α-1，4-葡聚糖裂解酶在制备 1，5-D-脱水果糖中的应用 本发明涉及一种酶，特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)在从以α-1，4-葡聚糖为基础的底物中制备1，5-D-脱水果糖(“AF”)中的应用。
本发明还涉及糖，特别是1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为抗氧化剂，特别是作为食料和饮料的抗氧化剂的应用。
本发明涉及1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为增甜剂，特别是作为食料和饮料，优选人类食料和饮料中的增甜剂的应用。
FR-A-2617502和Baute等在Phytochemistry[1988]Vol.27No.11 pp3401-3403中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌中生产AF。AF的产量相当低。尽管提到了可能的酶促反应，但两篇文献都没有提供任何酶的氨基酸序列资料，更不用说任何核苷酸序列资料。这些文献认为AF可能是制备抗生素吡喃酮羟基羟甲基吡喃酮(microthecin)的前体。
Yu等在Biophysica Acta([1993]Vol 1156 pp313-320)中报道了从红海藻中制备GL并用它降解α-1，4-葡聚糖以生产AF。AF的产量相当低。尽管提到了酶GL，但该文献未提供任何该酶的氨基酸序列，更不用说编码该酶的任何核苷酸序列。该文献还认为GL的来源就是藻类。
典型的以α-1，4-葡聚糖为基础地底物是淀粉。现在已发现淀粉在工业上的广泛用途主要是因为它们是廉价的天然物质。
淀粉降低酶可分成不同类。淀粉水解酶产生葡萄糖或葡萄糖寡聚物。第二组淀粉降解酶是磷酸化酶，它在无机磷酸盐存在的条件下从淀粉产生葡萄糖-1-磷酸。
AF也可经化学合成(见Lichtenthaler在Tetrahedron LettersVol 22 pp1429-1432中的工作)。然而，该化学合成涉及许多步骤而且并不产生大量的AF。
因此生产AF的化学合成途径非常昂贵。
于是需要一种以廉价和简便的方式且还能大量产生AF的方式制备AF的方法。
另外，通常用抗氧化剂抑制诸如食品的物质具有有害影响的氧。两种通常使用的抗氧化剂是GRINDOX 142和GRINDOX 1029。这些抗氧化剂含有许多成份且生产相当昂贵。
因此需要具有简单和廉价形式的抗氧化剂。
此外，在食品和饮料制备中通常使用增甜剂。然而许多增甜剂制备昂贵且复杂。
因此，需要具有简单和廉价形式的增甜剂。
根据本发明，提供了一种制备糖1，5-D脱水果糖的方法，包括用酶α-1，4-葡聚糖裂解酶处理α-1，4-葡聚糖，其特征在于该酶以基本纯的形式使用。
如果葡聚糖除了α-1，4-键外还含有不同于该键的其它键时，优选的是将α-1，4-葡聚糖裂解酶与能打开这类其它键的合适试剂(如水解酶，优选葡聚糖水解酶)结合使用。
优选地，葡聚糖是淀粉或以化学或酶促法制备的淀粉片段。如果以酶促法制备，该反应可在加入α-1，4-葡聚糖裂解酶前进行或可同时进行该反应。合适的试剂可以是辅助酶。优选的辅助酶是α-或β-淀粉酶。优选使用脱支酶。更优选的辅助酶是至少一种支链淀粉酶(pullanase)或异淀粉酶(isoamylase)。
优选地，α-1，4-葡聚糖裂解酶结合到支持物上，或更优选的是以溶解的形式。
优选地，该酶从真菌，优选Morchella costata，或普通羊肚菌，或从真菌感染的藻类，优选Gracilariopsis lemaneiformis或仅从藻类优选的从Gracilariopsis lemaneiformis中分离。
优选地，使用未被该酶降解的凝胶从真菌或从真菌感染的藻类或仅从藻类中分离和/或进一步纯化该酶。
优选地，该凝胶以糊精或其衍生物为基础。
优选地，该凝胶是环糊精，更优选β-环糊精。
优选地，该酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1的氨基酸序列SEQ.ID.No.2或氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No.6，或其任何变异体。
在另外优选的实施方案中，该酶包含在SEQ.ID.No.s9-11中所示的任何一个氨基酸序列或其任何变异体。
术语“其任何变异体”是指在所得的酶具有裂解酶活性的前提下对该序列进行一个氨基酸的任意取代，改变，修饰，置换，缺失或增加。
优选的是该酶与支链淀粉或糊精结合使用。
优选的是从编码该酶的核苷酸序列中表达来获得该酶。
优选的是所述核苷酸序列是DNA序列。
优选的是所述DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何序列相同，或互补，或基本上同源，或含任何合适的密码子取代的序列。
在另外的优选的实施方案中，DNA序列包含与SEQ.ID.No.s12-14所示的序列相同，或互补，或基本上同源，或含任何合适的密码子取代的任何一个序列。
术语“基本上同源”包括有关结构和/或核苷酸成份和/或生物学活性的同源性。
术语“含任何合适的密码子取代”包含在所得的酶具有裂解酶活性的前提下用编码相同氨基酸的另一密码子进行任何密码子置换或取代或对其进行的任何增加或缺失。
换句话说，本发明还包括修饰的DNA序列，其中至少一个核苷酸缺失，取代或修饰或其中至少插入一个增加的核苷酸以便编码具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，优选具有增加的裂解酶活性。
优选使用高浓度-例如最高至25％溶液浓度的淀粉。
优选在缓冲液存在的条件用该酶处理底物。
优选在基本上纯的水存在的条件下用该酶处理底物。
优选在不存在辅助因子的条件下用该酶处理底物。
根据本发明，还提供了制备糖1，5-D-脱水果糖的方法，包括用酶α-1，4-葡聚糖裂解酶处理α-1，4-葡聚糖，其特征在于该酶含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1或氨基酸序列SEQ.ID.No.2或氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No.6，或氨基酸序列SEQ.ID.No.s9-11中的任何一个序列，或其任何变异体。
根据本发明还提供了以本发明的方法制备的糖1，5-D-脱水果糖。
以13C NMR证实和表征了以本方法制备的AF。
本方法的一个关键的优势是可以比以前大得多的数量制备糖1，5-D-脱水果糖且该方法比已知方法相对更简便和更廉价。例如现在该糖的制备量可以是例如大于100g，如500g，与此相比，背景技术的方法仅生产更少的量，如微克量。
GL可催化的典型反应可概括如下：
1).支链淀粉——→AF+有限糊精
2).直链淀粉——→AF+有限糊精
3).糊精 ——→AF+葡萄糖
在反应1)中，两种产物的比率取决于支链淀粉的结构或α-1，6-糖苷键在支链淀粉分子中的分布。
在反应2)和3)中，产物比率取决于底物聚合度(DP)数值。在反应3中，AF与葡萄糖之间的比率取决于DP。例如，如果糊精含10个葡萄糖单元，则AF∶葡萄糖的比率是9∶1。
本发明的另一优势是可基本上降低含不同于α-1，4-键之键的葡聚糖，而以前仅达到部分降解。1，5-D-脱水果糖前体的基本上降解是导致增加1，5-D-脱水果糖产量的因素之一。
其它优选是，AF是天然存在的物质，因此从人类的角度看具有潜力。例如，它可由AF脱水酶转变成抗生素羟基羟甲基吡喃酮。已知抗生素在食品生物防腐中的用途，它是食品技术的重要方面。然而，到现在为止，AF及还有羟基羟甲基吡喃酮的制备具有许多缺陷。例如仅可少量生产。另外，方法昂贵。
本发明通过提供AF及还有其它产品如羟基羟甲基吡喃酮的更大量生产和更廉价的生产克服了这些问题。以这一方式可制备克到千克量的AF。
进一步的优势是裂解酶在4℃至少稳定1年并能冻干而不损失活性。
另一优势是裂解酶直接从淀粉产生AF而不需要任何辅助因子存在。
另一优势是酶可在纯水中使用。这一结果是非常惊人的。
根据本发明裂解酶的简单特性，可期望AF的生产成本可与葡萄糖的成本相提并论。本发明的裂解酶不必需要一般非常昂贵的任何辅助因子存在，这一点特别具有优势。
一般来说，α-1，4-葡聚糖可用作该酶的底物。
可使用淀粉作为优选的底物。
在优选的方法中，可使用可溶的或胺化的淀粉或淀粉水解产物。可经过化学或酶促方法制备淀粉水解产物。
如果使用部分降解淀粉的酶，该酶可在加入裂解酶或任何其它额外的淀粉降解试剂，如葡聚糖水解酶之前加入，它们也可同时加入。
裂解酶可将葡聚糖转变为AF。该酶可从非还原端附着到底物上并仅仅不转化还原糖。可用本文已描述的一些已知方法去掉残留的葡萄糖。
使用本文描述的反应可大量生产纯的AF。
在一个实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从真菌感染的藻类(如Gracilariopsis lemaneiformis)纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖。
从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中分离的真菌裂解酶的特征在于当使用支链淀粉时，最适pH为3.5-7.5，最适温度为50℃，pI为3.9。
在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从真菌Morchella costata中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖产生1，5-脱水-D-果糖。
经过在pH梯度为3至9的凝胶上进行等电聚焦测定真菌裂解酶显示pI大约为5.4。经过在8-25％梯度凝胶上进行SDS-PAGE测定分子量为110kDa。酶表现出pH最佳范围为pH5-7。发现最适温度在30-45℃之间。
在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从普通羊肚菌真菌中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖。
在另一实施方案中，经过在β-环糊精Sepharose上进行亲和色谱，在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱和在Superose 12柱上进行凝胶过滤从藻类如Gracilariopsis lemaneiformis纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。纯化的酶从α-1，4-葡聚糖中产生1，5-脱水-D-果糖。
对于根据本发明的几个GL酶，裂解酶催化反应的典型pH和温度最适值如下：GL来源 最适pH 最适pH范围 最适温度M.costata 6.5 5.5-7.5 37℃；40℃a普通羊肚菌 6.4 5.9-7.6 43℃；48℃a真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis 3.8 3.7-4.1 40℃；45℃aa使用糖原作底物测定的参数；使用支链淀粉作底物测定其它参数。
