域。特别地，本发明涉及一种能够在体外组装成戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）的蛋白质，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防或治疗HEV感染及由HEV感染所导致的疾病，例如戊型肝炎等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV感染及由HEV感染所导致的疾病例如戊型肝炎等。此外，本发明还提供了制备HEV病毒样颗粒的方法。
背景技术
戊型病毒性肝炎是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）感染导致的，其是主要的病毒性肝炎之一，并且多数呈自限性。戊型病毒性肝炎的症状与甲型肝炎类似，但病死率更高，症状更重：孕妇病死率可高达20%，并且慢性肝病患者合并HEV感染易引发肝衰竭，死亡率达70%。
HEV主要通过肠道传播，但亦可通过输血或垂直途径传播，常常导致大规模的爆发流行。近半个世纪以来，文献记载了万例以上的戊型肝炎大爆发近十起，其中规模最大的一次发生于1986-1988年的中国新疆，共发病119,280例，死亡707人，其中包括414名孕妇。由于人们对HEV的研究很有限，因此长期以来戊型肝炎处于一种被忽视的状态。进入21世纪以来，随着戊型肝炎诊断试剂的灵敏度和特异性的大幅度提高，越来越多的戊型肝炎病例被确诊。据统计，全球大约有三分之一的人口曾感染过HEV。
越来越多的证据显示，戊型肝炎是一种人兽共患疾病。猪是HEV的最主要动物宿主，并且是人类戊型肝炎的重要传染源。我国学者对全国20个省市120个养猪场以及进口检疫的9,055只猪的HEV感染情况进行了血清学调查，结果证实我国商品猪中的HEV感染极其常见，总感染率高达83%，并且从国内多个地区的猪中分离到了HEV病毒株。
戊型肝炎病毒(HEV)是一种单股正链的RNA病毒，其衣壳是由单一结构蛋白组装成的T=3的二十面体对称结构，包裹约7.2kb的基因组。HEV病毒颗粒的直径为约27～34nm，无包膜。HEV基因组包含5′端帽状结构和多聚A尾，并且包含三个相互重叠的开放性读码框（ORF：ORF1,ORF2和ORF3），其两侧分别为一个短的5′端非编码区（5′UTR）和一个由多聚腺苷酸终止的短的3′端非编码区（3′UTR）。ORF1长约5kb，位于编码区的5′末端，是HEV最大的开放读码框，其主要作用为：在RNA合成酶的参与下，编码与病毒RNA复制有关的非结构蛋白（pORF1）。ORF2长约2kb，位于编码区的3′末端，为HEV的主要结构基因编码区，其主要作用为：编码病毒衣壳蛋白pORF2——一种含660个氨基酸的糖基化蛋白。近来还针对ORF2蛋白与HEV基因组5′末端的特异RNA结合活性进行了研究，结果显示，两者的相互作用可能有助于病毒衣壳的形成。ORF3是一个小的开放读码框，功能尚未被阐明。目前有研究提示，HEV ORF3蛋白可能在细胞信号转导、HEV颗粒组装、释放及免疫等方面起着重要的作用。
根据ORF2结构蛋白基因的同源性，HEV至少可分为4个主要的基因型。分子流行病学研究表明，HEV基因1型和2型主要感染人类，常导致爆发流行；基因3型和4型可同时感染动物和人类，呈散发性流行。四种型别的HEV代表株分别为缅甸株、墨西哥株、美国株和中国变异株。目前，将鸡HEV归为基因5型。各型HEV在ORF2氨基酸序列上具有较高的同源性，这导致在HEV血清学上世界各地的HEV均为同一血清型。
目前，HEV的细胞培养和组织培养均未能获得成功。然而，由于HEV的病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）可以较好的模拟天 然HEV颗粒，用于活性及功能上的基础研究以及戊型肝炎疫苗的研制。因此，国内外HEV的病毒样颗粒研究主要如下：通过各种表达系统获得结构蛋白，然后在体内或体外将结构蛋白组装成为病毒样颗粒（VLP），从而获得HEV的病毒样颗粒。目前，关于制备获得HEV VLP研究的报道包括如下：（1）通过利用杆状病毒/昆虫细胞表达HEV ORF2片段aa112-aa607，可在细胞裂解物中获得体内自组装的HEV VLP（Robinson等,Protein Expr Purif.1998,12(1):75-84）；（2）通过利用杆状病毒/昆虫细胞表达HEV ORF2片段aa14-aa608，其可在体外自组装成为HEV VLP（Li等，JBC.2010,August18）；（3）利用大肠杆菌表达HEV ORF2片段aa368-aa606，其可在体外自组装成为HEV VLP（Li等,Vaccine.2005,23:2893-2901;Li等,JBC.2005,28(5):3400-3406）。
迄今为止，世界上进入临床试验的戊型肝炎疫苗有两种：一种是由GSK公司研制的包含杆状病毒/昆虫细胞表达的HEV ORF2片段aa112-606的VLP疫苗，其在尼迫尔进入了II期临床试验，显示了良好的免疫原性，然而由于各种原因，该研究被中断；另一种是包含大肠杆菌表达的HEV ORF2片段aa368-aa606的VLP疫苗，该蛋白以包涵体形式表达后在体外组装（Li等，JBC，2005；Yang等，Protein Science，2013），其已经完成III期临床试验，显示了良好的安全性和保护性（Zhu等,Lancet,2010），并于2012年10月上市。由此可见，HEV VLP具有良好的免疫反应性和免疫原性，可用于研制戊型肝炎疫苗，是戊型肝炎疫苗的理想形式。
如上所述，目前已可通过2种方法来制备和获得HEV病毒样颗粒：1）利用昆虫细胞可溶性表达HEV ORF2的蛋白片段（aa112-606），其在昆虫细胞内组装成HEV病毒样颗粒；和2）利用大肠杆菌在包涵体内表达HEV ORF2的蛋白片段（aa368-606），其在体外溶解、复性并组装成HEV病毒样颗粒。这2种方法各有优缺点。第一种方法的优点在于，其能够表达长度更大的蛋白，从而所获得的病毒样颗粒更加接近于野生型病毒，有利于被机体的免疫系统识别并诱发高效的免疫应 答；其缺点在于，HEV病毒样颗粒在细胞内进行组装，从而存在着在HEV病毒样颗粒中引入宿主蛋白或核酸等杂质的风险。此外，第一种方法使用真核细胞表达系统，其成本高，周期长，且效率较低。第二种方法则恰好相反。
然而，之前从未报道过，HEV ORF2片段aa112-606能够在体外重新组装成病毒样颗粒。事实上，本发明人已尝试利用大肠杆菌来表达野生型HEV ORF2片段aa112-606并体外组装HEV病毒样颗粒，以期消除第一种方法的缺点（即，避免在HEV病毒样颗粒中引入宿主蛋白或核酸等杂质，并通过利用高效、周期短的原核表达系统来降低成本）。然而，结果显示，该蛋白片段能够在包涵体中表达，却难以在体外进行复性和组装，无法获得HEV病毒样颗粒。
因此，本领域需要提供一种新的制备HEV病毒样颗粒的方法，以解决上述技术问题。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
根据本发明，术语“载体（vector）”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质 粒等等。
根据本发明，术语“HEV ORF2”是指戊型肝炎病毒(HEV)基因组的ORF2，其序列是本领域公知的（参见，例如DDBJ数据登录号：D11092），并且编码HEV的衣壳蛋白。在本发明中，当涉及HEV ORF2的序列时，其使用DDBJ数据登录号：D11092所示的序列来进行描述。例如，表述“HEV ORF2编码的多肽的第112-606位氨基酸残基”（在本文中也简写为，HEV ORF2片段aa112-aa606或HEV ORF2aa112-aa606）中的第112-606位氨基酸残基是指，D11092编码的多肽的第112-606位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HEV ORF2或其编码的多肽中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失和/或添加），而不影响其生物学功能（在本发明中即，编码能够形成HEV VLP的衣壳蛋白）。因此，在本发明中，术语“HEV ORF2”应包括所有此类序列，包括例如D11092所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HEV ORF2（或其编码的多肽）的序列片段时，其不仅包括D11092（或其编码的多肽）的序列片段，还包括D11092（或其编码的多肽）的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HEV ORF2编码的多肽的第112-606位氨基酸残基”包括，D11092编码的多肽的第112-606位氨基酸残基，以及D11092编码的多肽的变体（天然或人工）中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
