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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510557288.7 (22)申请日 2015.09.02 A61K 31/585(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 上海市普陀区中心医院 地址 200062 上海市普陀区兰溪路 164 号 (72)发明人 刘涛 殷佩浩 袁易 彭文 袁夏 贾婷婷 邱艳艳 邹瑜 石晓静 于卉 (74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272 代理人 竺路玲 (54) 发明名称 一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药及 其纳米制剂和制备方法 (57) 摘要 本发明提供了。
2、一种具有内涵体逃逸功能的肿 瘤靶向前药， 其为 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P (DEA-co-BMA) ； 其中， POEGMA 为具有长循环功效 的水溶性高分子， BUF 为具有抗肿瘤活性的化疗 药物蟾毒灵， cRGD 为能够有效主动靶向肿瘤组织 的多肽， P(DEA-co-BMA) 为具有内涵体逃逸功能 的高分子 ； 还提供了制备所述肿瘤靶向前药的方 法， 所述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的 纳米制剂及其制备方法， 该纳米制剂， 可在较低剂 量条件下有效地杀伤癌细胞， 其对多种癌细胞的 杀伤效果明显优于自由蟾毒灵药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共。
3、和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书9页 附图4页 CN 105168230 A 2015.12.23 CN 105168230 A 1/3 页 2 1.一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药， 其为 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DE A-co-BMA)。 2.一种根据权利要求 1 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 包括 以下步骤 ： (1) 制备中间产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) ： 将一定量可逆加成断裂链转移引发剂 BPTPA， 寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯 OEGMA， 含 - 硫代羧基的单体 BSM。
4、A， 含有原子转移自由基引发剂的单体 BEMA， 溶剂和自由基引发剂 加入玻璃管中， 真空冻融三次后封管 ； 之后， 在 20-80条件下反应 0.5-40 小时， 得粗产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)， 最后将该粗产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) 纯化处理得所 述 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) ； (2) 制备中间产物 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) ： 将 一 定 量 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)、 DEA、 BMA、 溶 剂 和 铜 盐 配 体 加 入 玻 璃 管 中， 。
5、真空冻融三次后加入铜盐， 再真空冻融两次， 然后封管 ； 之后， 在 20-80条件下 反 应 0.5-20 小 时， 得 粗 产 物 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) ； 最 后 将 该 粗 产 物 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) 过硅胶柱除去铜盐， 浓缩， 再经纯化处理得所述 P(OE GMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) ； (3) 制备目标产物 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) ： 将一定量 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA)、。
6、 NHS-OH、 BUF、 缩合剂和催化剂溶于有 机溶剂中室温搅拌 3-72 小时 ； 然后， 加入一定量 cRGD 继续反应 1-48 小时， 得粗产物 P(OEG MA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) ； 最后将该粗产物P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DE A-co-BMA) 纯化处理得所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA)。 3.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征在 于， 所述纯化处理为 ： 水中透析， 然后冷冻干燥。 4.根据权利要求 2 所述的具有。