本发明的酶将直链淀粉和支链淀粉转变成1，5-脱水果糖。
在试验的麦芽糖类中，发现裂解酶对麦芽糖表现出较低活性，对麦芽三糖和麦芽七糖活性更低，对麦芽四糖和麦芽五糖活性最高。在这些麦芽糖中，酶对高达10mg/ml的浓度不表现底物抑制。
已测序了各个优选来源的酶并随后提供了其氨基酸序列。后面还提供了编码该酶的DNA序列。
因此，本发明描述了一种新的淀粉降低酶，称为新的α-1，4-葡聚糖裂解酶。这是首次纯化和表征的一种酶。
如上所述，本发明还涉及AF的一些特殊用途。
特别是本发明涉及1，5-D-脱水果糖(“AF”)作为一种抗氧化剂，特别是作为食品和饮料的抗氧化剂的应用。
因此根据本发明，提供了1，5-D-脱水果糖(AF)作为抗氧化剂的应用。
优选AF作为或用于食用物质。
优选AF用于或作为食品或饮料。
优选AF与其它抗氧化剂结合使用。
优选根据本发明的方法制备AF。
AF用作抗氧化剂的主要优势是它是天然产物，不可代谢，易于 生产，水溶性且一般无毒性。
因此在优选的实施方案中本发明涉及纯AF的酶促制备法，纯的AF作为有吸引力的水溶性抗氧化剂可用于食品和非食品用途。在本申请的实施例中给出了在食品配方中AF作为抗氧化剂的应用。
在所附实施例中可见AF可与已知高质量的商品食物抗氧化剂相比。
非食品例子包括在聚合物化学中用作聚合物合成过程中的氧清除剂。另外，AF还可用于生物可降解性塑料的合成。
实验表明，AF可作为有效的还原剂(抗氧化剂)，因为它易于将3，5-二硝基水杨酸还原成3-氨基-5-硝基水杨酸。
AF是天然存在的物质，因此它在用作可接受的抗氧化剂时有巨大潜力。AF也可经AF脱水酶转变成抗生素羟基羟甲基吡喃酮。已知抗生素在食品生物保护中的应用，它是食品生物技术的一个重要方面。
另一方面，本发明还涉及1，5-D-脱水果糖作为增甜剂的应用，特别是作为食品和饮料优选人类食品和饮料的增甜剂。
因此根据本发明的该方面提供了1，5-D-脱水果糖作为增甜剂的应用。
优选AF用作或用于人类食品或饮料。
可以任意所需的量，如5％的溶液或100mg/kg到500mg/kg使用AF。
使用AF作为增甜剂的优势在于它是天然产物，一般无毒性，水溶性，不可代谢并易于生产。
因此本发明还涉及AF作为增甜剂的新应用。
优选根据本发明的方法制备AF。
本发明的其它方面包括：
一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶(GL)的方法，包括从真菌感染的藻类，真菌或藻类本身中分离该酶；
一种包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.5或SEQ.ID.No.6或其任何变异体的酶；
一种包含氨基酸序列SEQ.ID.No.9或SEQ.ID.No.10或SEQ.ID.No.11或其任何变异体的酶；
一种编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，其中优选该序列不在其天然环境中(即，它不形成能表达该酶的细胞生物体的部分天然基因组)，其中优选该核苷酸序列是DNA序列；
一种核苷酸序列，其中的DNA序列包含至少一种与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何一种相同，或互补，或基本同源，或含任何合适的密码子取代的序列，其中优选该序列以分离的形式存在。
一种核苷酸序列，其中DNA序列包含至少一种与SEQ.ID.No.12或SEQ.ID.No.13或SEQ.ID.No.14中任何一种相同，或互补，或基本同源，或含任何合适的密码子取代的序列，其中优选该序列是分离的形式。
β-环糊精在纯化一种酶，优选GL中的应用。
本发明其它优选的实施方案包括下列任意一个：作为导入本文所述的DNA序列的结果而具有产生AF之能力的转化宿主生物；这种转化的宿主生物是一种微生物，其中优选该宿主生物选自细菌，霉菌，真菌和酵母；优选该宿主生物选自糖酵母属，克鲁维氏酵母属，曲霉属，木霉属，汉逊氏酵母属，毕赤氏酵母属，芽孢杆菌属，链霉菌属，埃希氏杆菌属，如米曲霉，啤酒糖酵母，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，大肠杆菌；一种制备1，5-D-脱水果糖的方法，包括使用表达编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列的转化宿主生物，其中优选该核苷酸序列是DNA序列，其中优选该DNA序列是上文描述的序列之一；一种掺入了上文所述的核苷酸序列的载体，其中优选该载体是一种复制型载体，其中优选该载体是含有启动子序列下游之核苷酸序列的表达载体，优选该载体包含一种标记(如抗性标记)；用这种载体转化的细胞生物体或细胞系。一种生产α-1，4-葡聚糖裂解酶或编码该酶的任意核苷酸序列或其部分之产物的方法，包含培养用该载体转染的生物体(或细胞系的细胞)并回收该产物。
特别是在表达系统中，优选分泌该酶以简化其纯化。为做到这点，将编码成熟酶的DNA与来自选定生物的信号序列启动子和终止子融合。
为了在黑色曲霉中表达，将gpdA(来自构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列与编码成熟的裂解酶DNA 5′端融合。来自黑色曲霉trpC基因的终止子序列放到该基因的3′端(Punt，P.J.et al.1991-(1991)：J.Biotech.17，19-34)。将该构建体插入到含有大肠杆菌复制起点和选择起点和黑色曲霉选择标记的载体中。黑色曲霉选择标记的例子是amdS基因，argB基因，pyrG基因，hygB基因，BmlR基因，它们都曾用于转化子的选择。将该质粒转化进黑色曲霉并以转化子的培养基中回收成熟的裂解酶。最终该构建体可转化进蛋白酶缺陷型菌株中以减少培养基中该裂解酶的蛋白裂解性降解(Archer D.B.et al.1992-Biotechnol.Lett.14，357-362)。
除了黑色曲霉作宿主之外，可使用已知其好表达系统的其它工业重要微生物，如米曲霉，曲霉属种类，木霉属种类，啤酒糖酵母，克鲁维氏酵母属种类，汉逊氏酵母属种类，毕赤氏酵母属种类，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，芽孢杆菌属种类，链霉属种类或大肠杆菌。
根据布达佩斯条约于1994年6月20日将下列样品保藏于认可的保藏单位(The National Collections of Industrial andMarine Bacteria Limited at 23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom)： 含质粒pGL1的大肠杆菌(NCIMB 40652)-[参考DH5α-pGL1]；和含质粒pGL2的大肠杆菌(NCIMB 40653)-[参考DH5α-pGL2]。
下列样品根据布达佩斯条约于1994年10月11日作为保藏品被认可的保藏单位(The Culture Collection of Algae andProtozoa(CCAP)at Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll，Scotland，United Kingdom，PA34 4AD)接受：真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis(CCAP 1373/1)-[参考GLQ-1(青岛)]。
因此，本发明高度优选的实施方案包括可从存在于质粒中的GL编码序列表达获得的GL酶，该质粒是保藏物NCIMB 40652或保藏物NCIMB 40653的主体；可从作为保藏物CCAP 1373/1主体的真菌感染的藻类中获得的GL酶。
根据布达佩斯条约，下列样品于1994年10月3日保藏在认可的保藏单位(The National Collections of Industrial andMarine Bacteria Limited(NCIMB)at 23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1RY)：含质粒pMC的大肠杆菌(NCIMB 40687)-[参考DH5α-pMC]；含质粒pMV 1的大肠杆菌(NCIMB 40688)-[参考DH5α-pMV 1]；含质粒pMV 2的大肠杆菌(NCIMB 40689)-[参考DH5α-pMV 2]。
质粒pMC是含从Morchella costata构建的基因组文库中分离的4.1kb片段的pBluescript II KS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
质粒pMV 1是含从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的2.45kb片段的pBluescript II KS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因5′端。
质粒MV2是含从普通羊肚菌构建的基因组文库中分离的3.1kb片段的pPUC 19。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因3′端。
在下面讨论中，MC代表Morchella costata，MV代表普通羊肚菌。
如上所述，普通羊肚菌的GL编码序列包含在两个质粒中。参考图15，pMV 1含从位置454到位置2902的核苷酸，pMV 2含从位置2897(包括该位置)下游的核苷酸。参考图12和13，为了连接编码序列，可用限制性酶EcoRI和BamHI消化pMV 2，然后将有关片段插入用限制性酶EcoR I和BamH I消化的pMV 1中。
因此本发明高度优选的实施方案包括可从存在于质粒中的GL编码序列的表达获得的GL酶，该质粒是保藏物NCIMB 40689或保藏物NCIMB 40688和保藏物NCIMB 40689的主体。
根据布达佩斯条约，下列样品于1994年10月11日被认可的保藏单位(The Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP)at Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll，Scotland，United Kingdom，PA34 4AD)作为保藏物接受：
真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis(CCAP 1373/2)-[参考GLSC-1(California)]。
因此本发明高度优选的实施方案包括可从作为保藏品CCAP 1373/2主体的藻类获得的GL酶。
本发明将仅以实施例的方式进行描述。
在下面实施例中，以附图作参考，其中：
图1显示了染色的真菌感染的藻类；
图2显示了染色的真菌感染的藻类；
图3显示了真菌菌丝切片；
图4显示了真菌感染的藻类切片；
图5显示了真菌感染的藻类切片；
图6显示了pGL 1的质粒图谱；
图7显示了pGL 2的质粒图谱；
图8显示了SEQ.I.D.No.3的氨基酸序列，表明了测序的肽片段的位置；
图9显示了SEQ.I.D.No.1与SEQ.I.D.No.2的序列比较；
图10是显微照片；
图11显示了pMC的质粒图谱；