根据本发明，术语“HEV衣壳蛋白”是指，由HEV ORF2编码的蛋白，其能够组装成HEV病毒样颗粒。
根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽（例如，本发明的HEV衣壳蛋白）的氨基酸序列具有一个或多个（例如1-10个或1-5个或1-3个）氨基酸差异（例如，保守氨基酸置换），或者具有至少60%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，蛋白/多肽（例如，本发 明的HEV衣壳蛋白）的必要特性可以指，具有组装成HEV病毒样颗粒的能力。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时（例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据），那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序（DNAstar,Inc.）方便地进行的Needleman等人（1970）J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表（weight residue table）、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重（gap weight）和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学功能的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似（例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的 能力等）的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链（例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的（参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中使用的，术语“p239”、“239蛋白”或“p239蛋白”是指HEV ORF2片段aa368-aa606（其在aa368之前还包含由起始密码子编码的甲硫氨酸），其具有组装成为HEV VLP的能力，可用于制备戊型肝炎疫苗，并且可用于研究HEV VLP的组装机制。
如本文中使用的，术语“p495”、“p495蛋白”或“495蛋白”是指HEV ORF2片段aa112-aa606（其在aa112之前还包含由起始密码子编码的甲硫氨酸），其具有组装成为HEV VLP的能力，可用于研究HEV VLP的组装机制、感染机制，并且可用于HEV VLP的结构生物学的研究。
根据本发明，术语“病毒样颗粒（VLP）”是指不含病毒核酸的、在结构上与天然的病毒颗粒相似的空壳结构，其通常由病毒衣壳蛋白或其变体或片段组成。由于VLP在结构上与天然的病毒颗粒十分相似，因此，其具有很强的免疫原性和免疫反应性。同时，由于VLP不含病毒的遗传物质，因此，其不具有感染性。由于上述优点，VLP已被开发用作疫苗，其中一些VLP疫苗已经成功应用于临床，举例但不限于：Merck的四价VLP Gardasil疫苗，p239VLP疫苗等等。VLP在结构上 允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLP，并且能够将外源性抗原展示在其表面。此外，大部分VLP还具有包裹核酸或其他小分子的能力，因此，其还可作为基因或药物的运载工具。病毒样颗粒在本申请中也简称为颗粒。如本发明中使用的，当蛋白质在不存在变性因素的条件下能够组装成病毒样颗粒时，该蛋白质被称为“具有组装成病毒样颗粒的能力”。在本发明中，“变性因素”是指，能够使蛋白质发生变性的因素，其包括但不限于，高温（例如，加热），变性剂（例如尿素）等等。
根据本发明，术语“239颗粒”和“495颗粒”分别是指，由239蛋白形成的HEV病毒样颗粒，和由495蛋白或其突变体形成的HEV病毒样颗粒。
根据本发明，术语“组装”是指病毒的结构蛋白（例如衣壳蛋白）之间或结构蛋白与核酸之间通过各种相互作用，形成有规则的颗粒状结构的过程，其包括天然病毒颗粒的组装和病毒样颗粒的组装。
根据本发明，宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。
根据本发明，各种缓冲液是本领域公知的，包括但不限于，磷酸盐缓冲液等等。
根据本发明，术语“复溶缓冲液”是指，能够将蛋白质沉淀溶解的溶液，其是本领域技术人员公知的，包括但不限于Tris-HCl缓冲液。
根据本发明，术语“组装溶液”是指，能够使病毒的衣壳蛋白组装成病毒样颗粒的溶液。其通常是包含盐的温和缓冲液，例如包含盐的磷酸盐缓冲液。特别优选的是，包含NaCl的磷酸盐缓冲液。
可用于本发明的方法中的盐包括但不限于酸式盐，碱式盐，中性盐，例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄中的一种或几种。根据本发明，特别优选的盐是NaCl。
根据本发明，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互 换使用。根据本发明，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。在本申请中，除非明确指出或者根据上下文可以明确确定，否则在描述氨基酸残基的位置时，通常以HEV ORF2的序列为参照。例如，aa244是指，HEV ORF2的第244位氨基酸残基；H244是指，HEV ORF2的第244位氨基酸残基，组氨酸。又如，H244L是指，HEV ORF2的第244位氨基酸残基由组氨酸突变为亮氨酸。类似地，aa188、aa284、aa335、V188A、L284P、A335T等具有类似的含义。
根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995），并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂（例如氢氧化铝），弗氏佐剂（例如完全弗氏佐剂）；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
本发明至少部分基于本发明人的出人意料的发现：包含H244L突变（即，HEV ORF2的第244位氨基酸残基组氨酸被突变为亮氨酸）的p495蛋白突变体能够在大肠杆菌的培养上清中可溶性表达，并且能够在体外组装成HEV病毒样颗粒，并且由此获得的HEV病毒样颗粒具有优良的免疫原性和免疫反应性，可用于制备戊型肝炎疫苗。
因此，在一个方面，本发明提供了一种p495蛋白的突变体，其包含HEV ORF2的aa112-aa606，并且在与HEV ORF2的aa244相对应的位点上包含亮氨酸。
在一个优选的实施方案中，与野生型HEV ORF2的aa112-aa606相比，所述突变体还包含一个或多个另外的突变，例如1个、2个或3 个另外的突变。在一个优选的实施方案中，所述一个或多个另外的突变位于选自下述的位点：与HEV ORF2的aa188、aa284和aa335相对应的位点。在一个优选的实施方案中，所述突变体包含，在与HEV ORF2的aa188相对应的位点上的丙氨酸，在与HEV ORF2的aa284相对应的位点上的脯氨酸，和/或在与HEV ORF2的aa335相对应的位点上的苏氨酸。
在一个优选的实施方案中，所述突变体具有SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述突变体具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及编码本发明的突变体的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。然而，特别优选的是，本发明的宿主细胞为大肠杆菌细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种HEV病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的p495蛋白的突变体，或者由本发明的p495蛋白的突变体组成或形成。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的HEV病毒样颗粒包含具有SEQ ID NO：2，4，6，8或10所示序列的p495蛋白的突变体，或由所述突变体组成或形成。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述p495蛋白的突变体，或上 述多核苷酸或载体或宿主细胞或HEV病毒样颗粒的组合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的p495蛋白的突变体。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HEV病毒样颗粒。
