SM33GI的突变酶GIG138P及一种 提高GI热稳定性的突变方案 本发明属于利用蛋白质工程的定点突变方法改良葡萄糖异构酶技术领域。
葡萄糖异构酶(Glucose Isomerase，简称GI)，即木糖异构酶(XyloseIsomerase，E.C.5.3.1.5.)。在体外一定条件下，该酶催化D-葡萄糖至D-果糖的异构化反应，它是工业上以淀粉制备高果糖浆的关键酶，具有重要的经济价值。
从天然菌株分离纯化得到的野生型GI早已商业化，并取得了巨大的经济和社会效益。但是天然GI用于高果糖浆的生产还存在一定的局限性。中国《生物工程进展》1993年第14卷第3期38页指出：GI在较高反应温度下的稳定性还不够理想，而异构化反应时，温度越高，热力学平衡越趋向于果糖方向。所以人们期望用蛋白质工程技术对GI进行改造，提高其热稳定性，这将提高酶反应速度、延长酶寿命、增加反应平衡过程中果糖的产量，以最终降低投资和生产成本、简化工艺流程。
GI是目前国际上公认的建立完整的蛋白质工程技术的最好模型之一。由于其重要的经济价值和理论研究意义，美国、日本、英国、法国、比利时、荷兰等发达国家，包括一些西欧和北美的大公司都在进行着不同种属来源GI的蛋白质工程及其应用研究。
在利用蛋白质工程改良GI方面，已有数家机构就不同菌株GI蛋白质工程的技术方法或获得的突变体申请了专利。例如：1988年美国Cetus公司就锈赤链霉菌(S.rubiginosus)GI的一些突变体及提高蛋白质稳定性地技术方法申请了国际专利PCT/US88/02765。他们报道了锈赤链霉菌GI的蛋白质工程技术，提出了几种加强蛋白质热稳定性的理论方法，同时也提出了多种具体的改善该酶热稳定性的突变方案，但未见在该酶实施成功的具体实例；在荷兰细菌遗传公司(Gist-brocades)和比利时植物研究所(Plant Genetic Systems)等申请的专利EP89201892.0中，报道了数个密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)GI的定点突变体及其制备过程，其中K253R是在提高GI热稳定性的众多定点突变尝试中、目前报道的唯一成功例子。在60℃、1M葡萄糖底物存在的条件下，它的热失活半衰期比野生型酶提高了5倍，但在84℃、无底物的情况下，热失活半衰期也只是野生型酶的1.1倍。国际专利PCT/GB89/00748报道了英国帝国理工学院的大卫·布罗(Blow David)等人提出的上百个定点突变方案。到目前为止，他们根据这些方案在节杆菌NRRL B3728菌株(Arthrobacter strain NRRLB3728)GI进行了大量具体试验，却仍未见提高热稳定性成功的报道。
可见利用蛋白质工程技术获得有意义突变体非常困难。这是因为经过自然界的长期选择，天然蛋白质的结构已很具合理性，性质已相当完善，要想改良不容易。另外，蛋白质作为整体发挥功能，其结构非常复杂，结构和功能的关系目前还很不清楚，分子设计是蛋白质工程的薄弱点。如何通过合理的分子设计来获得热稳定提高的蛋白质是蛋白质工程技术中具有很大挑战性的问题。
国内自六十年代也已开展了葡萄糖异构酶应用于果葡糖浆生产的研究。中国《山东轻工业科技》1982年第2期1-8页报道的贺家明等人1979年筛选得到的7号淀粉酶链霉菌M1033，是国内在这方面最具应用价值的工业菌之一，但用于工业生产，特别是用于生产55％果葡糖浆，其GI热稳定性还不够理想。本发明组克隆了7号淀粉酶链霉菌M1033菌株GI(简称SM33GI)基因，并于1993年测定了其全基因序列，发表于中国《生物工程学报》1994年第10卷第2期120页；构建了表达质粒pTKD-GI，实现了该基因于大肠杆菌中的高效表达，见中国《高技术通讯》1993年3(7)9-12页；同时还生长了SM33GI的晶体，分阶段测定了其2.5埃与1.9埃晶体结构，该文将发表于1996年的中国《中国科学》杂志。这些工作为采用蛋白质工程改造SM33GI提供了良好基础。
本发明的目的是利用蛋白质工程技术对SM33GI进行改造，以获得热稳定性和最适反应温度提高的有意义突变体酶GIG138P，同时提供一种获得热稳定性提高的GI有意义突变体的定点突变方案。