图12显示了pMV 1的质粒图谱；
图13显示了pMV 2的质粒图谱；
图14显示了从Morchella costata获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区；
图15显示了从普通羊肚菌获得的基因组DNA的GL编码序列和部分5′和3′非翻译区；
图16显示了来自Morchella costata和普通羊肚菌的GL编码序列和非翻译区的比较；
图17列出了SEQ.I.D.No.5的氨基酸序列，显示测序的肽片段的位置；
图18列出了SEQ.I.D.No.6的氨基酸序列，显示了测序的肽片段的位置；
图19显示了存在和缺乏AF时的耗氧图；
图20显示了TLC板。
更详细地说，图1显示了钙粉白染色，显示了Gracilariopsislemaneiformis上部和下部的真菌(108×和294×)。
图2显示了带有真菌的Gracilariopsis lemaneiformis的PAS/苯胺蓝黑染色。真菌具有明显更高含量的碳水化合物。
图3显示了显微照片，显示了生长于藻类细胞原壁(w)之间的含两薄壁的真菌菌丝(f)的纵切和横切切片。注意在藻类叶绿体中的类囊体膜(箭头)。
图4显示了用克隆2探针的反义检测(上排)，似乎局限于以钙粉白染色的连续切片所示的真菌(下排)处(46×和108×)。
图5显示了发现用克隆2探针的强烈反义检测信号在Gracilariopsis lemaneiformis的真菌上(294×)。
图6显示了质粒pGL 1的图谱，它是含有从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis构建的基因组文库中分离的3.8kb片段的pBluescript II KS。该片段含有编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
图7显示了质粒pGL 2的图谱，它是含有从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis构建的基因组文库中分离的3.6kb片段的pBluescript II KS。该片段含编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
图9显示了SEQ.I.D.No.1(GL 1)与SEQ.I.D.No.2(GL2)的序列比较。GL1的残基总数是1088，GL2的残基总数是1091。在所做的比较中，使用结构-遗传模型(打开缺口花费：10；连接缺口花费：2)。在图9中显示两个对比的残基相同的符号是“∶”；显示两个对比的残基相似的符号是“.”。说成是“相似”的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。总的来说有845个氨基酸相同(即77.67％)；60个氨基酸相似(5.51％)。GL 1中插入的缺口数为3，GL 2中插入的缺口数是2。
图10是显示在藻类细胞壁(w)之间生长的真菌菌丝(f)的显微照片。注意藻类细胞中的红藻淀粉粒(s)和类囊体(箭头)。
在图14中，碱基总数是4726，DNA序列组成是：1336A；1070C；1051G；1269T。ATG起始密码子以黑体字表示。内含子下面划线。终止密码子以斜体字表示。
在图15中，碱基总数是4670，DNA序列组成是：1253A；1072C；1080G；1265T。ATG起始密码子以黑体字表示。内含子下面划线。终止密码子以斜体字表示。
在图16中，两个对比的序列是从MC(残基总数：1066)和MV(残基总数1070)获得的序列。使用的比较模型是结构-遗传模型(打开缺口花费：10；连接缺口花费：2)。在本图中，表示两对比的残基相同的符号是“∶”。表示两对比的残基相似的符号是“.”。说成是“相似”的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。总的来说，相同：920(86.30％)；相似51(4.78％)。在MC中插入的缺口数为1，在MV中插入的缺口数是1。
在所述的序列表中：SEQ.I.D.No.5是从Morchella costata获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.6是从普通羊肚菌获得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.7是从Morchella costata获得的GL的核苷酸编码序列；SEQ.I.D.No.8是从普通羊肚菌获得的GL的核苷酸编码序列。
在SEQ.I.D.No.5中，残基总数是1066。GL酶的氨基酸组成为：
46 Ala 13 Cys 25 His 18 Met 73 Thr
50 Arg 37 Gln 54 Ile 43 Phe 23 Trp
56 Asn 55 Glu 70 Leu 56 Pro 71 Tyr
75 Asp 89 Gly 71 Lys 63 Ser 78 Val
在SEQ.I.D.No.6中，残基总数是1070。GL酶的氨基酸组成为：
51 Ala 13 Cys 22 His 17 Met 71 Thr
50 Arg 40 Gln 57 Ile 45 Phe 24 Trp
62 Asn 58 Glu 74 Leu 62 Pro 69 Tyr
74 Asp 87 Gly 61 Lys 55 Ser 78 Val
实 验1.可溶性酶系统：1.1. pH对从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中分离
的裂解酶的稳定性和活性的影响。
在37℃试验了两种缓冲系统，命名为浓度为5mM的HOAc-NaOAc和柠檬酸钠-柠檬酸。试验的pH范围为从pH3到pH5.2。裂解酶在3.6到4.2的pH范围内显示最大活性。在pH3时，酶的稳定性和活性减少大约90％。在pH5.2时，活性减少大约64％。然而在此pH下酶比在pH3下更稳定，而在pH5.2下获得的AF产量是pH3.8下获得的AF产量的75％。在HOAc-NaOAc缓冲液中获得的AF产量比在柠檬酸缓冲液中略高。这不是由于在AF试验方法中两种缓冲液(在AF试验混合物中终浓度是125μM)的任何偏差影响。1.2. 温度对裂解酶的活性和稳定性的影响：
本实验在最适pH范围内进行。在25℃下AF生产线型增长到至少9天。这表明在9天内裂解酶无活性和稳定性损失。随着温度的升高，酶稳定性减小。
在下列温度下酶活性的半寿期为：
30℃ 5天
37℃ 2.5天
40℃ 不超过1天
50℃ 不超过1天1.3. 底物浓度对裂解酶稳定性和AF产量的影响：
观察到支链淀粉和糊精对裂解酶具有稳定效应，而最小的底物麦芽糖没有。这一点以可溶性酶系统和固相酶系统来证实。
随着支链淀粉浓度增加到高达25％，AF产量也增加。至于糊精，当浓度超过30％(试验了30％，40％和50％)时AF产量减少。1.4. 裂解酶的活化和灭活
未发现金属离子为活性所必需，令人惊奇的是该酶催化的反应可在纯水中进行。向反应混合物中加入高达20mM的EDTA对活性很少有影响的事实清楚地证实对于根据本发明的裂解酶的活性来说，金属离子是不必要的。
这意味着在AF纯化步骤中，从反应系统中去掉盐的离子交换色谱步骤可省去，如果水用作反应介质的话。然而，反应混合物包含浓度为0.85％(0.145M)的NaCl时可将AF产量增加1倍。1.5. 底物特异性
当淀粉浓度变高时，溶解后冷却的淀粉倾向于形成坚硬的凝体。因此，使用部分降解的淀粉作为1，4-葡聚糖裂解酶的底物具有优势。
试验了从M.costata分离的α-1，4-葡聚糖裂解酶对不同寡聚糖的特异性。这些寡聚糖是麦芽糖(G2)，麦芽三糖(G3)，麦芽四糖(G4)，麦芽五糖(G5)，麦芽六糖(G6)和麦芽七糖(G7)。寡聚糖以8mg/ml的浓度溶于水。酶试验含150μl底物G2/G3/G4/G5/G6/G7，120μl 0.1M MES pH6.3和30μl纯化的酶。反应混合物在30℃培养60分钟。随后经煮沸3分钟终止反应并加入900μl无水乙醇进行沉淀。4℃以20,000×g离心5分钟后将上清液转移到新的eppendorf管中并冻干。
冷冻干燥的样品溶于1000μl H2O中并通过0.22μm Millipore滤膜过滤，随后加样25μl到Dranex HPLC上。1.7 HPLC分析程序
在由GPM-2泵和用于脉冲安培计检测方式的PED检测器组成的Dionex 4500i色谱系统中进行分析。
阴离子交换柱是Dionex的CarboPac PA-100(4×250mm)和CarboPac PA-100保护柱。
洗脱液是200mM氢氧化钠(A)，500mM乙酸钠(B)和18M欧姆去离子水(C)。泵以2种不同的方式(方法1和方法2)运行：方法1：时间，分 0.0 3.0 3.1 26.9 29.0％A 10 10 50 50 10％B 0 0 0 32 0％C 90 90 50 18 90方法2：时间，分 0.0 30％A 10 10％B 0 0％C 90 90标准品：
葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖和麦芽七糖(都来自Sigma)和1，5-脱水果糖用作标准品。所有化合物均溶于18M欧姆的去离子水中，用前通过0.22μm Millipore滤膜过滤。1.7. 结果：
分析表明从M.costata分离的纯化酶确实能使用麦芽寡聚糖作底物形成1，5-脱水果糖。
当使用麦芽糖作底物时，几乎不形成1，5-脱水果糖，但当使用其它麦芽寡聚糖(G3-G7)时，产生高产量的该化合物。
很清楚当使用更长的麦芽寡聚糖时可获得更高产量的1，5-脱水果糖。
这一观察结果与裂解酶从底物非还原端形成1，5-脱水果糖而葡萄糖分子末端未变化的理论非常吻合。1.8. AF的形成
M.costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶将淀粉水解成终产物1，5-脱水果糖。终产物经HPLC，方法2显示。酶试验含500μl支链淀粉(20mg/ml，溶于H2O)、400μl 0.1M MES pH6.3和100μl纯化酶。在30℃保温反应混合物，保温30或120分钟后经煮沸终止反应。加入3体积的无水乙醇沉淀高分子寡聚糖类，按上面所述离心和冻干样品。样品溶于125μl H2O中并取25μl上样到HPLC柱上。
HPLC洗脱图清楚地表明M.costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶经水解淀粉产生1，5-脱水果糖。保温30和120分钟后发现相当量的1，5-脱水果糖，表明酶活性不受终产物1，5-脱水果糖的抑制。
以这种方式制备的AF 13C NMR光谱(水)表明它采取产生下列信号的一个主要形式：δ93.5(夸脱，C-2)，81.5(CH，C-5)，77.7(CH，C-3)，72.6(CH2，C-1)，69.8(CH，C-4)，62.0(CH2，C-6)。根据H-H C-H和C-H 2D相关光谱进行排列。1.6.裂解酶与支链淀粉酶和异淀粉酶的协同效应。
从表1可见，在反应混合物中包含支链淀粉酶的是增加AF的产量大约15-23％，这一增加值取决于使用的底物是可溶性淀粉还是支链淀粉。
表1 在AF生产中支链淀粉酶和裂解酶的协同作用：底物 裂解酶 支链淀粉酶 AF产率(％) Glc产率(％