在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HEV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病例如戊型肝炎等。
在一个优选的实施方案中，所述HEV病毒样颗粒以预防或治疗HEV感染或戊型肝炎有效量存在。
本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HEV病毒样颗粒的量为5μg－80μg，优选20μg－40μg。
在另一个方面，本发明涉及一种制备本发明的p495蛋白的突变体的方法，其包括利用大肠杆菌表达系统可溶性表达本发明的突变体，然后将含有该突变体的裂解上清进行纯化处理。
在一个优选的实施方案中，用于大肠杆菌表达系统的可溶性表达的条件例如可以是，15℃异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导10小时、20℃异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导8小时或25℃异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导8小时。在进一步优选的实施方案中，所述表达条件是25℃异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导8小时。
在一个优选的实施方案中，所述纯化处理包括，向裂解上清中添加硫酸铵（优选饱和硫酸铵）以将蛋白质沉淀出来，然后使用复溶缓冲液将蛋白沉淀进行复溶，然后使用阴离子交换层析对复溶的蛋白质进行纯化，从而获得经纯化的p495蛋白的突变体。
在一个优选的实施方案中，所添加的硫酸铵的终浓度例如可以是 10%、20%、30%、40%或50%，特别优选地是30%。在一个优选的实施方案中，所述复溶缓冲液是Tris-HCl缓冲液。在一个优选的实施方案中，所述阴离子交换层析可以是DEAE FF阴离子交换层析。
本发明还涉及一种制备本发明的HEV病毒样颗粒的方法，其在如上获得本发明的突变体的基础上，包括步骤：将经纯化的突变体透析至组装溶液中，并使其自组装成VLP。
在一个优选的实施方案中，用于组装的温度例如可以是4℃、15℃、25℃或37℃，特别优选地是37℃。在一个优选的实施方案中，组装溶液是本领域技术人员公知的，例如包含盐的磷酸盐缓冲液，特别优选的是包含NaCl的磷酸盐缓冲液。在一个优选的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液浓度例如可以是10mM、20mM、50mM或100mM，特别优选地是50mM。在一个优选的实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含0.4M NaCl、0.5M NaCl或0.6M NaCl，特别地优选地包含0.5M NaCl。在一个优选的实施方案中，所述的磷酸盐缓冲液pH例如可以是5.5、6.0、6.5、7.0或7.5，特别优选地是6.5。
本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HEV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病例如戊型肝炎等。
在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防或治疗有效量的根据本发明的HEV病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述由HEV感染所导致的疾病包括但不限于，戊型肝炎。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，还涉及根据本发明的突变体或HEV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防或 治疗HEV感染或由HEV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述由HEV感染所导致的疾病包括但不限于，戊型肝炎。
发明的有益效果
目前用于制备HEV病毒样颗粒的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。
在真核表达系统中表达的HEV衣壳蛋白天然构象破坏少，能自发形成VLP，往往表达出来后即为具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统例如杆状病毒表达系统和酵母表达系统存在表达量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难，并且不利于在细胞内研究VLP的组装机制。对于疫苗研制，需尽可能去除颗粒中的杂质，如宿主蛋白或核酸，该方法无法提供体外组装方法，对去除杂质造成大的困难。
在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量高等优点。然而，在大肠杆菌中表达的蛋白往往失去正确的天然构象，以包涵体形式表达于沉淀中。以包涵体形式表达于沉淀中的蛋白质（例如，p495蛋白）的复性是一个世界性难题。在很多情况下，难以在体外有效地对包涵体形式的蛋白质（例如，p495蛋白）进行复性，恢复其天然构象。
本发明人出人意料地发现，当将p495蛋白中的HEV ORE2的aa244突变成亮氨酸时，所获得的突变体能够在大肠杆菌中可溶性地表达，并且能够在体外组装成病毒样颗粒。与现有技术相比，本发明的方法采用了高效、周期短的原核表达系统，并且通过体外组装获得了HEV病毒样颗粒，其不仅避免了成本高、周期长、且效率较低的真核细胞表达系统的使用，消除了在细胞内进行组装时在HEV病毒样颗粒中引入宿主蛋白或核酸等杂质的风险，并且能够表达长度更大的蛋白（aa112-606），从而所获得的病毒样颗粒更加接近于野生型病毒，有利于被机体的免疫系统识别并诱发高效的免疫应答。所获得的HEV病毒样颗粒可用于戊型肝炎疫苗的研制，HEV的结构测定、HEV假病毒的 制备、蛋白颗粒组装机制和病毒感染机制等的研究。通过与已上市的p239疫苗的平行比较，本申请证实，本发明方法所获得的HEV病毒样颗粒具有优良的免疫反应性和免疫原性，可以用于制备戊型肝炎疫苗。
从上面的分析可知，本发明至少具有下述优点：首先，本发明使用大肠杆菌表达系统来表达HEV衣壳蛋白（p495蛋白），确保了高表达量和低成本；其次，本发明的方法提供无需变性的、可控的体外颗粒组装方法，并证实组装得到的HEV VLP具有良好的免疫反应性和免疫原性，与天然病毒颗粒形态相似，更适合于对天然病毒颗粒感染机制及其结构生物学等方面的研究；第三，本发明可表达与昆虫细胞表达的p495长度相同的蛋白，更接近于天然戊型肝炎病毒颗粒，且VLP组装方法操作简单易行。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了495蛋白及其突变体的表达情况。
图1A显示了HEV新疆株的495蛋白在大肠杆菌中的表达情况（通过考马斯亮蓝染色检测），其中，泳道1，495蛋白在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道2，495蛋白在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3，495蛋白在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4，495蛋白在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图1A的结果表明，495蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达，而基本上不能够以可溶形式表达于大肠杆菌培养物的裂解上清中。