7、内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤 (1) 中的所述 OEGMA 的分子量为 100-50000。 5.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤 (1) 中的所述溶剂选自 DMF、 DMSO、 NMP、 异丙醇、 甲醇、 乙醇、 二氧六环和四氢呋 喃中的一种或多种。 6.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤 (1) 中的所述自由基引发剂选自过氧化环己酮、 过氧化二苯甲酰、 叔丁基过氧 化氢、 偶氮二异丁腈、 偶氮二异庚腈中的一种或多种。 7.根据权利要。
8、求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤 (1) 中的所述引发剂 BPTPA ： OEGMA ： BSMA ： BEMA ： 自由基引发剂的摩尔比为 1 ： 10-200 ： 0.5-200 ： 0.5-200 ： 0.01-1。 8.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤 (2) 中的所述溶剂选自 DMF、 DMSO、 NMP、 异丙醇、 甲醇、 乙醇和四氢呋喃中的一 种或多种。 9.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征在 于， 所述步骤 (2) 中的所。
9、述铜盐配体选自联吡啶、 PMDETA 和 Me6TREN 中的一种或多种。 权 利 要 求 书 CN 105168230 A 2 2/3 页 3 10.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (2) 中的所述铜盐选自溴化亚铜、 氯化亚铜、 溴化铜和氯化铜中的一种或多 种。 11.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (2) 中的所述 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) 中的 BEMA ： DEA ： BMA ： 铜盐 ： 铜盐 配体的摩尔比为 1 ： 10-500 ：。
10、 10-500 ： 0.1-10 ： 0.1-10。 12.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (3) 中的所述缩合剂选自 DCC、 EDC、 DIC 中的一种或多种。 13.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其特征 在于， 所述步骤 (3) 中的所述催化剂选自吡啶、 二甲氨基吡啶、 三乙胺和羟基苯并三氮唑中 的一种或多种。 14.根据权利要求 2 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法， 其 特 征 在 于， 所 述 步 骤 (3) 中 的 所 述 P(OEGMA-co-BSMA)-g-。
11、P(DEA-co-BMA) 中 的 BSMA ： NHS-OH ： BUF ： 缩合剂 ： 催化剂 ： cRGD 的摩尔比为 1 ： 0.01-0.1 ： 0.1-0.99 ： 1-10 ： 0.01-0.5 ： 0.01-0.1。 15.一种根据权利要求 1 所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的纳米制剂， 其 特征在于， 其中的纳米粒子的粒径为102000nm， 包含的所述靶向前药为P(OEGMA-co-BUF -co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA)。 16.根据权利要求 15 所述的纳米制剂， 其特征在于， 所述纳米制剂为纳米粒溶液， 其 中， 所述 P(OEGMA-co-B。
12、UF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) 的浓度为 0.001-30g/L， 所述 P(OEGM A-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) 经过人体内代谢后， 释放的活性药物 BUF 的摩尔浓度 为 0.001-10000mol/L。 17.一种根据权利要求 16 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 选自以下方法 中的一种 ： 复乳法， 薄膜乳化法， 乳化蒸发法， 界面沉淀法， 自组装法。 18.根据权利要求 17 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法为复 乳法， 包括步骤 ： 将所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)。
13、-g-P(DEA-co-BMA) 溶于二氯甲烷或二氯 甲烷和丙酮的混合溶剂中， 超声乳化， 再加入到水分散介质中， 再次超声乳化， 然后室温下 搅拌 0.5-5 小时， 除去有机相， 即得纳米粒溶液。 19.根据权利要求 17 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法为薄 膜乳化法， 包括步骤 ： 将所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) 溶于丙酮中， 旋 转蒸发成膜， 随后加入水溶液， 室温下搅拌 0.5-6 小时， 即得纳米粒溶液。 20.根据权利要求 17 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法为乳 化蒸发法，。