)可溶性淀粉 + - 51 0
- + 0 0.37
+ + 66.0 3.9支链淀粉 + - 48.0 0
- + 0 0.33
+ + 71.3 3.7+，加入的酶，-，省去的酶。
反应混合物含0.3ml 2％马铃薯支链淀粉(Sigma)/水或0.3ml 2％可溶性淀粉(Merch)，2μl裂解酶和0.36单位的所示支链淀粉酶(BM)。
在30℃反应进行1天。在反应终止时，取样进行AF和GLc分析。
至于异淀粉酶，其优势在于裂解酶的最适pH与假单胞菌属异淀粉酶的最适pH(pH3.0-4.5)重叠。然而问题是异淀粉酶产生的过量的长链直链淀粉会从溶液中沉淀出来而不再适合于作为裂解酶的底物。如果直链淀粉的链不太长，可期望裂解酶与异淀粉酶会产生有效的协同作用。2.固相酶系统
经过使用琥珀酰胺活化的Sepharose(Affigel 15凝胶，Bio-Rad)和戊二醛活化的Silica凝胶(BM)完成裂解酶的固相化。在Affigel 15凝胶上固相化后酶活性的恢复率在40％到50％之间。固相化后可能仍有一些酶较活跃，但由于位阻底物不能进入，特别是对于象淀粉一样的大分子。工业上使用的固相酶通常活性恢复率为大约50％。
对于Affigel 15凝胶固相化的裂解酶，最令人感兴趣的事是在pH5.5下其稳定性有很大的改进。当柱在这一pH下进行操作时，稳定性至少有16天长。考虑到支链淀粉酶的最适pH为大约pH5.5，pH改变在稳定性中非常重要。这是裂解酶和支链淀粉酶在具有相同物理-化学环境的相同反应器中发生有效的协同作用的前提条件。可溶性裂解酶的最适pH在3.6和4.2之间，在该pH范围内，支链淀粉酶表现出很小的活性或无活性。
使用硅胶固相裂解酶的活性恢复率非常高，大约80-100％。然而当柱不在pH 3.8和pH 5.5下操作时硅胶固相酶不稳定。可能有些裂解酶吸附到硅胶珠表面并在每次洗柱后缓慢从硅胶上释放。因此可能是吸附的裂解酶造成了高恢复率和柱活性的减少。3. AF的纯化3.1. 裂解酶-支链淀粉/可溶淀粉系统
在该系统中，反应终止时反应系统含AF，极限糊精，裂解酶和缓冲盐。经乙醇(终浓度50％)沉淀从大分子(极限糊精和裂解酶)中分离AF。使用Amicon YM3膜(截下3,000D的分子量)经超滤分离未沉淀的低分子量支链淀粉。在旋转蒸发器中经在40℃蒸发去掉乙醇。经过混合的离子交换剂从AF中去掉缓冲盐。经冷冻干燥获得纯化的固体AF。3.2. 裂解酶-支链淀粉酶/支链淀粉/可溶性淀粉系统
在该系统中终产物是AF和葡萄糖。如果制备至少基本上纯的AF样品，必须去掉副产物葡萄糖。这可经过酶方法完成。首先经葡萄糖氧化酶将葡萄糖转变成葡萄糖酸和过氧化氢。
需要过氧化氢酶消除形成的H2O2。H2O2可将AF氧化成目前结构未知的2种新化合物。在AF制品中的其它杂质是AF的氧化产物。观察到经空气水平的氧，特别是在高温，高AF浓度和长时间暴露下AF可被缓慢氧化。
葡萄糖酸可与缓冲盐一起经离子交换色谱去掉。
在该系统中，作为选择可用淀粉转葡萄糖苷酶水解低分子量的支链淀粉分子来代替使用超滤法。3.3. AF的纯度检查。
经TLC，Dionex和NMR证实AF制品的纯度。3.4. 脱水果糖抗氧化活性分析。
电化学氧消耗：方法
在Jorgensen和Skibsted(Z.Lebensm.Unters.Forsch.(1993)196：423-429)描述的甲基亚油酸乳剂中研究AF的活性，对该乳剂作了轻微的修改：向作为乳化剂的5.00ml溶于具有pH＝5.8且含0.2w/w％Tween 20的5.0mM磷酸盐缓冲水溶液的1.33mM甲基亚油酸乳剂中加入下列浓度的AF：0，15，146和680μM。经过加入50μl 0.26M甲基肌红蛋白(MMb)至终浓度为0.26mM起动该系统的氧化。起动反应后立即将样品注射到恒温(25.0±0.1℃)的70μl密封电池中，有效地排除氧向系统的扩散。经Clark电级(与PC资料收集程序相连)测量氧的消费。每30秒登记相对氧浓度(％)。结果
与不同样品的氧消耗相对应的曲线如图19所示。对于未加AF的样品，在样品注射后立即可见氧浓度的相对减少。对于含AF的样品，在曲线结束前观察到对数期且氧浓度减少。与未加AF的样品相比在对数期后仅观察到氧消耗率的微量减少。对具有最高量AF的样品，观察到最长的对数期。对这些样品还观察到耗氧率更低，这经过与对照(0μM)斜率相比这些曲线斜率更小来观察。ESR分析：方法：
经过与H2O2(0.17mM)和FeSO4(4.8μM)的Fenton反应产生羟基。产生的基团以5，5-二甲基-1-二氢吡咯N-氧化物(DMPO，9.7mM)捕获。以1.3mM和6.3mM的浓度加入AF。以浓度为0.25mg/ml(克数相当于1.26mM AF)分析迷迭香(Rosmarinusofficinalis L.)的水溶性提取物。120秒后在室温(20±1℃)下进行测量并在300秒后对相同的反应混合物重复测量，使用下面分光计装置：中心场3475.60G；清除宽度55G；微波功率20mW；调节频率100KHz；调节距离1.01G；接受器放大1.00·105；转变时间81.92毫秒，恒定时间163.84毫秒，清除时间83.89秒。结果
以DMPO捕获产生的羟基。自旋加合物产生特征性的1∶2∶2∶1ESR光谱。光谱峰高与产生的自旋加合物量成比例。DMPO和AF的加入在自旋陷阱和AF之间形成竞争。峰高的降低表明AF较好的清除活性。
表：ESR-光谱的峰高。H2O2＝0.17mM，Fe2+＝4.8μM。 脱水果糖 [mM] 迷迭香提取物[mg/ml] 峰高 [120s] 峰高 [300s] 0 0 2475 2780 1.3 0 2634 2545 6.3 0 1781 1900
可见在1.3mM AF浓度时无羟基清除活性，在6.3mM AF时峰高减小，表明产生的部分羟基被AF清除。4. AF作为抗氧化剂的应用实施例4.1AF作抗氧化剂在50％蛋黄酱中的应用
在饮食供应和零售交易中，50％蛋黄酱用于色拉，打开的夹心面包片等。50％蛋黄酱油含量低使其适于低热量应用。
典型的蛋黄酱组合物如下：
大豆油 50.0％
龙蒿醋(10％) 4.0％
蛋黄 3.5％
糖 3.0％
盐 1.0％
山梨酸钾 0.1％
水 35.2％
MAYODAN 602 3.0％
柠檬调味品10251 0.2％
MAYODAN 602可保证良好的稳定的油分散和所需的粘度，从而使50％蛋黄酱具有较长的货架寿命。
调味品10251是天然柠檬调味品，它使蛋黄酱具有新鲜的柠檬口味。
典型的蛋黄酱以下列方法制备：
1)干燥混合MAYODAN 602，糖和盐。以1份粉末2份油的比例分散于油中。
2)向水中加入调味品和山梨酸钾并注入Koruma混合器中。加入1)。
3)加入蛋黄酱。
4)在真空中连续加油。
5)已(缓慢)加入2/3的油后，将剩下的1/3的油与龙蒿醋混合并加入。
下面资料表明，当将AF作为抗氧化剂加入蛋黄酱中时，结果可比得上已知的食品抗氧化剂GRINDOX 142和GRINDOX 1029。GRINDOX 142：
抗坏血酸棕榈酸酯 10％
丙基没食子酸 20％
柠檬酸 10％
食品级乳化剂 60％
25℃的形态 膏状
颜色 灰色至浅棕色
密度 1.1g/ml
(所有百分数均是重量百分数)。GRINDOX 1029：
抗坏血酸棕榈酸酯 20％
天然生育酚 20％
食品级乳化剂 60％
在25℃的形态 膏状
颜色 亮棕色
在25℃的密度 1.0g/ml
(所有百分数均是重量百分比)。
在试验程序中，向蛋黄酱中加入抗氧化剂使抗氧化剂浓度大约为500ppm。然后将蛋黄酱放入80℃含纯O2的弹型量热计中。再测量产品发生大量氧化的潜伏期。
结果如下：样品 IP(小时)1.空白 28,02.+500ppm GRINDOX 142 35,03.+500ppm GRINDOX 1029 33,34.+550ppm GRINDOX 1029 34,35.+500ppm l，5脱水果糖-D- 32,0(IP小时＝潜伏期)
这些结果表明AF是优良的食品抗氧化剂并可比得上已知的食品抗氧化剂GRINDOX 142或GRINDOX 1029。实施例4.2AF作为抗氧化剂在色拉调味汁中的应用含50％油的酸乳酪色拉调味汁
含50％油的酸乳酪色拉调味汁用于色拉，马铃薯，生蔬菜色拉，肉，鱼和煮过的蔬菜。组成：
大豆油 50.0％
酸乳酪(普通) 39.0％
醋(10％) 3.5％
糖 3.0％
蛋黄 2.0％
盐 1.0％
山梨酸钾 0.1％
MAYODAN 525 1.4％
掩盖酸味的调味品2072 0.02％
MAYODAN 525提供了极好的乳剂稳定性，防止凝固，确保均匀的油分散和粘度，改善了生产过程的耐受性并保证其货架寿命长。
调味品2072是特性相同，掩盖了酸味的调味品，它减小了酸味而不影响其pH值。加工过程：1.将干燥的MAYODAN 525，糖和盐混合。以1份粉末比2份油的比例分散于油中。2.将调味品，山梨酸钾和酸乳酪加入Koruma混合器中。加入1)。3.加入蛋黄。4.在真空中连续加油。5.加入2/3的油(缓慢)后，将醋与剩余的1/3的油混合并加入。6.如果需要就加入香料。试验结果：样品： IP小时 PF1.空白 37.2 1.002. 500ppm脱水果糖 39.5 1.063. 800ppm GRINDOX 1032 43.3 1.07(IP-潜伏期)；(PF-保护系数)保护系数(PF)：
对于每个温度下的AF定义为：PF＝加入了抗氧化剂的油的IP/未加入抗氧化剂的相同油的IP。寿命延长(LE)％：LE＝(PF-1.0)×1006. α-1，4-葡聚糖裂解酶的制备前言：
至于本发明进一步的实施方案，用于制备AF的α-1，4-葡聚糖裂解酶可从真菌感染的藻类中分离，优选真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis，更优选来自青岛(中国)的真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis。
作为选择，可从真菌中获得该酶。例如，真菌可以是Discinaperlata，Discina parma，Gyromitra gigas，Gyromitra infula，Mitrophora hybrida，尖顶羊肚菌，Morchella costata弹丝羊肚菌，Morchella hortensis，Morchella rotunda普通羊肚菌，疣孢褐盘菌，Sarcosphaera eximia，Disciotis venosa，可食鹿花菌，卷曲马鞍菌，空隙马鞍菌，Leptopodia elastica，指状钟菌和羊肚菌属的其它种类中任意一种。优选该真菌是Morchella costata或普通羊肚菌。
至于本发明进一步的实施方案，用于制备AF的α-1，4-葡聚糖裂解酶可仅从藻类中分离，优选Gracilariopsis lemaneiformis，更优选来自Santa Cruz(加利福利亚)的Gracilariopsislemaneiformis。
最初的酶纯化可按Yu等(出处同上)描述的方法进行。然而，优选的是最初的酶纯化包括一种最优化的程序，其中所用的固相支持物在纯化步骤中不分解。该凝胶支持物还具有的优势是它与标准实验室蛋白质纯化装置相配伍。这种最优化的纯化方法的细节在下文描述。用已知的蛋白质纯化的标准技术终止纯化。
使用互补电泳技术易于确定酶的纯度。A.来源＝真菌感染的藻类：