图1B显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体1在大肠杆菌中的表达情况（通过Western印迹分析检测），其中，泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，495蛋白在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3，突变体1在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4，突变体1在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达；泳道5，突变体1在20℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道6，突变体1在20℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达；泳道7，突变体1在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道8，突变体1在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达。图1B的结果表明，495蛋白的突变体1在大肠杆菌中主要以可溶形式表达于裂解上清中，而基本上不以包涵体形式进行表达。
图1C显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体2－5在大肠杆菌中的表达情况（通过Western印迹分析检测），其中，泳道1：突变体2在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道2：突变体2在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3：突变体3在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4：突变体3在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道5：突变体4在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道6：突变体4在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道7：突变体5在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道8：突变体5在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图1C的结果表明，495蛋白的突变体2－5在大肠杆菌中主要以可溶形式表达于裂解上清中，而基本上不以包涵体形式进行表达。
图1D显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体6在大肠杆菌中的表达情况（通过Western印迹分析检测），其中，泳道1，495蛋白对照；泳道2，突变体6在37℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道3，突变体6在37℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道4，突变体6在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道5，突变体6在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的 包涵体沉淀中的表达；泳道6，突变体6在20℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道7，突变体6在20℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道8，突变体6在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道9，突变体6在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图1D的结果显示，495蛋白的突变体6在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达，而基本上不能够以可溶形式表达于大肠杆菌培养物的裂解上清中。
图2显示了含有495蛋白突变体1的裂解上清的饱和硫酸铵沉淀。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，495蛋白的包涵体形式的对照；泳道3，使用10%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道4,使用20%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道5,使用30%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道6,使用40%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道7,使用50%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀。结果显示，10-50％的饱和硫酸铵溶液均能够沉淀上清中的蛋白，并且30%的饱和硫酸铵溶液沉淀效果较好。
图3显示了495蛋白突变体1的饱和硫酸铵沉淀用不同缓冲液进行的复溶。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，用20mM TB pH9.0复溶后的沉淀；泳道3，用20mM TB pH9.0复溶后的上清；泳道4，用20mMTB pH8.5复溶后的沉淀；泳道5，用20mM TB pH8.5复溶后的上清；泳道6，用20mM TB pH8.0复溶后的沉淀；泳道7，用20mM TB pH8.0复溶后的上清；泳道8,495蛋白的包涵体形式的对照。结果显示，所使用的各种缓冲液均能够复溶突变体1的饱和硫酸铵沉淀，并且20mM TB pH8.5的复溶效果较好。
图4A显示了495蛋白突变体1的DEAE柱层析纯化图谱。柱平衡缓冲液：20mM TB8.5；洗脱缓冲液：20mM TB8.5+0.1M/0.3M/0.5M/1M NaCl；层析介质为DEAE Fast Flow。
图4B：495蛋白突变体1的DEAE柱层析纯化过程中收集的各级分的SDS-PAGE分析。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，用20mM TB8.5 复溶后的上清；泳道3，穿透样品；泳道4，DEAE-FF层析的100mM NaCl洗脱级分；泳道5，DEAE-FF层析的300mM NaCl洗脱级分；泳道6，DEAE-FF层析的500mM NaCl洗脱级分；泳道7，DEAE-FF层析的1M NaCl洗脱级分；泳道8，DEAE-FF层析的100mM NaOH洗脱级分。结果显示，495蛋白突变体1主要集中于100mM NaCl洗脱级分中。
图5A显示，经纯化的495蛋白突变体1的SDS-PAGE分析。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，未经沸水浴处理的经纯化的495蛋白突变体1；泳道3，经沸水浴处理10分钟的经纯化的495蛋白突变体1。
图5B显示了经纯化的495蛋白突变体1的分子筛层析。min：分钟，下同；对照蛋白为E2蛋白。
图5的结果显示，纯化后的495蛋白突变体1在溶液中主要以二聚体形式存在，并且不存在颗粒组分。
图6A显示，盐浓度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响。选取的盐浓度为0.1M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、1M。
图6B显示，缓冲液的pH值对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响。选取的pH为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。
图6C显示，温度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响。选取的温度为4℃、15℃、25℃、37℃。
图6D显示，磷酸盐溶液的浓度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响。选取的磷酸盐缓冲液浓度为10mM、20mM、50mM、100mM。