14、 包括步骤 ： 将所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) 溶于丙酮 / 二氯 甲烷的混合溶剂中， 加入到水分散介质中， 进行超声或高压乳匀乳化， 所得乳液在室温下搅 拌 2-4 小时， 挥尽有机溶剂， 即得纳米粒溶液。 21.根据权利要求 17 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法为界 面沉淀法， 包括步骤 ： 将所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) 溶于丙酮中， 在 不断搅拌条件下， 将所得丙酮溶液注入到水分散介质中， 加压挥发去除丙酮， 即得纳米粒溶 液。 权 利 要 求 书 CN。
15、 105168230 A 3 3/3 页 4 22.根据权利要求 17 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法为自 组装法， 包括步骤 ： 将所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) 溶于 DMSO 中， 将 所得溶液滴入一定量搅拌着的水中， 之后将溶液装入透析袋中透析 3-72 小时， 除去有机溶 剂， 即得纳米粒溶液。 23.根据权利要求 18、 20、 21 中任一项所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所 述水分散介质选自右旋糖昔40-70、 pluronic F68或聚乙烯醇(PVA)中的一种或多种， 并且 所述水分散。
16、介质的质量体积百分浓度为 0.01-10。 24.根据权利要求 18 或 20 中所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述超声的 强度为 10-1000W。 25.根据权利要求 22 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述透析袋的截留 分子量的范围为 1000-10000Da。 26.根据权利要求 15 所述的纳米制剂， 其特征在于， 所述纳米制剂为纳米冻干剂， 其 中， 冻干支架剂选自海藻糖、 葡萄糖、 乳糖、 煎糖、 右旋糖苷、 山梨醇、 甘露醇和聚乙二醇中的 一种或多种， 且所述冻干支架剂的质量百分浓度为 0.01-20。 权 利 要 求 书 CN 105168230 。
17、A 4 1/9 页 5 一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药及其纳米制剂和 制备方法 技术领域 0001 本发明涉及肿瘤靶向递送与缓释给药系统技术领域， 尤其涉及一种具有内涵体逃 逸功能的肿瘤靶向前药， 该前药的制备方法， 及该前药的纳米制剂和该纳米制剂的制备方 法。 背景技术 0002 癌症发病率呈逐年上升趋势， 目前已成为威胁人类健康最严重的疾病之一 (Siegel R.L.et al,2015,CA Cancer J Clin,2015,65:5-29)。化学药物治疗作为手术及 放疗之外一种重要的治疗手段在全世界范围内得到广泛应用。但是， 大多数化疗药物 ( 如 阿霉素、 紫杉醇、 喜树。
18、碱等 ) 存在水溶性差、 不可控释放、 生物利用度低和毒副作用大等严 重缺点。而一种新型抗癌药物的研制常具有风险大、 投资大和开周期长等不利因素。因此， 如何针对现有抗癌药物的不足， 设计、 开发新剂型以改进现有剂型的不足逐渐成为生物医 学领域研究的重要前沿和热点之一。基于聚合物胶束的纳米药物制备方法多样、 化学修饰 简单， 在抗癌药的新剂型开发、 应用方面展现出日益强大的技术优势。 0003 现有纳米药物通常采用物理包埋、 吸附或共价改性的方式将抗肿瘤药物制备 成纳米药物， 并在其表面进一步化学修饰肿瘤靶向分子以促进其在肿瘤组织附近富集 进而达到提高疗效的目的。一系列基于胶束纳米粒子、 脂质。
19、体、 无机纳米粒子 ( 金纳米 粒子、 量子点、 石墨烯、 碳纳米管等 ) 以及有机 / 无机杂化纳米粒子的纳米药物被开发 出 来 ( 如 Langer et al.,Nat Nanotechnol.,2007,2(12):751-60 ； Chen et al.,Adv. Mater.2014,65(1):104-120)。值得指出的是绝大多数纳米药物以细胞内吞的方式进入细 胞并在内涵体 / 溶酶体内释放药物。遗憾的是， 药物需要从内涵体 / 溶酶体中逃逸出来才 能发挥抗肿瘤作用 ； 而现有纳米药物体系通常并不具备良好的内涵体逃逸能力， 这常常导 致进入细胞的药物在溶酶体中被降解掉， 不能充。
20、分发挥其药效。 0004 为了更有效地将药物运输到细胞质中发挥作用， 研究人员采用病毒、 蛋白质、 多 肽、 小分子化合物、 光敏剂以及合成高分子等多种方式来打破内涵体 / 溶酶体的膜屏障。其 中， 合成高分子由于其精确的可设计性、 可规模化制备以及良好的内涵体逃逸能力受到广 泛关注。 近期， Stayton等将嵌段共聚物聚(N,N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)-b-(N,N-二 乙基氨乙基甲基丙烯酸酯 -co- 甲基丙烯酸正丁酯 )， 即 PDMAEMA-b-P(DEA-co-BMA) 用于 基因传输 (Biomaterials,2012,33,2301-2309)。实验结果表明， P(DEA。
21、-co-BMA) 嵌段在 BMA 含量为 30-40时表现出强的内涵体逃逸能力。可能的原因是 P(DEA-co-BMA) 嵌段 在内涵体 / 溶酶体的酸性环境 (pH 5) 中 DEA 由去质子化转变为质子化， 导致这种 pH 敏感胶束的解离， 进而促使 BMA 基元的丁基与膜的磷酯双分子层相互作用破坏了内涵体 的膜。最终使得纳米粒子从内涵体 / 溶酶体中逃逸出来。Liu 等进而合成了具有内涵体 逃逸功能的嵌段共聚物， 聚 (N,N- 二甲基丙烯酰胺 )-b-(N,N- 二乙基氨乙基甲基丙烯酸 酯 -co- 甲基丙烯酸正丁酯 )， 即 PDMA-b-P(DEA-co-BMA)， 并在其两个嵌段。