下面序列资料用于产生下述PCR反应的引物并用于检查以各自的核苷酸序列产生的氨基酸序列。来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的肽集合的氨基酸序列：
Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala
Ala Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn
Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly
Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu
Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp
Tyr Lys Phe Gly Pro Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala用于产生引物A和B的氨基酸序列(27-34)(Met Tyr Asn AsnAsp Ser Asn Val)
引物A：
ATG TA(TC) AA(CT) AA(CT) GA(CT) TC(GATC) AA(CT) GT 128种混合
引物B
ATG TA(TC) AA(CT) AA(CT) GA(CT) AG(CT) AA(CT) GT 64种混合用于生产引物C的氨基酸序列(40-50)(Gly Gly His Asp GlyTyr)：
引物C：
TA (GATC)CC (GA)TC (GA)TG (GATC)CC (GATC)CC 256种混合[该序列与互补链相对应]。用于生产引物E的氨基酸序列(74-79)(Gln Trp Tyr Lys PheGly)：
引物E：
GG(GATC) CC(GA) AA(CT) TT(GA) TAC CA(CT)TG 64种混合[该序列与互补链相对应]。用于产生引物F1和F2的氨基酸序列(1-6)(Tyr Arg Trp GlnGlu Val)：
引物F1
TA(TC) CG(GATC) TGG CA(GA) GA(GA) GT 32种混合
引物F2
TA(TC) AG(GA) TGG CA(GA) GA(GA)GT 16种混合首次PCR扩增获得的序列(克隆1)：ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCTTCTTGGCGGC CACGACGGTT AMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly第二次PCR扩增获得的序列(克隆1)：ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCTTCTTGGTGGA CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGGAGAATTCGAC CGAACGNGAA TTGTACTTGC CCGTGCTGAC CCAATGGTACAAATTCGGCC CMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr GluArg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro第三次PCR扩增获得的序列(克隆2)：TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGAATGCGGCTTT CGGGAAACCG ATTATCAAGG CAGCTTCCATGTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGACCACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGTGTGCACCTGT TGTGTGGGAG AATACAACCA GTCGCGATCTGTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCCTyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Gly LysPro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln AspAsp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val ValTrp Glu Asn Thr Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr LysPhe GlyA.1. Gracilariopsis lemaneiformis的细胞学研究：A.1.1.1. Gracilariopsis lemaneiformis中真菌感染的检测：
对在中国收集的Gracilariopsis lemaneiformis进行徒手切片或石蜡包埋材料切片。以光学显微镜检术仔细研究切片材料。在Gracilariopsis lemaneiformis中清楚地检测到真菌菌丝。
Gracilariopsis lemaneiformis的叶状体由以高度有序且几乎以对称方式存在的细胞组成。G.lemaneiformis的管状叶状体由大型无色中央细胞被延长的、纤细的椭圆形细和小而圆的带红色色素的外周细胞包围组成。所有藻类细胞类型的特征在于有厚的细胞壁。大多数真菌菌丝发现在大型细胞的中央层和外周层之间的界面上。这些细胞可清楚地从藻类细胞中区分，因为它们是长圆柱形。观察到菌丝的生长是在高度有序的藻类细胞之间无规则生长。菌丝最通常的方向是沿藻类叶状体的主轴方向。偶尔也检测到向中央和外周的侧向分枝。菌丝不会与藻类内生/附生的第二世代混淆。
已知钙粉白染色含几丁质和纤维素的组织。与几丁质的反应需要4个共价连接的末端N-2酰葡糖胺残基。普遍接受纤维素几乎局限于高等植物，尽管在有些藻类中可能存在微量纤维素。还已知在江蓠属中不存在几丁质。
发现钙粉白染色区与切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料中的真菌菌丝细胞壁相对应。
当在紫外灯下观察时，相对于江蓠属组织淡蓝色的背景菌丝呈现清楚的白色(见图1)。几丁质是大多数真菌的主要细胞壁成份，但在江蓠属中缺失。根据这些观察结果，我们得出结论，所研究的藻类被真菌感染。发现研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中40％的下部被真菌菌丝感染。发现研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中25％的藻类顶端被感染。
用过碘酸希夫氏(PAS)染料和苯胺兰黑染色切片的Gracilariopsis lemaneiformis揭示了与藻类细胞相比真菌细胞内的碳水化合物含量明显更高(见图2)。番红O和孔雀绿染色表现出与在真菌感染的高等植物中所发现的真菌细胞相同的颜色反应。
吖啶橙与切片的Gracilariopsis lemaneiformis的反应显示出真菌清楚的无规则生长。A.1.1.2. 电子显微镜检术
用钙粉白检测到真菌的带有15μm厚切片的载玻片在2％OsO4中固定，用水洗涤并在二甲氧基丙烷和无水乙醇中脱水。在玻璃片的每个切片上加一滴丙酮与Sparr树脂1∶1的混合物，1小时后用1滴纯树脂代替。树脂填充的明胶包埋胶囊面朝下放在切片上并4℃放置过夜。在55℃聚合8小时后，经过浸入液氮可从载玻片上分离附着于树脂块上的厚切片。
修块并用切片机上的钻石刀片切成100nM厚的切片。切片在醋酸铀水溶液和在柠檬酸铅中染色。在电子显微镜下以80KV检查切片。
研究证实了光学显微镜的观察结果并提供了产生裂解酶的G.lamneiformis中国品种被真菌性寄生物或共生物感染的进一步证据。
真菌菌丝由50至100μm长，直径仅几微米的管状细胞构成。细胞依次排列，相邻细胞之间有隔膜壁。偶尔也见分枝。菌丝在藻类叶状体厚细胞壁之间生长而不穿透细胞壁或损伤细胞。已知这种称为真菌藻类共生体的共生关系也发生于一些丝状海洋真菌和大型海洋藻类之间(DonK and Bruning，1992-Ecology of aquatic fungi inand on algae。In Reisser，W.(ed)：Algae and Symbioses：Plants，Animals，Fungi，Viruses，Interactions Explored.Biopress Ltd.，Bristol.)。
检查图10的显微照片，可注意到藻类和真菌细胞之间的一些区别。与藻类几个μm厚的细胞壁相反，真菌细胞壁仅100-200nm厚。在藻类细胞中可见植物典型的细胞器，如具有类囊体膜的叶绿体以及红藻淀粉粒，但在真菌中未发现。
红藻细胞间连接的特征在于称为纹孔栓或纹孔连接的特殊结构。该结构是凸出的电子致密核心且它们是藻类分类学中的重要特征(Pueschel，C.M.：An expanded survey of the Ultrastructureof Red algal pit plugs，J.Phycot.25，625，(1989))。在我们的材料中，在藻类叶状体中常观察到这种连接，但在真菌细胞间从未发现。A.1.2. 原位杂交实验：
原位杂交技术是根据对mRNA的反义核糖核苷酸序列的杂交的原理进行的。该技术用于显示显微切片中存在所说的mRNA的区域。在本发明的特定情况下，该技术用于定位Gracilariopsislemaneiformis切片中的α-1，4-葡聚糖裂解酶。A.1.2.1. 用于原位杂交的35S标记的探针的制备：
将第三次PCR扩增的2386p的PCR片段(称为克隆2(见上面))克隆进pGEM-32f(+)载体(Promega)。以SP6启动子趋动反义RNA的转录，以T7启动子趋动有意义RNA的转录。使用具有下列修改的核糖核酸酶保护试验试剂盒(Ambion)。将转录子通过6％测序凝胶以去掉未掺入的核苷酸并用含有体外转录试剂盒(Ambion)中的T7RNA聚合酶的洗脱缓冲液洗脱。反义转录子含23个非编码的核苷酸，而有意义转录子含39个核苷酸。为进行杂交，使用107cpm/ml的35S标记的探针。
基本上按照Langedale等(1988)所述进行原位杂交。发现最适的杂交温度为45℃。45℃洗涤后用Kodak K-5照相乳胶覆盖切片并在5℃黑暗中放置3天(参考文献：Langedale，J.A.，Rothermel，B.A.and Nelson，7，(1988)。Genes and development 2：106-115，Cold Spring Harbour Laboratory)。
在使用针对α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA的核糖核苷酸探针的原位杂交实验中，在Gracilariopsis lemaneiformis中检测到的真菌菌丝上和周围显示出强烈的杂交信号(见图4和5)。认为这有力地表明产生了α-1，4-葡聚糖裂解酶。在两种Gracilariopsislemaneiformis藻类组织中检测到微弱的随机背景反应。用有意义和反义探针都观察到这种反应。仅用反义探针获得了对真菌菌丝的强烈染色。