图7A显示了495颗粒的电镜观察结果。条棒（Bar），100nm。
图7B显示了495颗粒的分子筛层析结果。对照为239颗粒。
图7C显示了495颗粒的动态光散射分析结果。
图7D显示了495颗粒的沉降速率分析结果。
图7E-7G显示了由突变体2-4形成的VLP的透射电镜观察结果。
图8显示了495颗粒与各种HEV（I）特异性抗体的WB反应活性。所使用的抗体1-10（对应于泳道1-10）分别为：8C11、8G12、8H3、9F7、6F8、12A10、16D7、4A6、1B7、3G4。
图9显示了495颗粒与HEV（I）特异性抗体的Elisa反应活性。 所使用的抗体分别为：8C11、8G12、8H3、9F7、6F8、12A10、16D7、4A6、1B7、3G4；对照为239颗粒。
图10显示了495颗粒与HEV（I）特异性抗体8C11的EC50分析。8C11初始浓度为4000ng/ml，连续两倍系列稀释24个梯度；对照为239颗粒。
图11显示了495颗粒与HEV（I）特异性抗体8C11的WB反应活性。8C11稀释比例为1:2K；对照为239颗粒。
图8-11的结果显示，由495蛋白突变体1组装的HEV VLP保留了良好的免疫反应性，能够被多种HEV特异性抗体所识别。
图12显示了495颗粒吸附细胞的能力。阻断抗体为8C11，检测抗体为16D7，稀释比例为1:2K；对照为239颗粒。结果显示，495颗粒和239颗粒均能够吸附进入细胞，并且该过程能够被阻断抗体（例如单抗8C11）所阻断。
图13显示了495假病毒的电镜观察结果。条棒（Bar），100nm。
图14显示了495假病毒的分子筛层析分析。A:495颗粒的双波长检测结果；B:N31-GFP质粒的双波长检测结果；C:495颗粒包裹N31-GFP质粒（形成假病毒）后的双波长检测结果；检测波长为260nm和280nm。结果显示，495颗粒能够包裹N31-GFP质粒，形成495假病毒，并且495假病毒的保留时间为10.8min。
图15显示了495假病毒转染HepG2后的倒置荧光显微镜观察结果。图15A:单独的GFP质粒可成功转染HepG2细胞；图15B:495假病毒吸附细胞三天后的倒置荧光显微镜观察结果；图15C:495假病毒吸附细胞七天后的倒置荧光显微镜观察结果。结果显示，495假病毒能够感染HepG2细胞，并在细胞中表达报道基因GFP。
图16显示了495颗粒的免疫原性。对照为239颗粒。使用的剂量分别为0.5ug（图16A）和5ug（图16B）。结果显示，495颗粒具有与239颗粒相似的免疫原性，均能够引发机体产生中和抗体。此外，结果还显示，在低剂量（0.5ug）下，495颗粒甚至具有比239颗粒更高的免疫原性。
序列信息
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述

SEQ ID NO:序列描述序列信息1编码p495蛋白突变体1的核苷酸序列见下文2p495蛋白突变体1的氨基酸序列见下文3编码p495蛋白突变体2的核苷酸序列见下文4p495蛋白突变体2的氨基酸序列见下文5编码p495蛋白突变体3的核苷酸序列见下文6p495蛋白突变体3的氨基酸序列见下文7编码p495蛋白突变体4的核苷酸序列见下文8p495蛋白突变体4的氨基酸序列见下文9编码p495蛋白突变体5的核苷酸序列见下文10p495蛋白突变体5的氨基酸序列见下文11编码p495蛋白突变体6的核苷酸序列见下文12p495蛋白突变体6的氨基酸序列见下文13495F5’-CATATGGCGGTCGCTCCGGCTC-3’14495R5’-GAATTCTTACGCAGAGTGGGGGGCT-3’
序列1(SEQ ID NO:1)：
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具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本 领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.495蛋白及其突变体的构建
以HEV新疆株序列（NC_001434.1）为模板，合成ORF2基因序列（Invitrogen）并连接到pMD-18T载体上，得到质粒pMD-18T-ORF2。以pMD-18T-ORF2为模板，以495F为正向引物（其序列5′端引入限制性内切酶Nde I位点（CATATG），ATG为大肠杆菌表达系统中的起始密码子）,以495R为反向引物（其序列3′端引入限制型内切酶BamHI位点），在PCR热循环仪（Biometra T3）中按照如下条件进行PCR反应：

扩增产物为1500bp左右的DNA片段。将该PCR产物与商售的pMD18-T载体（TAKARA公司生产）连接，经NdeI/BamHI酶切鉴定，得到插入495基因的阳性克隆质粒pMD 18-T-495。在上海博亚生物工程公司，利用M13(+)引物，对pMD 18-T-495质粒进行测序验证。
通过本领域技术人员公知的方法，对pMD 18-T-495质粒进行点突变，制备如下突变体的克隆质粒，并分别命名为pMD 18-T-495-Mut1、pMD 18-T-495-Mut2、pMD 18-T-495-Mut3、pMD 18-T-495-Mut4、pMD 18-T-495-Mut5和pMD 18-T-495-Mut6。
表2：突变体1-6的位点突变说明

序列4（突变体2）VLPT序列6（突变体3）VLLT序列8（突变体4）VLLA序列10（突变体5）ALPA序列12（突变体6）AHPT
下文以突变体1为例，示意性地说明上述突变体的表达质粒的构建。将突变体1（495-Mut1）的克隆质粒pMD 18-T-495-Mut1用NdeI/BamHI酶切，与经NdeI/BamHI酶切的pTO-T7原核表达载体（罗文新等，生物工程学报，2000,16:53-57）相连接，并转入大肠杆菌；提取质粒，经NdeI/BamHI酶切鉴定得到插入目的片段的阳性表达质粒pTO-T7-495-Mut1。
取1μL质粒（0.15mg/ml）转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566（购自Invitrogen公司），将其涂布于含卡那霉素（终浓度100mg/ml，下同）的固体LB培养基（成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同），并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基（含卡那霉素）的试管，在37℃180转/分钟下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃保存。
通过与上述类似的方法，制备495蛋白的突变体2-6的表达质粒，分别命名为pTO-T7-495-Mut2、pTO-T7-495-Mut3、pTO-T7-495-Mut4、pTO-T7-495-Mut5和pTO-T7-495-Mut6。另外，还制备HEV ORF2（新疆株）的495蛋白的表达质粒，将其命名为pTO-T7-495。
实施例2.495蛋白及其突变体的表达
从-70℃超低温冰箱中取出5μL菌液，接种于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃250rpm下振荡培养直至OD600达0.5左右；然后，转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，在37℃250rpm下振荡培养4-5小时。当OD600达1.5左右时，加入IPTG至终浓度 0.4mM，在250rpm下，分别在15℃、20℃或25℃下振荡诱导10个、8个或8个小时。将培养物以8000rpm离心5min，收集菌体，并对菌体进行超声破碎。菌体破碎后，进行离心，并取上清及沉淀进行检测（使用考马斯亮蓝染色或Western印迹分析，Western印迹分析使用抗HEVORF2单抗16D7（稀释比例1：2000，本实验室自制）），以鉴定495蛋白及其突变体的表达情况。检测结果如图1所示。
图1A显示了HEV新疆株的495蛋白在大肠杆菌中的表达情况（通过考马斯亮蓝染色检测），其中，泳道1，495蛋白在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道2，495蛋白在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3，495蛋白在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4，495蛋白在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图1A的结果表明，495蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达，而基本上不能够以可溶形式表达于大肠杆菌培养物的裂解上清中。
