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1、10申请公布号CN104178436A43申请公布日20141203CN104178436A21申请号201310188035822申请日20130520C12N1/20200601C12N15/09200601C12N15/63200601C12R1/225200601C12R1/23200601C12R1/24200601C12R1/245200601C12R1/2520060171申请人刘志华地址510655广东省广州市天河区员村新街19号72发明人刘志华秦环龙汪建平74专利代理机构上海精晟知识产权代理有限公司31253代理人冯子玲54发明名称一种低粘附活性的益生菌及其制备方法57摘要本。
2、发明提供了一种低粘附活性的益生菌，为MIMP基因缺失的乳酸杆菌，用含有拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列的重组载体转染乳酸杆菌，得到所述益生菌。本发明提供的益生菌中MIMP基因缺失，具有低粘附活性，有效验证了乳酸杆菌表面蛋白的活性片段MIMP对肠上皮细胞有粘附功能，对保护肠道粘膜的完整性具有重要意义。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图2页10申请公布号CN104178436ACN104178436A1/1页21一种低粘附活性的益生菌，其特征在于，所述益生菌为。
3、MIMP基因缺失的乳酸杆菌。2根据权利要求1所述的益生菌，其特征在于，用含有拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列的重组载体转染乳酸杆菌，得到所述益生菌。3根据权利要求2所述的益生菌，其特征在于，所述MIMP基因上下游序列包含至少30个碱基对的MIMP基因上游序列和至少30个碱基对的MIMP基因下游序列。4根据权利要求1所述的益生菌，其特征在于，所述乳酸杆菌选自保加利亚乳杆菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌。5一种制备权利要求14中任意一项所述益生菌的方法，其特征在于，用含有拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框。
4、不发生变化的MIMP基因上下游序列的重组载体转染乳酸杆菌，从而得到MIMP基因缺失的乳酸杆菌。6根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，通过PCR方式获得拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列，该MIMP基因上下游序列中的MIMP基因上游序列和MIMP基因下游序列分别加载有酶切位点；步骤2，通过双酶切将步骤1获得的拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列插入到表达质粒中，获得乳酸杆菌MIMP基因敲除载体；步骤3，用步骤2获得的乳酸杆菌MIMP基因敲除载体转染感受态的乳酸杆菌，从而得到MI。
5、MP基因缺失的乳酸杆菌。7根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述MIMP基因上下游序列中的MIMP基因上游序列和MIMP基因下游序列分别加载有BGL酶切位点和XHO酶切位点。8根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达质粒为PET32质粒。9一种权利要求1所述益生菌在验证乳酸杆菌表面蛋白的活性片段MIMP功能中的应用。10一种乳酸杆菌MIMP基因敲除载体，其特征在于，包含PET32质粒序列和拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列。权利要求书CN104178436A1/3页3一种低粘附活性的益生菌及其制备方法技术领域0001本发明属于微生物基。
6、因工程领域，具体涉及一种MIMP基因缺失的低粘附活性的益生菌。背景技术0002目前益生菌的临床应用广泛。益生菌在肠道内的粘附和定植能抑制致病菌的损伤，对于保护肠道黏膜的完整性具有重要意义。研究表明，益生菌包括乳酸杆菌对肠道炎症性相关疾病，如炎症性肠病、肠易激综合征、抗生素相关性腹泻、新生儿坏死性小肠结肠炎、和胆道感染等，具均具有重要的防治作用。0003乳酸杆菌是益生菌中及其重要的一种，可以与靶细胞黏附，竞争抑制致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）和侵袭性大肠杆菌（EIEC）等致病菌对人体肠道屏障功能的损害；激发继发于黏附的细胞内信号转导途径，降低肠上皮细胞（IEC）的通透性；。
7、调节人体肠道黏膜免疫功能，促进树突状细胞（DC）分化成熟，以及诱导肠道T细胞分化成熟等。益生菌在肠道内的黏附和定植能抑制致病菌的损伤，对于保护肠道黏膜的完整性具有重要意义。0004近几年来研究表明，乳酸杆菌表面蛋白（SURFACELAYERPROTEIN,SLP）在其发挥益生作用时起着核心作用。我们的前期研究表明，I58（IMP501580）对于肠屏障功能保护具有重要的作用（专利一种具有肠上皮细胞保护功能的蛋白序列及其应用；专利号2012102819687），且具有分子小，效价高等优点。此外，乳酸杆菌表面蛋白的活性片段MIMP（IMP455755）具有肠屏障保护作用，并进行了相应的休内和体外实。