以在45℃杂交的标准杂交条件和洗涤步骤获得这些结果。在50℃观察不到对真菌的染色，而背景染色仍相同。对于有意义和反义探针而言，将温度升高到55℃明显地且同等地减小了背景染色。
根据使用互补染色程序的细胞学研究，可得出结论Gracilariopsis lemaneiformis被真空感染。在藻类组织的下部感染最显著。
在切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料上原位杂交结果清楚地表明：杂交局限于发现真菌感染的区域(见图4)。结果表明：α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA似乎局限于Gracilariopsislemaneiformis上真菌感染的区域。根据这些观察结果，我们得出结论：在真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis上检测到α-1，4-葡聚糖裂解酶活性。A.2. 酶的纯化和表征：
按下面方法进行从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis材料中纯化α-1，4-葡聚糖裂解酶。A.2.1. 材料和方法
经过滤收获藻类并用0.9％NaCl洗涤。经匀浆破碎细胞，接着在50mM柠檬酸-NaOH pH6.2(缓冲液A)中在冰上超声处理6×3分钟。以25,000×g离心40分钟去掉细胞碎片。在该程序中获得的上清液认为是无细胞提取物并在8-25％梯度凝胶上分离后用于活性染色和Western印迹。A.2.2. 以β-环糊精Sepharose凝胶分离
无细胞提取物直接上样到预先用缓冲液A平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积的缓冲液A和2体积含1M NaCl的缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α-1，4-葡聚糖裂解酶。汇集活性馏分并将缓冲液换成20mM双-tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。
将活性组分上样到预先用缓冲液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。用缓冲液B以0.3M线性梯度洗脱真菌裂解酶。
作为选择可将β-环糊精Sepharose色谱后获得的裂解酶制备浓缩到150μl并上样到Superose 12柱上，在FPLC条件下操作。A.2.3. α-1，4-葡聚糖裂解酶活性和测定底物特异性，pH和
温度最适值的条件。
试验α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mg/ml支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH6.0)。反应在30℃下进行30分钟并经过加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。室温静置10分钟后在550nm下测光密度。A.3. 来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis α-1，4-
葡聚糖裂解酶的氨基酸测序：A.3.1. 裂解酶的氨基酸测序
用来自溶组织梭状芽孢杆菌的内切蛋白酶Arg-C或来自Lysobacter enzymogenes的内切蛋白酶Lys-C(两者都是测序级，购自Boehringer Mannheim，德国)消化裂解酶。为了用内切酶Arg-C消化，将冷冻干燥的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 10M尿素，50mM甲胺，0.1M Tris-HCl，pH7.6中。用N2覆盖后将加入10μl 50mMDTT和5mM EDTA的蛋白质变性并在N2中50℃下还原10分钟。随后加入1μg溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0中的内切蛋白酶Arg-C，用N2覆盖并在37℃进行消化6小时。为了进行随后的半胱氨酸诱导，加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，将溶液在室温黑暗中及N2存在的条件下保温15分钟。
为了用内切蛋白酶Lys-C消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。用N2覆盖并加入5μl 45mM DTT后，将蛋白质变性并在50℃和N2存在的条件下还原15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在黑暗中N2存在的条件下室温诱导半胱氨酸15分钟。
随后，加入90μl水和5μg溶于50μl 50mM麦黄酮和10mMEDTA，pH8.0的内切蛋白酶Lys-C并在N2存在的条件下37℃消化24小时。
使用溶剂A：0.1％TFA的水溶液和溶剂B：溶于乙腈的0.1％TFA经过在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The SeparationsGroup；California)上进行反相HPLC分离所得的多肽。在使用脉冲液体快速循环在Applied Biosystems 476A测序仪上测序前使用相同的溶剂系统在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μM；Dr.OleSchou，Novo Nordisk，Denmark)上对选择的肽进行再次色谱。
来自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的酶的氨基酸序列资料在下面，特别是以SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2显示。SEQ.ID.No.1具有：残基数：1088氨基酸组成(包括信号序列)
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
61 Ala 15 Cys 19 His 34 Met 78 Thr
51 Arg 42 Gln 43 Ile 53 Phe 24 Trp
88 Asn 53 Glu 63 Leu 51 Pro 58 Tyr
79 Asp 100 Gly 37 Lys 62 Ser 77 ValSEQ.ID.No.2具有：残基数：1091氨基酸组成(包括信号序列)
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
58 Ala 16 Cys 14 His 34 Met 68 Thr
57 Arg 40 Gln 44 Ile 56 Phe 23 Trp
84 Asn 47 Glu 69 Leu 51 Pro 61 Tyr
81 Asp 102 Gly 50 Lys 60 Ser 76 ValA.3.2. N-末端分析：
研究表明天然葡聚糖裂解酶1的N端序列被封闭。基本上按LeGendre等(1993)[Purification of proteins and peptidesby SDS-PAGE；In：Matsudaira，P.(ed.)A.practical guide toprotein and peptide purification for microsequencing，2ndedition；Academic Press Inc.，San Diego；pp.74-101]所述用无水TFA在40℃处理印迹到PVDF膜上的葡聚糖裂解酶30分钟完成去封闭。得到的序列是TALSDKQTA，它与来自葡聚糖裂解酶1的克隆的序列(SEQ.ID.No.1上从51到59位置的序列)相匹配且表明葡聚糖裂解酶1的N-端残基是N-乙酰苏氨酸。SEQ.ID.No.1的序列位置1到50代表信号序列。A.4. 编码真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的α-1，4
-葡聚糖裂解酶的基因之DNA测序A.4.1. 分子生物学方法
按Saunders(1993)所述并进行下列修改来分离DNA：经ELUTIP-d(Schleicher & Schuell)纯化代替凝胶纯化从DNA中去掉多糖(参考文献：Saunders，G.W.(1993)，Gel purification of redalgal genomic DNA：An inexpensive and rapid method for theisolation of PCR-friendly DNA。Journal of Phycology 29(2)：251-254 and Scheleicher & Schuell：ELUTIP-d.Rapid Methodfor Purification and Concentration of DNA.)A.4.2 PCR
有关DNA分子的制备经过使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(PerkinElmer Cetus，USA)并根据厂家说明书进行，除了Taq聚合酶在后来加入(见PCR循环)且温度循环变成如下：PCR循环：循环次数 ℃ 时间(分)
1 98 5
60 5加入Taq聚合酶和油：
35 94 1
47 2
72 3
1 72 20A.4.3 PCR片段的克隆：
按供应者的说明书将PCR片段克隆进pT7 Blue(来自Novagen)。A.4.4 DNA测序：
使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA测序仪，基本上根据Sanger等(1979)的双脱氧方法测序双链DNA。(参考文献：Sanger.F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467.)。
序列如SEQ.ID.No.s1和2所示。简单地说：SEQ.ID.No.3具有：碱基总数：3267DNA序列组成：850A；761C；871G；785T。SEQ.ID.No.4具有：碱基总数：3276DNA序列组成：889A；702C；856G；829T。A.4.5 文库的筛选：
按照厂家说明书对从Stratagene获得的λZap文库进行筛选，除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml变性鱼精DNA中进行。向杂交溶液中加入32P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次并在1×SSC，0.1％SDS中洗两次。A.4.6 探针