图1B显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体1在大肠杆菌中的表达情况（通过Western印迹分析检测），其中，泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，495蛋白在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3，突变体1在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4，突变体1在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达；泳道5，突变体1在20℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道6，突变体1在20℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达；泳道7，突变体1在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道8，突变体1在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体上清中的表达。图1B的结果表明，495蛋白的突变体1在大肠杆菌中主要以可溶形式表达于裂解上清中，而基本上不以包涵体形式进行表达。
图1C显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体2－5在大肠杆菌中的表达情况（通过Western印迹分析检测），其中，泳道1：突变体2在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道2：突变体2在大肠杆 菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道3：突变体3在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道4：突变体3在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道5：突变体4在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道6：突变体4在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道7：突变体5在大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道8：突变体5在大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图1C的结果表明，495蛋白的突变体2－5在大肠杆菌中主要以可溶形式表达于裂解上清中，而基本上不以包涵体形式进行表达。
图1D显示了HEV新疆株的495蛋白的突变体6在大肠杆菌中的表达情况（通过Western印迹分析检测），其中，泳道1，495蛋白对照；泳道2，突变体6在37℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道3，突变体6在37℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道4，突变体6在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道5，突变体6在25℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道6，突变体6在20℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道7，突变体6在20℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达；泳道8，突变体6在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的裂解上清中的表达；泳道9，突变体6在15℃诱导下的大肠杆菌培养物的包涵体沉淀中的表达。图1D的结果显示，495蛋白的突变体6在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达，而基本上不能够以可溶形式表达于大肠杆菌培养物的裂解上清中。
分析图1A-1D的结果可知，HEV ORF2的aa244的氨基酸残基对于495蛋白及其突变体的可溶性表达十分重要。当aa244为H时，所述蛋白主要以包涵体形式在大肠杆菌培养物中表达（参见图1A和1D）；然而，当aa244为L时，所述蛋白主要以可溶形式在大肠杆菌培养物的裂解上清中表达（参见图1B和1C）。与此同时，图1的结果还显示，其它位点的突变（例如，aa188、aa284和aa335）对495蛋白突变体的可溶性表达以及495蛋白本身的包涵体表达基本上没有影响（参见图1B-1D）。
实施例3.495蛋白突变体的纯化
本实施例以495蛋白突变体1为例，示例性地说明了能够在大肠杆菌中可溶性表达的495蛋白突变体的纯化。
在IPTG诱导表达后，通过8000rpm离心5min来收集菌体，然后按1g菌体对应10mL裂解液（20mM Tris缓冲液pH7.2，300mM NaCl）的比例用裂解液重悬菌体，冰浴，用超声破碎仪（Sonics VCX750型超声破碎仪）处理菌体（处理条件：工作时间15min，脉冲2s，暂停4s，输出功率55%）。菌体裂解液以12000rpm，4℃离心5min（下同），弃沉淀保留上清（即，可溶性表达）。
饱和硫酸铵初纯
用终浓度为10%、20%、30%、40%、50%（体积百分比）的饱和硫酸铵溶液对上一步骤获得的离心上清进行沉淀，冰浴搅拌30min后离心，对沉淀进行SDS-PAGE分析。分析结果如图2所示。
图2显示了含有495蛋白突变体1的裂解上清的饱和硫酸铵沉淀。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，495蛋白的包涵体形式的对照；泳道3，使用10%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道4,使用20%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道5,使用30%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道6,使用40%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀；泳道7,使用50%饱和硫酸铵从突变体1的裂解上清获得的沉淀。结果显示，10-50％的饱和硫酸铵溶液均能够沉淀上清中的蛋白，并且30%的饱和硫酸铵溶液沉淀效果较好。
Tris-HCl缓冲液(TB)及磷酸盐缓冲液对沉淀的复溶
分别用20mM TB pH8.0、20mM TB pH8.5、20mM TB pH9.0缓冲液对沉淀进行复溶，对复溶上清及沉淀进行SDS-PAGE分析。分析结果如图3所示。
图3显示了495蛋白突变体1的饱和硫酸铵沉淀用不同缓冲液进行的复溶。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，用20mM TB pH9.0复溶后的沉淀；泳道3，用20mM TB pH9.0复溶后的上清；泳道4，用20mM TB pH8.5复溶后的沉淀；泳道5，用20mM TB pH8.5复溶后的上清；泳道6，用20mM TB pH8.0复溶后的沉淀；泳道7，用20mM TB pH8.0复溶后的上清；泳道8,495蛋白的包涵体形式的对照。结果显示，所使用的各种缓冲液均能够复溶突变体1的饱和硫酸铵沉淀，并且20mM TB pH8.5的复溶效果较好。
DEAE阴离子交换层析纯化
用DEAE阴离子交换柱进行层析纯化。简言之，用20mM TB8.5缓冲液平衡上样，然后依次用20mM TB8.5+0.1M/0.3M/0.5M/1M NaCl进行洗脱，最后用0.1M NaOH进行洗脱。纯化色谱图及各个洗脱级分的SDS-PAGE分析图分别如图4A、4B所示。
图4A显示了495蛋白突变体1的DEAE柱层析纯化图谱。柱平衡缓冲液：20mM TB8.5；洗脱缓冲液：20mM TB8.5+0.1M/0.3M/0.5M/1M NaCl；层析介质为DEAE Fast Flow。