本发明SM33GI的突变体酶GIG138P，其特征在于将SM33GI的138位甘氨酸(Gly)突变成了脯氨酸(Pro)。该突变体酶的制备方法是：根据SM33GI的基因序列，设计并合成引入Pro138密码子的定点突变引物，对SM33GI基因进行定点突变，测定DNA序列，鉴定出Gly138密码子变为Pro138密码子的突变体，将突变体基因进行表达，分离纯化突变体酶GIG138P。
本发明获得热稳定性提高的GI有意义突变体的突变方案，其特征在于将GI的138位Gly或某些GI中在同源性比较上相当于SM33GI Gly138的Gly替换成Pro。所述“某些GI中在同源性比较上相当于SM33GI Gly138的Gly”是指枯草杆菌(Bacillus subtilis)GI的Gly196、嗜热硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)GI的Gly188、嗜热产硫梭状芽孢杆菌(Clostridiumthermosulfurogenes)GI的Gly189和大肠杆菌(Escherichia coli)GI的Gly189。
SM33GI的晶体结构测定显示，Gly138位于一段无规则卷曲中，将Gly138替换成Pro138后，Pro的吡咯烷环可以增加酶空间结构的刚性。同时，通过晶体结构模型模拟可见，Pro的吡咯环侧链刚好能够充填Gly138由于无侧链基团而留下的空洞，使得整个分子结构更加紧密、合理。结果GIG138P的热失活半衰期比野生型GI提高了0.9--1.1倍，最适反应温度提高了10--12℃，比活与野生型酶相当。可见它是热稳定性和最适反应温度同时获得改善的有意义突变体。
在SM33GIG138P构建成功，并确证其为有意义突变体之后，对已知的16种GI的氨基酸序列(可参见中国《生物工程进展》1994年第14卷第3期第37页)进行比较。
附图1是不同种族来源GI的氨基酸序列比较图。图中(1)为7号淀粉酶链霉菌M1033菌株(Streptomyces diastaticus No.7 strain M1033)；(2)为深灰色链霉菌S-41菌株(S.griseofuscus S-41)；(3)为鼠灰色链霉菌DSM40091菌株(S.murinus DSM40091)；(4)为橄榄产色链霉菌(S.olivochromogenes)；(5)为锈赤链霉菌(S.rubiginosus)；(6)为热普通链霉菌DSM40444菌株(S.thermovulgaris DSM40444)；(7)为紫黑色链霉菌CBS409.73菌株(S.violaceoniger CBS409.73)；(8)为紫黑色链霉菌变种LMG7183菌株(S.violaceoruber LMG7183)；(9)为嗜热高温菌(Thermus thermophilus)；(10)为密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)；(11)为小瓶属3876菌株(Ampullariella strain3876)；(12)为节杆菌NRRL B3728菌株(Arthrobacter strain NRRL B3728)；(13)为枯草杆菌；(14)为嗜热硫化氢梭状芽孢杆菌；(15)为嗜热产硫梭状芽孢杆菌；(16)为大肠杆菌。方框内为活性中心区氨基酸，＂*＂标出的氨基酸是在所有16个GI序列中保守的，＂#＂标出的氨基酸为除了嗜热高温菌XI以外，在其他15个GI序列中完全一样，数字表示该数字的最前一位数下的氨基酸在GI中的位序。
由附图1可见，同源性部位相当于SM33 GI138位的Gly在除嗜热高温菌以外的其他15种GI中全都保守，嗜热高温菌GI的同源性部位，即137位恰恰是Pro，而嗜热高温菌GI是这些GI中热稳定性和最适反应温度最高的。中国《生物工程进展》1994年第14卷第3期36页指出，由GI的晶体结构比较可见，不同种属来源的GI在其α-碳原子骨架的空间结构上都具有高度的相似性。在多肽链中，Gly的结构柔性较大，Pro的构型自由度较小，比其他氨基酸残基更适合位于β-转角或无规则卷曲中，使得β-转角或无规则卷曲结构更加稳定。对于蛋白质数据银行(PDB)可提供晶体结构模型的其他几种GI，如锈赤链霉菌GI、节杆菌NRRL B3728菌株GI等，晶体结构模拟显示Pro138在它们的结构中也能产生类似于在SM33GI中的效果。