经过用合适的限制性酶消化从pT7 blue载体中分离克隆的PCR片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并以Agarase(BoehringerMannheim)从琼脂糖中纯化该片段。由于该片段仅90-240bp长，在使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或Ready to Go DNA标记试剂盒(Pharmacia)以32P-dCTP标记前，对分离的片段进行连接反应。A.4.7 结果A.4.7.1 编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生：
来自α-1，4-葡聚糖裂解酶的三个重叠的胰酶肽氨基酸序列用于产生混合的寡核苷酸，它可用作PCR引物(见上面给出的序列)。
在第一次PCR扩增中，引物A/B(见上面)用作上游引物，引物C(见上面)用作下游引物。预期PCR产物的大小为71个碱基对。
在第二次PCR扩增中，引物A/B用作上游引物，E用作下游引物。预期PCR产物的大小是161个碱基对。
在第三次PCR扩增中，引物F1(见上面)和F2(见上面)用作上游引物，E用作下游引物。预期PCR产物的大小为238个碱基对。
在2％LMT琼脂糖凝胶上分析PCR产物并从凝胶上切下预期大小的片段，用Agarase(Boehringer Mannheim)处理，克隆进pT7blue载体(Novagen)中并测序。
从第一次和第二次PCR扩增克隆的片段编码与测序的肽相对应的氨基酸(见上面)。第三次扩增的克隆(见上面)与测序的肽仅具有大约87％的同源性。A.4.7.2 用克隆的PCR片段对基因组文库的筛选
用上述克隆进行的文库筛选产生2个克隆。一个克隆含SEQ.ID.No.4的核苷酸序列(基因2)。另一克隆含SEQ.ID.No.3的一些序列(从碱基对1065下游)(基因1)。
以RACE(cDNA末端的迅速扩增)程序(Michael，A.F.，Michael，K.D.& Martin，G.R.(1988).Rroc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8998-99002)使用Gibco BRL的5′race系统获得SEQ.ID.No.3的5′端。根据Collinge等(Collinge，D.B.，Milligan D.E.，Dow，J.M.，Scofield，G.& Daniels，M.J.(1987).Plant Mol Biol 8：405-414)的方法分离总RNA。根据厂商方案，使用1μg总RNA进行5′race。根据厂商方案将第二次扩增的PCR产物克隆进pT7 blue载体。测序3个独立的PCR克隆以弥补PCR错误。
使用下面的寡核苷酸作为上游引物：GCTCTAGAGCATGTTTTCAACCCTTGCG，含序列GL1(即SEQ.ID.No.3)bp 1573-1593的互补序列之引物用作下游引物再进行PCR以便在上述克隆紧接ATG起始密码子之前加入XbaI和NdeI限制性位点。
基因1(即SEQ.ID.No.3)的完整序列的产生经过将该基因的3′端以来自基因组克隆的BamHI-HindIII片段克隆进StratagenepBluescript IIKS+载体中并将PCR产生的该基因的5′端以XbaI-BamHI片段克隆到3′端前来完成。
将基因2以HindIII钝端片段克隆进Stratagene pBluescriptIISK+载体EcoRV位点。经SacI消化，接着重新连接去掉部分3′非翻译序列。经过用HindIII和NarI消化并在下面退火寡核苷酸存在的条件下重新连接在紧靠起始ATG之前导入HindIII和HpaI限制性位点：
AGCTTGTTAACATGTATCCAACCCTCACCTTCGTGG
ACAATTGTACATAGGTTGGGAGTGGAAGCACCGC
在测序的克隆中发现没有内含子。
将克隆1型(SEQ.ID.No.3)与所有10个肽序列进行序列对比显示出100％的相同性。从真菌感染的藻类Gracilariopsislemaneiformis分离的基因编码的两个蛋白质序列的序列对比表现出大约78％的相同性，表明两个基因都编码α-1，4-葡聚糖裂解酶。A.5 GL基因在微生物中的表达
(例如：毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属裂解酶转化子
的分析)
将编码GL的DNA序列导入微生物以生产高比活及高产量的酶。
关于这点，将基因1(即SEQ.ID.No.3)以NotI-HindIII钝端片段(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)克隆进用EcoRI消化且钝端化(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)的毕赤氏酵母表达载体pHIL-D2(含AOX1启动子)中以便在巴斯德毕赤氏酵母中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母表达试剂盒中记载的方案)。
在另一实施方案中，将基因1(即SEQ.ID.No.3)以NotI-HindIII钝端片段(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)克隆进用SmaI消化的曲霉属表达载体pBARMTE1(含Neuroperacrassa的甲基色氨酸抗性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pallet al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol 40 Pages.59-62)。根据Daboussi等(Curr Genet(1989)Vol 15 pp453-456)的方法使用融胞酶Sigma L-2773和融胞酶Sigma L-8012制备原生质体。原生质体的转化按照Buxton等(Gene(1985)Vol 37 pp207-214)记载的方案进行，除了在涂布转化的原生质体时按照Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)阐述的方案但使用0.6％渗压稳定的顶级琼脂糖。
结果表明在转化的巴斯德毕赤氏酵母和黑色曲霉中观察到了裂解酶活性。A.5.1. 一般方法：无细胞提取物的制备：
以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM磷酸钾，pH7.5，含1mM EDTA，和5％甘油)中。使用玻璃珠和Vortex处理破碎细孢。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟后再以20,000×g离心5分钟获得裂解酶提取物(上清液)。
以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶的活性。
将1体积的裂解酶提取物与等体积的4％支链淀粉溶液混合。然后在控制的温度下保温反应混合物，以特定的间隔取样并分析AF。
还使用放射活性方法分析了裂解酶活性。
反应混合物含10μl 14C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃静置过夜，然后在通常的TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。
电泳和Western印迹。
使用8-25％梯度凝胶和PhastSystem(Pharmacia)进行SDS-PAGE。还在PhastSystem半干燥转移单位上进行Western印迹。
产生的抗从青岛(中国)收集的红海藻中纯化的裂解酶之第一抗体以1∶100稀释使用。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗体并以1∶1000稀释使用。I部分：含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析结果：1.培养5天后测定裂解酶活性(根据手册)并证明B系列的所有样 品中的活性在细胞内。 B系列样品 ： 11 12 13 15 26 27 28 29 30 比活性 ： 139 81 122 192 151 253 199 198 150 *比活定义为在含2％(w/v)糖原1％(w/v)甘油，溶于10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)的反应混合物中每mg蛋白质每分钟释放的AF nmol值。反应温度为45℃；反应时间为60分钟。
样品B27的时间过程如下。图1中也提供了该数据。
时间(分)0 10 20 30 40 50 60
比活性 0 18 54 90 147 179 253
试验条件同上，除了时间进行变动。2.Western-印迹分析。
全部样品的CFE显示出具有与天然裂解酶相对应的分子量的带型。
在巴斯德毕赤氏酵母细胞内表达的MC-裂解酶
培养物名称 比活性*
A18 10
A20 32
A21 8
A22 8
A24 6II部分，曲霉属转化子结果：I.培养5天后测定裂解酶活性(基础培养基含0.2％酪蛋白酶促水 解产物)，以碱基3，5-二硝基水杨酸试剂分析。1)培养基的裂解酶活性分析
在生长于含0.2％支链淀粉的培养基中的35个培养物中。5.4+和5.9+的培养基中分别含0.13g AF/升和0.44g/升。结果表明从细胞中分泌了活性裂解酶。在无细胞提取物中也可测量出裂解酶活性。2)无细胞提取物中的裂解酶活性分析。
培养物名称 比活性*
5.4+ 51
5.9+ 148
5.13 99
5.15 25
5.19 37*比活性定义为在25℃时每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol数。+表示加入0.2％的支链淀粉。
结果表明GL的基因1在黑色曲霉细胞内表达。
用转化的E.coli进行实验(使用Qiagen的Qia表达载体试剂盒中的克隆载体pQE30)显示了酶的表达，该酶可被抗从真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis纯化的酶的抗体识别。B. 来源＝真菌B.1. 来自真菌Morchella costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶的
酶纯化和表征B.1.1. 材料和方法：
真菌Morchella costata从美国典型培养物收集中(ATCC)获得。使用ATCC推荐的培养基在摇床中25℃生长真菌。经过滤收获菌丝并用0.9％ NaCl洗涤。
经过匀浆并随后在50mM柠檬酸-NaOH pH6.2(缓冲液A)中在冰上声处理6×3分钟破碎真菌细胞。经过以25,000×g离心40分钟去掉细胞碎片。在该程序中获得的上清液当作无细胞提取物，在8-25％梯度凝胶上分离后用于活性染色和Western印迹。B.1.2. 在β-环糊精Sepharose凝胶分离
将无细胞提取物直接上样到预先用缓冲液A平衡的β-环糊精Sepharose凝胶4B柱(2.6×18cm)上。用3体积的缓冲液A和2体积含1M NaCl的缓冲液A洗柱。用含2％糊精的缓冲液A洗脱α-1，4-葡聚糖裂解酶。汇集活性组分并将缓冲液换成20mM双-tris丙烷-HCl(pH7.0，缓冲液B)。