图4B：495蛋白突变体1的DEAE柱层析纯化过程中收集的各级分的SDS-PAGE分析。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，用20mM TB8.5复溶后的上清；泳道3，穿透样品；泳道4，DEAE-FF层析的100mM NaCl洗脱级分；泳道5，DEAE-FF层析的300mM NaCl洗脱级分；泳道6，DEAE-FF层析的500mM NaCl洗脱级分；泳道7，DEAE-FF层析的1M NaCl洗脱级分；泳道8，DEAE-FF层析的100mM NaOH洗脱级分。结果显示，495蛋白突变体1主要集中于100mM NaCl洗脱级分中。
类似地，使用上述方法对495蛋白的突变体2-5进行纯化。
实施例4:纯化后的495蛋白突变体的性质验证
按照之前描述的方法，利用SDS-PAGE及分子筛层析分析，通过待测样品的保留时间（Schuck P等，Biophys J,2000,78:1606-1619） 测定经纯化的495蛋白突变体在溶液中的状态。测定结果如图5A、5B所示。
图5A显示，经纯化的495蛋白突变体1的SDS-PAGE分析。泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，未经沸水浴处理的经纯化的495蛋白突变体1；泳道3，经沸水浴处理10分钟的经纯化的495蛋白突变体1。
图5B显示了经纯化的495蛋白突变体1的分子筛层析。min：分钟，下同；对照蛋白为E2蛋白。
结果显示，纯化后的495蛋白突变体1在溶液中主要以二聚体形式存在，并且不存在颗粒组分。
使用上述方法对495蛋白的突变体2－5进行类似的分析，并且获得了类似的结果。
实施例5：495蛋白突变体的颗粒组装
在本实施例中，研究了使用上述经纯化的突变体1-5来组装HEV病毒样颗粒的最佳条件。
如之前实施例所证实的，本发明人意外地发现，包含HEV ORF2的H244L突变的495蛋白突变体能够以可溶形式表达于大肠杆菌培养物的裂解上清中。由此，所获得的495蛋白突变体无需如包涵体那样用变性剂进行处理，始终接近于其天然状态，从而可容易地进行颗粒组装。例如，一般可通过将495蛋白突变体透析至一定温度的含有一定盐浓度的磷酸盐缓冲液中，来使495蛋白突变体组装为颗粒。
以下以495蛋白突变体1为例，分析了495蛋白突变体1的颗粒组装能力以及用于颗粒组装的最佳条件。
盐浓度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响
将经过纯化的495蛋白突变体1溶液稀释至0.7mg/ml，并且将其透析至含有终浓度为0.1M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、1M NaCl的50mM PB 6.5组装缓冲液中。另外，将由239蛋白组装的颗粒（Li等，JBC，2005）用作对照。透析后通过分子筛层析分析各个495蛋白突变体1样品在各组装溶液中的状态。
结果如图6A所示。结果显示，所使用的缓冲液均能够使495蛋白突变体1发生颗粒组装，并且当NaCl浓度为0.5M时，组装效果较好。特别地，当NaCl浓度为0.5M时，样品中主要组分有两种，其中一种为之前所述的495蛋白突变体1的二聚体形式，另一种组分的保留时间与p239组装成的VLP大致相同，这表明溶液中存在颗粒组分，并且颗粒形态及大小与p239组装成的VLP相似。
缓冲液的pH值对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响
将经过纯化的p495蛋白突变体1溶液稀释至0.7mg/ml，并且将其透析至pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5且含有0.5M NaCl的组装溶液中。透析后通过分子筛层析分析突变体1在各组装缓冲液中的状态。
结果如图6B所示。结果显示，pH值对p495蛋白突变体1的颗粒组装的影响不明显。然而，当pH为6.5时，495蛋白突变体1组装成病毒样颗粒的效率较高。
温度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响
将经过纯化的p495蛋白突变体1溶液稀释至0.7mg/ml，并且将其透析至温度为4℃、15℃、25℃、37℃的含有0.5M终浓度的NaCl的50mM pH6.5的磷酸盐组装溶液中。透析后通过分子筛层析分析突变体1在各组装溶液中的状态。
结果如图6C所示。结果显示，在各个温度下，p495蛋白突变体1均能发生颗粒组装。然而，当组装温度为37℃时，p495蛋白突变体1的组装效率明显提高。
磷酸盐溶液的浓度对495蛋白突变体1的颗粒组装的影响
将经过纯化的495蛋白突变体1溶液稀释至0.7mg/ml，并且将其透析至终浓度为10mM、20mM、50mM、100mM的含0.5M NaCl、pH6.5的磷酸盐组装溶液中。透析后通过分子筛层析分析突变体1在各组装 溶液中的状态。
结果如图6D所示。结果显示，磷酸盐溶液的浓度对495蛋白的组装影响不明显。10-100mM的磷酸盐溶液均能够使495蛋白突变体1组装成病毒样颗粒。
使用上述方法对495蛋白的突变体2－5进行类似的分析，并且获得了类似的结果。
实施例6：由495蛋白突变体组装的病毒样颗粒的最终状态
在本实施例中，以495蛋白突变体1为例，使用实施例5描述的最佳颗粒组装条件，将经纯化的495蛋白突变体在37℃下透析至温度为37℃、含有0.5M NaCl、PH为6.5的磷酸盐溶液中，从而得到HEV病毒样颗粒（下文简称为，495病毒样颗粒或495颗粒）。使用透射电镜观察、分子筛层析分析、动态光散射分析、沉降速率分析等方法对495颗粒的性质和最终状态进行研究。
透射电镜观察
使用的仪器为日本电子公司生产的200kV透射电镜，放大倍数为25,000倍。将获得的495颗粒用2%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上进行观察。电镜结果见图7A。结果显示，样品大部分呈现直径为30nm左右、大小均匀的病毒样颗粒。
分子筛分析
采用德国安捷伦的1120Compact LC高效液相色谱层析系统以及TSK Gel PW5000xl7.8x300mm柱子进行分子筛层析分析。以2倍柱体积的缓冲液20mM PB6.5+0.5M NaCl预先平衡层析柱，直至280nm波长吸收值无明显变化。将检测器的吸收值归零，然后由自动进样器进样并进行分析。结果如图7B所示。结果显示，495颗粒的保留时间为13.7min。
动态光散射测定
使用的仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪（含温度控制器），使用的算法为Regulation算法。所获得的495颗粒样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图7C。结果显示，495颗粒在溶液中为组分单一的、水化分子动力学半径为15nm的颗粒。
沉降速率分析
使用的仪器为美国Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测系统及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法分析495颗粒的沉降系数。结果如图7D所示。结果显示，495颗粒的沉降系数约为47.56S。
使用上述方法对495蛋白的突变体2－5进行类似的分析，并且获得了类似的结果。特别地，图7E-7G显示了由突变体2-4形成的VLP的透射电镜观察结果。结果显示，样品大部分呈现直径为30nm左右、大小均匀的病毒样颗粒。
实施例7：495颗粒的免疫反应活性的研究
本实施例以由495蛋白突变体1组装的HEV VLP为例，使用现有HEV-I基因型特异单抗，通过Western免疫印迹实验及酶联免疫吸附实验（ELISA），分析495颗粒的反应活性。
通过Western印迹实验分析495颗粒与HEV-I基因型特异单抗的反应活性
组装后的495颗粒样品经12%的SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶室温封闭2h；加入经稀释的单抗（1:1000），置于室温反应1h（所使用的单抗8C11、8G12、8H3、9F7、6F8、12A10、16D7、4A6、1B7、3G4均为本实验室制备的HEV-I基因型特异性抗体）； 用TNT溶液（8.765g NaCl、1.21g Tris Base和0.5ml Tween-20，加去离子水至1L，调pH为8.0）洗膜3次，每次10min；然后加入羊抗鼠碱性磷酸酶（1:5000）（KPL产品），置于室温反应1h；用TNT洗膜3次，每次10min；用NBT(Nitro blue tetrazolium)和BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)底物进行显色。如图8所示。