实施例1：SM33GIG138P的制备及其性质分析
(1)对SM33GI基因进行定点诱变，构建并获得突变体酶GIG138P。
步骤如下：
①合成寡核苷酸点突变引物
根据SM33GI基因序列，设计将Gly138的密码子改成Pro138的密码子的寡核苷酸点突变引物，如：5’-TACGTCGCCTGGCCCGGCCGCCGAGG-3’，采用DNA合成法进行合成。
②构建重组M13DNA
将重组表达质粒pTKD-GI和M13mp19 RF用EcoRI+SphI双酶解，经琼脂糖凝胶电泳，分别从胶中抽提0.9kb和7.2kb片段，T4DNA连接酶连接后转染大肠杆菌XL1-blue。
③定点诱变
采用双引物法，步骤简述如下：
a.制备重组M13DNA的参U单链模板：于大肠杆菌CJ236中完成；
b.磷酸化寡核苷酸点突变引物；
c.将磷酸化点突变引物、通用引物与参U单链模板退火，进行体外延伸与连接；
d.转染突变反应液于XL1-blue感受态细胞。
具体过程可参见中国《生物化学与生物物理学报》1995年27(5)470页。
然后挑取噬菌斑，小规模抽提单链，测定DNA序列，鉴定出Gly138的密码子变成Pro138的密码子的突变体。
④表达突变体基因
将突变体基因克隆回原重组表达质粒pTKD-GI，转化大肠杆菌K38/pGP1-2，可采用中国《高技术通讯》1993年第3卷第7期第10页所述的方法，培养表达出GIG138P。
⑤分离纯化
可采用中国《生物化学与生物物理学报》1995年27(5)470页介绍的方法，用瑞典发玛西尔(Pharmacia)公司产的DEAE-Sepharose FF和Sephacryl HR S-300，对上述大肠杆菌表达的酶进行分离纯化，获得GIG138P纯酶。
(2)测定SM33 GIG138P的性质
①热稳定性的测定
将1mg野生型GI和GIG138P分别溶解于2ml 100mM MgCl2/50mMTris-HClpH7.0的缓冲液中，同时置80℃水浴中保温，每隔30分钟取样100ul，用咔唑法测定残余活力，得到如表1的数据。根据表1的数据，以残余活力的百分数的对数对时间作图，得到GI的热失活曲线。
附图2为GI于80℃下的热失活曲线图，图中横坐标代表保温时间(小时)，纵坐标代表残余活力百分数(％)的常用对数。带＂●＂的线为野生型GI热失活曲线，带＂▲＂的线为GIG138P的热失活曲线，T1/2为热失活半衰期。
由图可见，野生型GI在80℃下的热失活半衰期为105min，而GIG138P为207min，接近野生型GI的两倍。
②最适反应温度的测定
以含有0.5mg/ml GI(分别为野生型GI和GIG138P)、0.045MD-木糖、10mMMgCl2及100mM K3PO4(pH8.0)的0.5ml液体为反应液，在30-90℃温度范围内的不同温度下保温10分钟，采用咔唑法测定酶催化D-木糖转化为D-木酮糖的活性，所得数据见表2。根据表2的数据以相对于最大活力的百分数(％)对反应温度作图。
附图3表示反应温度对GI活性的影响，横坐标代表温度(℃)，纵坐标代表相对于最大活力的百分数(％)，带＂●＂的线为野生型GI，带＂▲＂的线为GI G138P，由图可求得野生型GI和GIG138P的最适反应温度分别约为71℃和82℃。
表1野生型GI和GIG138P在80℃保温下的相对活力时间(小时) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5相对活力 野生型GI 100 82.1 72.5 55.5 40.1 30.3 27.3 24.5 20.0 18.3 (％) GIG138P 100 94.2 91.3 85.4 67.9 60.5 47.6 44.7 40.9 37.7Lg相对活力 野生型GI 2.0 1.91 1.86 1.74 1.60 1.48 1.44 1.38 1.30 1.26 (％) GIG138P 2.0 1.97 1.96 1.93 1.83 1.78 1.68 1.65 1.61 1.57
