一种植物细胞抗衰老剂(PG) 本发明属于植物组织和细胞培养技术领域具体涉及植物细胞和组织培养用的培养基及DNA提取液的制备。其国际专利分类号为C12N5/00。
衰老(Senescence)是生物的一个自然过程，但有些情况下的衰老是由环境条件恶化而引起的，当环境得到改善时，衰老即可延缓。衰老的生理过程与体内的激素变化密切相关。其中最引人注目的是乙烯的变化。Yang等提出乙烯在植物体中的合成途径是蛋氨酸(Met)→S-腺苷蛋氨酸(SAM)→1-氨基环丙烷基羧酸(ACC)→乙烯[14]。(见：Yang，S.F.1985，Hortsci.，14：59-60)，许多抗衰老剂和保鲜剂均依照Yang的理论在配方中加入乙烯拮抗剂和抑制剂。例如Ag(S2O3)2，AVG(氨基乙氧基乙烯基甘氨酸)、AOA(氨基氧乙酸)(Wang，C.Y.et al.，1977，J.Am.Soci.Hort.Sci.，10：517-520.)等。但AVG生产成本较高而不能用于商业，AOA也未能大量应用于实际中。Baker发现乙烯的合成和自由基的存在有关(见：Baker，J.E.et al.，1978，Plant Physicl.，61：886-888)，所以又有些研究者用一些自由基清除剂来抗衰老，如苯甲酸(见1978，Plant Physicl，61：886-888)和醅酸正丙酯(见：Wang，C.Y.et al.，1977，J.Am.Soei.Hort.Sci.，10：517-520)。悬浮培养的细胞的衰老-则是由于细胞间相互营养竞争引起，更重要的是细胞生长条件的恶化。如环境中由于代谢而产生的有害物质，特别是氧化物质，所以研究者常把抗氧化剂如抗坏血酸、硫代硫酸钠等添加到培养基中。硫代硫酸钠的抗氧化效果不好，抗坏血酸虽有较好的抗氧化效果，但其本身的化学性质极不稳定。通常人们认为悬浮系的褐化是有害物质累积的结果，故采用一些吸附物质，如活性炭，来改善细胞的褐化。但其易吸附培养基中的有效成份而改变培养基的性质。本发明者认为，pH值的变化会对细胞的生长产生广泛而深远的影响，优化培养液地pH值是抗衰老最有效而简便的途径。悬浮培养中，细胞选择性地吸收NH4+、K+等阳离子，会使培养液酸化，蔗糖的分解也是一个因素，再加之细胞本身向外分泌一些酸性物质，从而加快了酸化速度。由于酸化可能影响到一些营养的吸收及体内的代谢活动，进而影响生长。当NO3-被吸收时，培养液的pH值会升高，当pH值升高到一定程度(＞6.2)时，会影响细胞对铁的吸收，由于缺铁，生长即告停止。生物体内的许多生化反应是要求在一定的pH值下进行的，所以pH值的变化会影响到代谢。在原生质体培养中Davey(1983)观察到pH值除了直接影响原生质体及再生细胞的生理活动外，还能影响外源激素对培养物的毒害性。pH值在5.6或6.0时，2，4-D浓度超过1mg/L时就能对低浓度培养物产生毒害。pH值的变化还可影响到氧化还原电位。(见In Protoplast 1983，LectureProceeding Birkhuser Venlage，Basel.pp.19-29)。植物本身对pH值的缓冲能力是非常有限的，所以人们为了稳定pH值，在培养液中添加Ca(H2PO4)2、CaCO3、MES等(见中科院上海植生所，1978，植物组织和细胞培养，上海科学技术出版社p195)。但钙盐稳定pH值的效果不是很好，MES虽有较好的pH值稳定效果，但其价格昂贵且依赖进口，大规模使用是不现实的，所以寻求较为理想的pH值缓冲物质是非常有意义的。d′Utra-Vaz(1992)在原生质体培养时对培养物加以无菌的分子氧流从而促进了原生质体的植板和克隆的形成，悬浮培养时，环境的供氧状态对细胞生长至关重要。