22、上分别标记上 pH 说 明 书 CN 105168230 A 5 2/9 页 6 敏感的荧光染料和 pH 不敏感的内标分子。所得新型聚合物基 pH 荧光探针具有良好的内 涵体逃逸功能并可灵敏地实时监测细胞质中 pH 变化过程 (Liu et al.,Biomacromolecul es,2014,15(11):4293-301)。 0005 缬氨酸 - 精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸 - 谷氨酸环肽， 简称 cRGD， 是一种有效的 靶向肽， 众多实验已经证实其对肿瘤血管具有很好的靶向效果 (James et al.,Adv Drug Deliver Rev,2008,60:1615-162。
23、6)。倘能将 cRGD 与响应性药物纳米粒相结合， 构建对肿瘤 组织具有良好特异性靶向功能的纳米药物， 发明人相信其将会对改善药物疗效有一定的促 进作用。 发明内容 0006 针对现有技术中存在的种种不足， 申请人旨在提供一种具有内涵体逃逸功能的肿 瘤靶向药物。 0007 在本发明中， 发明人通过可控聚合手段得到含有 P(DEA-co-BMA) 和聚寡聚乙二醇 甲基丙烯酸酯 (POEGMA) 聚合物链、 具有内涵体逃逸功能的刷形共聚物， 并采用酯酶响应性 - 硫代酯键将抗肿瘤药物蟾毒灵 (BUF) 共价连接到该聚合物上， 采用稳定的酰胺键将对 肿瘤新生血管具有特异性靶向功能的 cRGD 连接到。
24、该聚合物上， 最后制备成具有内涵体逃 逸功能的肿瘤靶向前药及其纳米制剂。其中， 由于 POEGMA 的长链能使纳米载体有效的逃逸 网状内皮系统的吞噬， 从而达到长循环的目的。由于 - 硫代键在酯酶作用下可以迅速水 解释放 BUF 原药， 使其发挥药效， 可以有效避免普通化学键改性药物造成的药物活性大幅 度下降的问题。在高分子链上共价连接靶向肽 cRGD 促进其在肿瘤组织部位富集以提高药 物的生物利用度。同时， P(DEA-co-BMA) 的引入， 可以使得进入细胞内内涵体 / 溶酶体的纳 米药物及时从中逃逸出来进入细胞质发挥药效， 可有效避免内涵体 / 溶酶体内强酸和强降 解能力的酶对药物分子。
25、的降解， 提高药物利用率。 0008 因此， 第一方面， 本发明提供了一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药， 其为 P( OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA)。其中， POEGMA 为具有长循环功效的水溶性高分 子， BUF 为具有抗肿瘤活性的化疗药物蟾毒灵， cRGD 为能够有效主动靶向肿瘤组织的多肽， P(DEA-co-BMA) 为具有内涵体逃逸功能的高分子。 0009 为了制备上述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA)， 本发明所要解决的另 一个技术问题在于如何有效的将内涵体逃逸功能的 P(DEA-co-BMA)。
26、、 靶向肽 cRGD 和抗肿瘤 药物BUF整合到同一聚合物上， 使之既能克服BUF水溶性差， 生物利用度低问题又能够有效 避免传统物理包埋的方法 CPT 在体内运输过程中的早释问题。同时， 又能有效促使进入细 胞内的纳米药物从内涵体 / 溶酶体中逃逸出来避免被降解， 并真正发挥作用， 从而最大限 度地发挥药物疗效。 0010 第二方面， 本发明提供了一种上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方 法， 包括以下步骤 ： 0011 (1) 制备中间产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) ： 0012 将一定量可逆加成断裂链转移引发剂BPTPA， 寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯OE GM。
27、A， 含 - 硫代羧基的单体 BSMA， 含有原子转移自由基引发剂的单体 BEMA， 溶剂和自由基引发剂 加入玻璃管中， 真空冻融三次后封管 ； 之后， 在 20-80条件下反应 0.5-40 小时， 得粗产物 说 明 书 CN 105168230 A 6 3/9 页 7 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)， 最后将该粗产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) 纯化处理得所 述 P(OEGMA-co-BSMA-co-B EMA)。 0013 (2) 制备中间产物 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) ： 0014 将一定量 P(OEGMA。
28、-co-BSMA-co-BEMA)、 DEA、 BMA、 溶剂和铜盐配体加入玻璃 管中， 真空冻融三次后加入铜盐， 再真空冻融两次， 然后封管 ； 之后， 在 20-80条件下 反 应 0.5-20 小 时， 得 粗 产 物 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) ； 最 后 将 该 粗 产 物 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) 过硅胶柱除去铜盐， 浓缩， 再经纯化处理得所述 P(OE GMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA)。 0015 (3) 制备目标产物 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA。