表2野生型酶与GIG138P在不同温度下的相对活力温度(℃) 30 40 50 60 65 70 75 80 85 90相对活力 野生型GI 18.5 22.1 39.6 67.1 91.0 100 95.9 82.7 72.8 63.6 (％) GIG138P 13.8 22.2 30.1 49.1 60.7 80.8 87.7 100 97.2 84.5
③酶比活的测定
采用咔唑法，以D-葡萄糖为底物测得野生型GI和GIG138P的比活分别为8.53U/mg和8.04U/mg，无明显差别。
由上述结果可知，本实施例制备的(GIG138P是在不影响酶活力的情况下、热稳定性和最适反应温度同时得以提高的有意义突变体酶。
实施例2：SM33GI突变体酶GIG138P的晶体结构模拟
采用常规的静置汽相扩散法制备出适合于X射线衍射的SM33GI单晶，用SIEMENS X200B面探测器收集晶体的衍射数据，参考美国Brookheaven国家实验室蛋白质数据银行(PDB)提供的、由喀洛(Carrell)等构建的锈赤链霉菌GI的1.9埃分辨率晶体结构模型，通过分析晶体密堆积及经典晶体学R因子搜索，按I222空间群构建单体的初始模型，应用立体化学约束倒易空间最小二乘法(PROLSQ)，辅以差值付里叶电子密度图人工分析对初始模型进行调整和精化，最终获得SM33GI的1.9埃晶体结构模型(该模型将申请输入PDB)。模型的具体构建过程可参见1996年的中国《中国科学》杂志。
使用美国BIOSYM公司的Insight II图像系统，于计算机屏幕上显示SM33GI的1.9埃分辨率晶体结构模型，发现Gly138靠近酶分子表面，位于一段无规则卷曲中，且与136位的活性氨基酸靠近。那么，将它替换成Pro则能增加SM33GI空间结构的刚性。同时，利用Insinght II图像系统进行残基置换，把Gly138置换成Pro138，记录置换后的坐标，将生成的GIG138P的坐标用荷兰格罗林根(Groningen)大学物理化学实验室的GROMOS分子动力学模拟软件包进行结构优化，首先做400步的能量极小化，然后在300K温度下做20皮秒(ps)的动力学模拟。附图4(a)为SM33GI的Gly138附近氨基酸空间分布的立体对图，附图4(b)为模拟Pro138取代Gly138之后的情况，图中的线条表示分子骨架。由图可见，人为将Gly138替换成Pro138，模拟GIG138P的分子结构，Pro的吡咯环侧链刚好能够充填Gly138由于无侧链基团而留下的空洞，使得整个分子结构更加紧密、更加稳定。
实施例3：锈赤链霉菌GI突变体酶G138P的晶体结构模拟
威特罗(Whitlow)等测定了锈赤链霉菌GI的晶体结构(见美国《Proteins：Structure，Fuction，and Genetics》1991年第9卷第153-173页)。利用Insight II图像系统，显示PDB提供的、由威特罗等构建的锈赤链霉菌GI的1.6埃晶体结构模型，发现锈赤链霉菌GI与SM33GI在空间结构上很接近，它的138位也为Gly，位于与SM33GI相同位置的一段无规则卷曲中，Pro138同样能增加它空间结构的刚性。采用与实施例2相同的方法进行锈赤链霉菌的突变体酶G138P的分子模拟，附图5为模拟Pro138取代Gly138之后，锈赤链霉菌GI的Gly138附近氨基酸空间分布的立体对图。从图中可以看出，Pro138能够产生类似于在SM33GI结构中的效果。
实施例4：节杆菌NRRL B3728菌株GI突变体酶G138P的晶体结构模拟
从节杆菌NRRL B3728菌株GI的氨基酸序列可知，它的138位也是Gly。1989年亨利克(Henrick)等人测定了该GI的晶体结构(见美国《J.Mol.Biol》1989年第208卷129-157页)。同样用Insight II图像系统显示PDB提供的节杆菌NRRLB3728菌株GI的2.5埃晶体结构模型，并进行该酶突变体酶G138P的晶体结构模拟。发现该酶的Gly138也位于一段无规则卷曲中，那么Pro138同样能够增加其结构刚性，同时结构模拟证明，Pro138在节杆菌NRRL B3728菌株GI中能够产生类似于在SM33GI结构中的效果。