(见：1992，Plant Cell Report，11(8)：416-418)。一般培养条件下的供氧是不足的。如果人为过于增加环境的氧分压并降低CO2的浓度就可能刺激乙烯的产生，因为CO2是乙烯的抑制物质。(见Uota，M.，1969，J.Amer.Soc.Hort.Sci.，94：598-601)。所以除氢保氧是良好的解决途径。棉花、花生等含酚类物质的作物依一般方法提取的DNA有发红现象，这影响到以后的酶切。Andrew曾用DIECA来解决这一问题(1993.PlantMdecular Bidogy Reporter，11(2)：122-127)。DIECA价格昂贵，国内应用依赖进口。
本发明的目的在于克服已有技术之不足，制造一种适合离体培养(in vitro)条件下植物细胞抗衰老剂，用于改善植物细胞和组织培养中愈伤组织及细胞悬浮培养中的抗衰老以及DNA的提取中的抗氧化方面。
本发明是这样实现的：
一种用于离体培养条件下的植物细胞抗衰老剂组合物(以重量计)，含有10.000-500.000g/L的肌醇六磷酸酯(PA)0.200-20.000g/L的二氧化锗(GeO2)，和/或MES(Morpholinoethanesulfonic acid)0.500-25.000g/L
发明人认为该细胞抗衰老剂也可以按下列比例配制(以重量计)，其中PA为30.000～350.000g/L；GeO2为1.00010.000g/LMES为1.000～20.000g/L。其最佳添加量为：PA为80.000～110.0008/L；GeO2为1.500～5.000g/L；MES为3.000～10.000g/L。
使用时是先将上述PA、GeO2和/或MES按一定重量比例配成母液(本发明称此抗衰老剂为PG，下同)，再按植物组织和细胞培养中培养基的制备规程添加到各自的培养基中去。
本发明的构思依据是，本发明的细胞抗衰老剂PG含有下列三种化合物或天然产物，即PA(肌醇六磷酸酯)，二氧化锗(GeO2)和MES(Marpholinoethane Sulfonic acid)，PA为天然产物，系直接从谷物中提取。PA分子结构中具有众多的羟基，所以具有很强的抗氧化和稳定pH值的作用，PA在广泛的pH值范围内对金属离子起络合作用，对多酚氧化酶的中心金属元素铜起到强的络合作用。PA与锗能形成具有多种生物活性的络合物-有机锗。锗和氢的作用能力很强，能优先和细胞代谢过程中出现的氢结合从而起到保氧作用。锗还能清除自由基起到抗衰老作用。由于PA对锗的结合，使其可能的毒害性不会对细胞产生不利的影响。配方中一定量的MES用于加强PA对pH值的稳定作用。
本发明的植物细胞抗衰老剂(PG)在植物组织与细胞培养和DNA提取中有着广泛的应用前景。其突出效果是：
1.促进愈伤组织的生长：组织培养中有些基因型愈伤组织生长缓慢，细胞团过于致密，添加PG可促进细胞快速分裂，促进愈伤的生长。
2.改良愈伤的状态：劣变的愈伤组织常表现为褐化或水渍化，加入PG后可抑制褐化，消除水渍化，达到松脆的目的。
3.建立和保持良好的细胞悬浮系：添加PG于培养基中可促进细胞的分裂松散，防止褐化和发粘，长期继代可保持其分化能力。
4.解决某些物种DNA提取中DNA发红问题，并提高DNA的产率。
实施例1.(按重量计，下同)
PG配方1
PA 400.000g/l
GeO2 8.000g/l
MES 25.000g/l
PG配方2
PA 30.000g/l
GeO2 0.200g/l
MES 5.000g/l
PG配方3
PA 100.000g/l
GeO2 2.000g/l
MES 15.000g/l
PG配方4
PA 150.000g/l
GeO2 3.000g/l