8、验验证。为了进一步验证乳酸杆菌表面蛋白的活性片段（MICROINTEGRALMEMBRANEPROTEIN,MIMP）对肠的肠屏障保护作用，我们需要进一步建立了一种MIMP基因缺失的乳酸杆菌。发明内容0005本发明所要解决的技术问题是提供一种MIMP基因缺失的乳酸杆菌。0006本发明提供了一种低粘附活性的益生菌，所述益生菌为MIMP基因缺失的乳酸杆菌。0007优选地，用含有拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列的重组载体转染乳酸杆菌，得到所述益生菌。0008优选地，所述MIMP基因上下游序列包含至少30个碱基对的MIMP基因上游序列和至少30个碱基。
9、对的MIMP基因下游序列。0009优选地，所述乳酸杆菌选自保加利亚乳杆菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌。0010本发明还提供了一种制备上述益生菌的方法，用含有拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列的重组载体转染乳酸杆菌，从而得到MIMP基因缺失的乳酸杆菌。说明书CN104178436A2/3页40011优选地，所述方法包括以下步骤0012步骤1，通过PCR方式获得拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列，该MIMP基因上下游序列中的MIMP基因上游序列和MIMP基因下游序列分别加。
10、载有酶切位点；0013步骤2，通过双酶切将步骤1获得的拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列插入到表达质粒中，获得乳酸杆菌MIMP基因敲除载体；0014步骤3，用步骤2获得的乳酸杆菌MIMP基因敲除载体转染感受态的乳酸杆菌，从而得到MIMP基因缺失的乳酸杆菌。0015优选地，所述MIMP基因上下游序列中的MIMP基因上游序列和MIMP基因下游序列分别加载有BGL酶切位点和XHO酶切位点。0016优选地，所述表达质粒为含有BGL酶切位点和XHO酶切位点的质粒。0017优选地，所述表达质粒为PET32质粒。0018优选地，所述MIMP基因上下游序列包含。
11、至少30个碱基对的MIMP基因上游序列和至少30个碱基对的MIMP基因下游序列。0019本发明还提供了一种权利要求1所述益生菌在验证乳酸杆菌表面蛋白的活性片段MIMP功能中的应用。0020本发明还提供了一种乳酸杆菌MIMP基因敲除载体，包含PET32质粒序列和拼接在一起的中间去掉MIMP基因序列同时保证阅读框不发生变化的MIMP基因上下游序列。0021本发明提供的益生菌中MIMP基因缺失，具有低粘附活性，有效验证了乳酸杆菌表面蛋白的活性片段MIMP对肠上皮细胞有粘附功能，对保护肠道粘膜的完整性具有重要意义。附图说明0022图1为粘附活性检测结果；0023图2为WESTERNBLOT检测结果；0。
12、024图3为LPKM对NCM460细胞的粘附率检测结果；0025图4为EPEC粘附率检测结果。具体实施方式0026下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。00271、乳酸杆菌MIMP基因敲除载体的建立0028通过PET32载体（包含DEL1_BGLII和DEL2_XHOI两个酶切位点）建立乳酸杆菌MIMP基因敲除载体（LIUZ,SHENT,MOYERMP,QINHIDENTIFICATIONOFTHELACTOBACILLUSSLPDOMAINTHATBINDSGASTRICMUCINFRONTBIOSCI201217212843），具体如下0029采用交叠P。
13、CR方式获得拼接在一起的MIMP基因上下游序列（包含30个碱基对的MIMP基因上游序列和30个碱基对的MIMP基因下游序列，且MIMP基因上下游序列中的MIMP基因上游序列和MIMP基因下游序列分别加载有BGL酶切位点和XHO酶切位点）。程序说明书CN104178436A3/3页537，34H，酶切完后65灭活10MIN；加5L3M醋酸钠和冷却的无水乙醇120L，20放置15MIN；然后12000RPM离心10MIN，取上清，再用70乙醇洗2次，室温晾干，加30L去离子水溶解。0030拼接在一起的MIMP基因上下游序列和PET32载体经琼脂糖凝胶电泳定量后，以101的比例进行连接，通过双酶切将。
14、拼接在一起的MIMP基因上下游序列插入到PET32载体中。程序16过夜；连接产物65灭火10MIN。00312、MIMP基因缺失的植物乳酸杆菌（MIMPKNOCKOUTLP,LPKM）的建立0032取10L的连接产物转染感受态的植物乳酸杆菌（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCCNO1258），冰上孵育30MIN，42热激1MIN，加无抗的LB培养基400L，200RPM，37孵育1H。然后取100L涂覆在氨苄青霉素（AMPICILLIN,AMP）抗性的平板上，37培养16H，筛选得到MIMP基因缺失的植物乳酸杆菌（LPKM）。0033我们对LPKM进行了MIMP表达水平的验证。
15、以及粘附率的验证。通过PCR扩增验证了LPKM基因组中缺失了183BP的一段序列，如图1所示，其中LP为正常表达MIMP的植物乳酸杆菌；通过WESTERNBLOT验证了LPKM表达MIMP缺失，如图2所示；粘附率检测结果表明LPKM对NCM460细胞的粘附率明显下降，如图3所示；而LPKM对于降低EPEC粘附率的效果也较差，如图4所示（，P005，VS对照组，P005，VS），图3和图4检测结果显示本发明提供的益生菌具有低粘附活性，说明了乳酸杆菌表面蛋白的活性片段MIMP对肠上皮细胞有粘附功能，从而竞争抑制致病菌的粘附，降低致病菌对人体肠道屏障功能的损害。0034以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。说明书CN104178436A1/2页6图1图2图3说明书附图CN104178436A2/2页7图4说明书附图CN104178436A。