通过ELISA实验分析495颗粒与HEV-I基因型特异单抗的反应性
以缓冲液50mM PB6.5+0.5M NaCl稀释蛋白至终浓度1ng/μl，然后在96孔板上进行包被（包被体积100μl），37℃温育2h。在37℃封闭2h后，抽干，加入稀释比例为1:100的单抗（所选单抗8C11、8G12、8H3、9F7、6F8、12A10、16D7、4A6、1B7、3G4均为本实验室制备的HEV-I基因型特异性抗体），三倍倍稀，稀释12个梯度；37℃反应30min；洗板，然后加入HRP标记的抗鼠IgG二抗（KPL产品），37℃反应30min；洗板，37℃显色15min，然后在450nm处读取吸光值（参比波长为620nm）。阳性对照为p239。选取线性范围内的读值作图，如图9所示。
495颗粒对HEV-I基因型特异单抗8C11的EC50
采用直接法进行检测。简言之，组装后的495颗粒按照100ng/孔进行包被，于37℃温箱中孵育2小时，洗涤一次后加入封闭液，于37℃温箱中孵育2小时，取出拍干。加入8C11（起始浓度4000ng/ml），2倍稀释，稀释24个梯度，于37℃温箱中孵育60min，洗涤5次,加入二抗GAM-HRP（稀释梯度1:5000）于37℃温箱孵育30min，洗涤5次，加入显色液A、B各50ul，37℃显色15min，终止后立即读值。对照蛋白为p239。结果如图10所示。
通过WB分析495颗粒对HEV-I基因型特异单抗8C11的反应性
组装后的495颗粒样品经12%的SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维 素膜上，用5%脱脂奶室温封闭2h；加入经稀释的单抗8C11（实验室制备，稀释度1:1000），置于室温反应1h；用TNT溶液（8.765g NaCl、1.21g Tris Base和0.5ml Tween-20，加去离子水至1L，调pH为8.0）洗膜3次，每次10min；然后加入羊抗鼠碱性磷酸酶（1:5000）（KPL产品），置于室温反应1h；用TNT洗膜3次，每次10min；用NBT(Nitro blue tetrazolium)和BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)底物进行显色。对照蛋白为p239。如图11所示。
上述实验的结果显示，由495蛋白突变体1组装的HEV VLP保留了良好的免疫反应性，能够被多种HEV特异性抗体所识别。使用上述方法对由495蛋白的突变体2-5组装的HEV VLP进行类似的分析，并且获得了类似的结果。
实施例8：495颗粒吸附入细胞的研究
本领域技术人员熟知，239颗粒可以模拟天然病毒颗粒吸附到细胞表面粘膜并自主侵入细胞内部。本实施例以由495蛋白突变体1组装的HEV VLP为例，分析了495颗粒是否具有与239颗粒相似的性质。
分别将495颗粒（20ug）、239颗粒（20ug）（239颗粒蛋白为阳性对照）、495颗粒＋单抗8C11或者239颗粒＋单抗8C11与HepG2细胞孵育30min后，清洗细胞以去除残余颗粒样品。将细胞裂解后，获取上清液并通过Western免疫印迹分析495蛋白及239蛋白的存在。用于检测的样品浓度严格定为1mg/ml，所使用的检测一抗为16D7，稀释倍数为1：2000，二抗为GAM-HRP，稀释倍数为1：5000，检测系统为GE ImageQuant LAS 400 mini。Western免疫印迹分析的结果如图12所示。
结果显示，495颗粒和239颗粒均能够吸附进入细胞，并且该过程能够被阻断抗体（例如单抗8C11）所阻断。
使用上述方法对由495蛋白的突变体2-5组装的HEV VLP进行类似的分析，并且获得了类似的结果。
实施例9：使用495颗粒来制备HEV假病毒的研究
如实施例5和6所描述的，p495蛋白能够在体外自组装成VLP。本实施例以由495蛋白突变体1组装的HEV VLP和报告基因绿色荧光蛋白基因（GFP）为例，分析了495颗粒是否能够用来制备HEV假病毒（即，495颗粒是否能够在其组装过程中包裹外源基因，形成HEV假病毒）。
简言之，将495蛋白突变体1与GFP质粒按摩尔比1：1混合，于37℃吸附至少2h，然后透析至组装缓冲液中进行组装。组装完成后，利用核酸酶Benzonase Nuclease（购于Merck KgaA公司）将混合体系内残余的GFP质粒去除（作用条件：37ug DNA/1u，37℃，30min）。然后，将经核酸酶处理的混合物用于感染细胞。对照组为单独的495VLP，以及单独的GFP质粒。
使用透射电镜、分子筛层析分析、倒置荧光显微镜等方法验证假病毒制备是否成功。
使用透射电镜观察假病毒形态
使用的仪器为日本电子公司生产的200kV透射电镜，放大倍数为25,000倍。将获得的495颗粒用2%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上进行观察。结果如图13所示。结果显示，假病毒的形态与495颗粒的形态基本一致。
分子筛层析分析假病毒保留时间
采用美国Waters高效液相色谱层析系统以及TSK Gel 5000 PWxl 7.8x300mm柱子进行分子筛层析分析。以2倍柱体积的缓冲液50mM PB6.5+0.5M NaCl预先平衡层析柱，直至280nm处的吸收值无明显变化。将检测器的吸收值归零，然后由自动进样器进样并进行分析。结果如图14所示，图14A、B、C分别为单独的495颗粒、单独的N31-GFP质粒及495颗粒＋N31-GFP质粒的分析结果。结果显示，混合物中的495颗粒能够包裹N31-GFP质粒，形成495假病毒，并且495假病毒 的保留时间为10.8min。
使用倒置荧光显微镜观察假病毒对细胞的感染
将假病毒与细胞孵育后第三天、第七天利用倒置荧光显微镜进行观察（NIKON公司，型号：TE2000-U）。观察结果如图15B（第三天）、图15C（第七天）所示；图15A显示通过PEI方法用N31-GFP质粒利转染HepG2细胞的结果，其用作阳性对照。结果显示，假病毒能够感染HepG2细胞，并在细胞中表达报道基因GFP。
上述结果表明，495颗粒具有感染细胞的能力，并且能够包裹外源基因形成假病毒，用于将外源基因导入目的细胞。使用上述方法对由495蛋白的突变体2-5组装的HEV VLP进行类似的分析，并且获得了类似的结果。
实施例10：495颗粒的免疫原性的研究
如实施例5和6所描述的，p495蛋白能够在体外自组装成VLP。本实施例以由495蛋白突变体1组装的HEV VLP为例，进一步研究了495颗粒的免疫原性。
495颗粒的ED50
采用铝佐剂、单次腹腔注射方式对6周龄BalB/c雌、雄小鼠各3只进行免疫。对照组为239颗粒，免疫剂量为1.6μg、0.4μg、0.1μg、0.025μg。实验组495颗粒另有免疫剂量0.6μg、0.4μg、0.1μg、0.025μg、0.00625μg、0.0015625μg，免疫体积为1mL。第四周时眼眶采血，对血液中的HEV抗体进行检测，并通过Reed-Muench法来计算ED50。结果如表3所示。
表3
表3A.239颗粒在小鼠体内诱导HEV抗体阳转的ED₅₀

表3B.495颗粒在小鼠体内诱导HEV抗体阳转的ED₅₀

结果显示，当用495颗粒免疫小鼠4周时，其ED50为0.068μg，这表明495颗粒具有良好的、甚至优于239颗粒的免疫原性。
用495颗粒蛋白免疫BalB/c小鼠后的血清滴度的考察
采用铝佐剂、皮下注射方式对6周龄BalB/c雌、雄小鼠各3只进行免疫。对照组为239颗粒，免疫剂量为5μg或0.5μg，免疫体积为200μl。零周眼眶采血后初免，然后分别于第2和4周进行加强免疫。每周对小鼠进行采血，分析血清中的抗HEV抗体的滴度。结果如图16A（0.5μg）和图16B（5μg）所示。结果显示，495颗粒具有与239颗粒相似的免疫原性，均能够引发机体产生中和抗体。此外，结果还显示，在低剂量（0.5μg）下，495颗粒甚至具有比239颗粒更高的免疫原性。
使用上述方法对由495蛋白的突变体2-5组装的HEV VLP进行类似的分析，并且获得了类似的结果。
本申请的实施例首次证实，在HEV ORF2的aa244上具有亮氨酸的495蛋白突变体能够可溶性地表达于大肠杆菌培养物的裂解上清中，并且此类突变体能够在体外组装成具有良好免疫原性和免疫反应性的HEV病毒样颗粒。因此，此类突变体可用于高效、低成本制备HEV疫 苗，具有显著的有益技术效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。