29、-co-BMA) ： 0016 将一定量 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA)、 NHS-OH、 BUF、 缩合剂和催化剂溶 于有机溶剂中室温搅拌3-72小时 ； 然后， 加入一定量cRGD继续反应1-48小时， 得粗产物P( OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) ； 最后将该粗产物P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P (DEA-co-BMA) 纯化处理得所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA)。 0017 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述。
30、纯化处理 为 ： 水中透析， 然后冷冻干燥。 0018 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (1) 中的所述 OEGMA 的分子量为 100-50000。 0019 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (1) 中的所述溶剂选自 DMF、 DMSO、 NMP、 异丙醇、 甲醇、 乙醇、 二氧六环和四氢呋喃中的一种或多 种。 0020 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (1) 中的所述自由基引发剂选自过氧化环己酮、 过氧化二苯甲酰、 叔丁基过氧化氢、 偶氮二异丁 腈、 偶氮二异庚腈中的一种。
31、或多种。 0021 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (1) 中的所述引发剂 BPTPA ： OEGMA ： BSMA ： BEMA ： 自由基引发剂的摩尔比为 1 ： 10-200 ： 0.5-200 ： 0.5-200 ： 0.01-1。 0022 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (2) 中的所述溶剂选自 DMF、 DMSO、 NMP、 异丙醇、 甲醇、 乙醇和四氢呋喃中的一种或多种。 0023 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (2) 中的所述铜盐配体选自联吡啶、 PMDE。
32、TA 和 Me6TREN 中的一种或多种。 0024 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (2) 中的所述铜盐选自溴化亚铜、 氯化亚铜、 溴化铜和氯化铜中的一种或多种。 0025 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (2) 中的所述 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) 中的 BEMA ： DEA ： BMA ： 铜盐 ： 铜盐配体的摩尔比为 1 ： 10-500 ： 10-500 ： 0.1-10 ： 0.1-10。 0026 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (3) 中。
33、的所述缩合剂选自 DCC、 EDC、 DIC 中的一种或多种。 0027 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (3) 中的所述催化剂选自吡啶、 二甲氨基吡啶、 三乙胺和羟基苯并三氮唑中的一种或多种。 说 明 书 CN 105168230 A 7 4/9 页 8 0028 优选地， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (3) 中的所述 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) 中的 BSMA ： NHS-OH ： BUF ： 缩合剂 ： 催化剂 ： cRGD 的摩尔比为 1 ： 0.01-0.1 ： 0.1-0。
34、.99 ： 1-10 ： 0.01-0.5 ： 0.01-0.1。 0029 第三方面， 本发明提供了一种上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的纳米 制剂， 其特征在于， 其中的纳米粒子的粒径为 10 2000nm， 包含的所述靶向前药为 P(OEG MA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA)。其中， 以 P(OEGMA-co-RGD) 为亲水壳层， 以 BUF 和 P(DEA-co-BMA) 为疏水核。 0030 本发明所述的纳米制剂可在机械搅拌、 超声、 高压均质机作用下制得， 其粒径在 10 2000nm， 表面光滑、 均匀度好、 颗粒规则无粘连、 再分散性好、 。
35、载药率和包封率高 ； 其可 用于制备静脉或肌肉注射或口服给药的缓释纳米粒， 作为肿瘤靶向给药。制备的纳米制剂 可以分散在固体、 半固体或溶液中。 优选的是制成注射给药的药物制剂形式， 尤其是供静脉 注射用。 0031 优 选 地， 所 述 纳 米 制 剂 为 纳 米 粒 溶 液， 其 中， 所 述 P(OEGMA-co-BUF-co-R GD)-g-P(DEA-co-BMA) 的浓度为 0.001-30g/L， 所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co -BMA) 经过人体内代谢后， 释放的活性药物 BUF 的摩尔浓度为 0.001-10000mol/L。 00。
36、32 第四方面， 本发明提供了一种上述纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 选自以下 方法中的一种 ： 复乳法， 薄膜乳化法， 乳化蒸发法， 界面沉淀法， 自组装法。 其中， 所用到的有 机溶剂包括乙酸乙酯、 二氯甲烷、 三氯甲烷、 丙酮、 乙醇和二甲亚砜等各种适合于制备纳米 粒溶液的有机溶剂。 0033 优选地， 所述制备方法为复乳法， 包括步骤 ： 取 4mg P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g- P(DEA-co-BMA) 溶于 200L 二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂中， 超声乳化 (10s x 4)， 再加入 2.2mL 浓度为 1的 pluronic F68 水分。