以上配方的各组分的用量是按100倍母液的量配制的，应用时可根据不同作物及对象稀释后再添加到各培养基(液)中去。
实施例2
将PG的浓度设置为0.01％，0.01％，0.1％，0.15％，0.5％，1％基础培养基为NB。试验材料为粳稻毫梅品种的悬浮细胞(3月龄)，以不添加PG的NB培养基作对照。培养液量50ml，接种量2ml悬浮细胞，接种后连续培养15天，不继代，每隔2天测定培养基的pH值和mV值(在雷磁PHS-3C型精密PH计上测定)。培养结束时称量培养物鲜重。培养物的鲜重及外观评价如表1。
表1.几种PG添加浓度对培养物的鲜重及外观的影响 项目 PG添加浓度(％) 0.01 0.10 0.15 0.50 1.00 0.00(CK)鲜重(g)比CK相对增重(％)外观0.744+18.8 ++1.385+121.2 ++++1.037+65.7 ++++0.859+37.2 +++0.530+15.3 ++ 0.626 - ++*+号多者表明鲜艳度高。外观评价由本室几位研究者共同作出判断。
由表1可见：PG的添加一般可以提高培养物的生物量，外观也得到改善。效果最好的是0.1％的PG添加浓度。
实施例3.
以0.1％的PG添加于固体培养基MSD中，以未添加PG的MSD作为对照，接种水稻材料31301s、毫梅、米泉黑芒、普通野生稻和IR1545-339，每材料接种5-10管，培养20天后调查平均鲜重和比重。结果如表2。
表2.PG添加于MSD对愈伤生长的效应基因型 平均鲜重(g) 平均比重(g/ml) 外观 处理 CK 处理 CK 处理 CK31301S毫梅米泉黑芒IR1545-339普通野生稻 0.637 0.715 0.685 0.485 0.547 0.225 0.530 0.434 0.352 0.346 1.030 1.110 0.945 1.020 1.246 1.015 0.863 0.926 0.980 1.103 +++ ++ +++ +++ ++ + + + + +
经t测验结果表明：在平均鲜重上，处理和对照间差异非常显著(t＝4.875**)。在平均比重上差异未达显著水平(t＝2.186)。这说明，在固体诱导培养基上PG能促进愈伤的生长，愈伤的比重并不下降且略有升高。处理后的愈伤组织外观鲜艳度高，基本无玻璃化愈伤出现。
实施例4，小麦愈伤组织材料为35816。PG配方为0.1％PA+0.05％MES+20ppm GeO2，基础培养基为MSD。培养20天后检验鲜重。试验结果如表3。t测验(t＝4.636**)认为：处理效应达到极显著水平，这说明PG可以推广应用到小麦的组织培养中。表3.PG对小麦愈伤组织生长的效应(鲜重：g) 试验号 处理(MSD+PG) 对照(MSD) 1 2 3 4 5 0.214 0.395 0.351 0.369 0.382 0.199 0.198 0.183 0.181 0.185
实施例5
取58棉花幼叶于-20℃条件下冰冻，于研钵中直接磨样。DNA提取方法是在Andrew，H(1993)(Plant Molecular BiologyReporter.11(2)：122-127)的方法基础上进行修改的。提取过程中没有进行核裂解，并在棉花DNA提取缓冲液中以0.1％PG取代0.1％DIECA(diethyld：thiocarbamic acid)，以不添加PG的棉花DNA提取液作对照。DNA的数量以玻棒勾起的情况作定性判断，试验结果如表4。表4.PG对棉花DNA提取的效果* DNA质量和数量 DNA提取液 PG CK 色泽 产率 白 红 +++ +
*+多者表示用玻棒勾起量多。
所以，PG在棉花DNA提取中能起到提高DNA质量和产率的作用，能取代进口产品DIECA。