37、散介质中， 再次超声乳化 (10s x 4)。然 后室温下搅拌 0.5-5h 除去有机相， 即得纳米粒溶液。 0034 优选地， 所述制备方法为薄膜乳化法， 包括步骤 ： 取 4mg P(OEGMA-co-BUF-co-RGD )-g-P(DEA-co-BMA) 溶于 400L 丙酮溶剂中， 旋转蒸发成膜， 随后加入 4mL 的水溶液， 室温 下搅拌 0.5-6h， 即得纳米粒溶液。 0035 优选地， 所述制备方法为乳化蒸发法， 包括步骤 ： 取4mg P(OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P(DEA-co-BMA) 溶于 400L 丙酮 / 二氯甲烷的混合溶剂中， 加入到 2。
38、.2mL 浓度为 2的 含聚乙烯醇 (PVA) 的水分散介质中， 超声或高压乳匀乳化， 乳液在室温下搅拌 2-4h， 挥尽有 机溶剂， 即得纳米粒溶液。 0036 优选地， 所述制备方法为界面沉淀法， 包括步骤 ： 取4mg P(OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P(DEA-co-BMA) 溶于 400L 丙酮溶剂中， 在不断的搅拌条件下， 将上述溶液注入 2.2mL 的浓度为 2的 PVA 水分散介质中， 加压挥发去除丙酮， 即得纳米粒溶液。 0037 优选地， 所述制备方法为自组装法， 包括步骤 ： 取 4mg P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)- g-P(DEA-。
39、co-BMA) 溶于 200L DMSO 中， 将溶液滴入 2mL 搅拌着的水中， 之后将溶液装入透 析袋中透析 3-72 小时， 除去有机溶剂， 即得纳米粒溶液。 0038 进一步优选地， 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述水分散介质选自 右旋糖昔40-70、 pluronic F68或聚乙烯醇PVA中的一种或多种， 并且所述水分散介质的质 量体积百分浓度为 0.01-10。 说 明 书 CN 105168230 A 8 5/9 页 9 0039 进一步优选地， 所述的纳米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述超声的强度为 10-1000W。 0040 进一步优选地， 所述的纳。
40、米粒溶液的制备方法， 其特征在于， 所述透析袋的截留分 子量的范围为 1000-10000Da。 0041 优选地， 所述纳米制剂为纳米冻干剂， 其中， 冻干支架剂选自海藻糖、 葡萄糖、 乳 糖、 煎糖、 右旋糖苷、 山梨醇、 甘露醇和聚乙二醇中的一种或多种， 且所述冻干支架剂的质量 百分浓度为 0.01-20。 0042 本发明所述的各种制备方法简便， 适于大规模生产， 特别适用于制备具有长循环、 可生物降解、 缓释、 被动靶向、 主动靶向、 运送活性物质、 抗肿瘤的药物， 尤其是制备抗肠癌 的药物。 采用本发明的方法获得的抗肿瘤的前药及其纳米制剂适合于静脉注射、 肌肉注射、 皮下注射、 皮。
41、内注射、 口服或经皮给药等方式。 0043 本发明所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药纳米制剂， 可在较低剂量条件 下有效地杀伤癌细胞， 其对多种癌细胞的杀伤效果明显优于自由蟾毒灵药物。 0044 本发明所述的制备方法简便， 适于大规模生产， 特别适应于制备具有长循环、 可生 物降解、 缓释、 被动靶向、 主动靶向、 运送活性物质、 抗肿瘤的药物， 尤其是制备抗肠癌的药 物。采用本发明的方法获得的抗肿瘤的药物适合于静脉注射、 肌肉注射、 皮下注射、 皮内注 射、 口服或经皮给药等方式。 附图说明 0045 图 1 为本发明所述的肿瘤靶向前药 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-。
42、P(DEA-co-BM A) 的一个优选实施例的合成路线图 ； 0046 图 2 为本发明所述的一个优选实施例中的 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BM A) 在 CDCl3中的 1H NMR 图谱 ； 0047 图 3 为本发明所述的一个优选实施例中的 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co -BMA) 在 CDCl3中的 1H NMR 图谱 ； 0048 图 4 为本发明所述的一个优选实施例中的 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co -BMA) 的纳米粒子的粒径分布图 ； 0049 图 5 为本发明所述的一个。
43、优选实施例中的 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co -BMA) 的纳米粒子对 LoVo 细胞株作用 48 小时后的细胞存活率图。 具体实施方式 0050 下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述， 但本发明并不限于以下实施方 式。 0051 第一方面， 本发明提供了一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药， 其为 P(OEGM A-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA)。其中， POEGMA 为具有长循环功效的水溶性高分子， BUF 为具有抗肿瘤活性的化疗药物蟾毒灵， cRGD 为能够有效主动靶向肿瘤组织的多肽， P(DEA-co-BMA) 为。
44、具有内涵体逃逸功能的高分子。 0052 第二方面， 本发明提供了一种上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方 法， 其合成路线见附图 1， 具体包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 105168230 A 9 6/9 页 10 0053 (1) 制备中间产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) ： 0054 将一定量可逆加成断裂链转移引发剂BPTPA， 寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯OE GMA， 含 - 硫代羧基的单体 BSMA， 含有原子转移自由基引发剂的单体 BEMA， 溶剂和自由基引发剂 加入玻璃管中， 真空冻融三次后封管 ； 之后， 在 20-80条件下反应 0.5-40 小。
45、时， 得粗产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)， 最后将该粗产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA) 纯化处理得所 述 P(OEGMA-co-BSMA-co-B EMA)。 0055 (2) 制备中间产物 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) ： 0056 将一定量 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)、 DEA、 BMA、 溶剂和铜盐配体加入玻璃 管中， 真空冻融三次后加入铜盐， 再真空冻融两次， 然后封管 ； 之后， 在 20-80条件下 反 应 0.5-20 小 时， 得 粗 产 物 P(OEGMA-co-BSMA)。
46、-g-P(DEA-co-BMA) ； 最 后 将 该 粗 产 物 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA) 过硅胶柱除去铜盐， 浓缩， 再经纯化处理得所述 P(OE GMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA)。 (3)制备目标产物P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co -BMA) ： 0057 将一定量 P(OEGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA)、 NHS-OH、 BUF、 缩合剂和催化剂溶 于有机溶剂中室温搅拌3-72小时 ； 然后， 加入一定量cRGD继续反应1-48小时， 得粗产物P( OEGMA-c。
47、o-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA) ； 最后将该粗产物P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P (DEA-co-BMA) 纯化处理得所述 P(OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P(DEA-co-BMA)。 0058 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述纯化处理为 ： 水中透析， 然后冷冻干燥。 0059 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (1) 中的所述 OEGMA 的分子量为 100-50000。 0060 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的。
48、肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (1) 中的所述溶剂选自 DMF、 DMSO、 NMP、 异丙醇、 甲醇、 乙醇、 二氧六环和四氢呋喃 中的一种或多种。 0061 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (1) 中的所述自由基引发剂选自过氧化环己酮、 过氧化二苯甲酰、 叔丁基过氧化 氢、 偶氮二异丁腈、 偶氮二异庚腈中的一种或多种。 0062 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (1) 中的所述引发剂 BPTPA ： OEGMA ： BSMA ： BEMA ： 自由基引发剂的摩尔比为 1 ： 10。
49、-200 ： 0.5-200 ： 0.5-200 ： 0.01-1。 0063 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (2) 中的所述溶剂选自 DMF、 DMSO、 NMP、 异丙醇、 甲醇、 乙醇和四氢呋喃中的一种或 多种。 0064 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (2) 中的所述铜盐配体选自联吡啶、 PMDETA 和 Me6TREN 中的一种或多种。 0065 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤 (2) 中的所述铜盐选自溴化亚铜、 氯化亚铜、 溴化铜和氯化铜中的一种或多种。 0066 在一个优选实施例中， 上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中， 所述步骤(2)中的所述P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)中的BEMA ： DEA ： BMA ： 铜盐 ： 铜盐配体的 说 明。