将活性馏分上样到预先用缓冲液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。用缓冲液B以0.3H NaCl的线型梯度洗脱真菌裂解酶。作为选择，可将β-环糊精Sepharose色谱后获得的裂解酶制品浓缩到150μl并上样到Sepharose 12柱上，在FPLC条件下操作。B.1.3.α-1，4-葡聚糖裂解酶活性试验和测定底物特异性，pH和温度最适值的条件
试验α-l，4-葡聚糖裂解酶活性的反应混合物含10mg/ml支链淀粉和25mM Mes-NaOH(pH 6.0)。
反应在30℃进行30分钟并经过加入3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。室温静置10分钟后在550nm处测定密度。当使用无细胞提取物时向试验混合物中加入10mM EDTA。
试验混合物中的底物支链淀粉可用其它底物取代，反应温度可按说明书中的限定进行变动。
在pH最适值研究中，反应混合物含以10mg/ml溶于40mM缓冲液中的支链淀粉或麦芽四糖。所用的缓冲液是甘氨酸-NaOH(pH 2.0-3.5)，HoAc-NaoAc(pH 3.5-5.5)，Mes-NaOH(pH 5.5-6.7)，Mops-NaOH(6.0-8.0)和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(7.6-9.0)。反应在30℃进行30分钟。在温度最适值研究中，反应条件与上面相同，除了在所有实验中均使用缓冲液Mops-NaOH(pH6.0)。反应温度如说明书所示进行变动。
分别使用8-25％梯度凝胶和pH梯度为3-9的凝胶在PhastSystem(Pharmacia，Sweden)上进行SDS-PAGE，天然-PAGE和等电聚焦。电泳后，根据厂家(Pharmacia)推荐的程序以银染染色凝胶。糖蛋白被适于PhastSystem的PAS染色。为进行活性染色，在自然条件下6℃进行电泳。
电泳后，在1％可溶性淀粉存在的条件下30℃将凝胶保温过夜。经过用I2/KI溶液染色显示真菌裂解酶的活性带。B.1.4. 结果：B.1.4.1. α-1，4-葡聚糖裂解酶的纯化，分子量和等电点。
发现真菌裂解酶吸附到用β-环糊精Sepharose，淀粉和RedSepharose填充的柱子上。以β-环糊精Sepharose 4B凝胶和淀粉填充的柱用于纯化目的。
以该步骤获得的裂解酶制品仅含微量分子量高于真菌裂解酶的污染蛋白质。可经过在Mono Q HR 5/5上进行离子交换色谱或更高效地经过在Superose 12上凝胶过滤去掉杂质。
纯化酶表现为无色且在可见光区不显示光吸收。在SDS-PAGE上估测时测定的分子量是110kDa。
经过在具有pH梯度为3-9的凝胶上等电聚焦测定时纯化的真菌裂解酶显示出等电点为pI 5.4。在自然凝胶电泳中，酶表现为一条单一的带。经活性染色检测时，该带表现为淀粉降解活性。根据从中提取酶的培养物的时间，该酶在自然和等电聚焦凝胶中显示出要么是一条清晰的带，要么是具有相同迁移率和pI的更分散的带。B.1.4.2. 真菌裂解酶催化反应的pH和温度最适值
发现真菌裂解酶催化反应的pH最适值的pH范围在pH5到pH7之间。B.1.4.3. 底物特异性：
纯化的真菌裂解酶降解从麦芽糖到第七糖的麦芽糖类。然而，降解率不同。对麦芽四糖具有最高活性(活性为100％)，接着是麦芽六糖(97％)，麦芽七糖(76％)，麦芽三糖(56％)，对麦芽糖观察到最低活性(2％)。
真菌裂解酶也降解支链淀粉，直链淀粉和糖原(将测定基％)。真菌裂解酶是外切裂解酶而不是内切裂解酶，因为它降解对硝基苯基α-D-麦芽七糖但不降低还原端封闭的对硝基苯基α-D-麦芽七糖。B.1.5. 普通羊肚菌
用于普通羊肚菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶纯化和鉴定的方案与上面用于Morchella costata的方案相同(结果相似)。B.2. 真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸测序：B.2.1. 裂解酶的氨基酸测序：
用溶组织梭状芽孢杆菌内切蛋白酶Arg-C或Lysobacterenzymogenes内切蛋白酶Lys-C(两者都是测序级，购自BoehringerMannheim，德国)消化裂解酶。为了用内切蛋白酶Arg-C进行消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 10M尿素，50mM甲胺，0.1MTris-HCl，pH7.6中。用N2覆盖并加入10μl 50mM DTT和5mMEDTA后，变性蛋白质并在N2条件下50℃还原10分钟。随后加入溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0中的1μg内切蛋白酶Arg-C并在37℃进行消化6小时。为了随后的半胱氨酸诱导，加入12.5μl100mM碘乙酰胺并将溶液在N2条件下黑暗中室温保温15分钟。
为了用内切蛋白酶Lys-C消化，将冻干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。用N2覆盖并加入5μl 45mM DTT后，变性蛋白质并在N2条件下50℃还原15分钟。冷却到室温后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在N2条件下黑暗中室温诱导半胱氨酸15分钟。随后加入90μl水和溶于50μl 50mM麦黄酮和10mM EDTA，pH8.0中的5μg内切蛋白酶Lys-C并在N2条件下37℃消化24小时。
使用溶剂A：0.1％TFA水溶液和溶剂B：0.1％TFA的乙腈溶液在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separations Group；California)上以反相HPLC分离所得的肽。在使用脉冲液体快速循环在Applied Biosystems 476A测序仪上测序前使用相同的溶剂系统在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm；Dr.Ole Schou，NovoNordisk，Denmark)上对选择的肽进行再次色谱。
来自真菌Morchella costata的酶的氨基酸序列资料如图17所示。
来自真菌普通羊肚菌的酶的氨基酸序列资料如图18所示。B.3. 编码真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因之DNA测序B.3.1. 分子生物学方法：
按Dellaporte等(1983-Plant Mol Biol Rep Vol 1 pp19-21)所述分离DNA。B.3.2. PCR
经过使用Gene Amp DNA扩增试剂盒(Perkin Elmer Cetus，USA)并根据厂家说明书进行有关DNA分子的制备，除了Taq聚合酶在后来加入(见PCR循环)且将温度循环改成如下：
PCR循环：
循环次数 C 时间(分)
1 98 5
60 5
加入Taq聚合酶和油：
35 94 1
47 2
72 3
1 72 20B.3.3 PCR片段的克隆：
按照提供者的说明将PCR片段克隆进pT7 Blue(来自Novagen)。B.3.4 DNA测序：
基本上按照Sanger等(1977)的双脱氧方法，使用自动阅读测序试剂盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA测序仪测序双链DNA。(参考文献：Sanger.F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinatinginhibitors。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467)。B.3.5 文库的筛选：
根据厂家说明书对从Stratagene获得的λZap文库进行筛选，除了预杂交和杂交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml变性鱼精DNA中进行。
向杂交溶液中加入32P标记的变性探针。在55℃进行杂交过夜。滤膜在2×SSC，0.1％SDS中洗两次，在1×SSC，0.1％SDS中洗两次。B.3.6 探针
经过用合适的限制性酶消化从pT7 blue载体中分离克隆的PCR片段。经琼脂糖凝胶电泳从载体中分离片段并以Agarase(BoehringerMannheim)从琼脂糖中纯化该片段。由于该片段仅90-240bp长，在使用32P-dCTP，使用Prime-It随机引物试剂盒(Stratagene)或Ready to Go DNA标记试剂盒(Pharmacia)标记前，对分离的片段进行连接反应。B.3.7. 结果B.3.7.1. 编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的产生。
α-1，4-葡聚糖裂解酶的3个重迭的胰酶肽的氨基酸序列(如下面所示)用于产生混合的寡核苷酸，它用作从MC和MV分离的DNA之扩增的PCR引物。Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp Ile Val LysPro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met LysGlu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val TyrAla Gln Gly Ala Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr
在第一次PCR扩增中，引物A1/A2(见下面)用作上游引物，引物B1/B2(见下面)用作下游引物。
引物A1：CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGCT(GATC)AA(GA)GA(CT)AC
引物A2：CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGTT(GA)AA(GA)GA(CT)AC
引物B1：TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GA)CT(GA)TG(GA)TA
引物B2：TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GATC)GA(GA)TG(GA)TA
在2％LMT琼脂糖凝胶上分析PCR产物，从凝胶上切下预期大小的片段并用Agarase(Boehringer Mannheim)处理，克隆进pT7 blue载体(Novagen)中并测序。
从PCR扩增克隆的片段编码与测序的肽(见上面)相对应的氨基酸并在每个例子中增加了2个内含子序列。对于MC，PCR扩增的DNA序列与参照图14从位置1202到位置1522所示的序列相对应。对于MV，PCR扩增的DNA序列与参照图15中从位置1218到位置1535所示的序列相对应。B.3.7.2 用克隆的PCR片段对基因组文库进行筛选。
对于每种来源，用上述克隆对文库的筛选产生2个克隆。对于MC，两个克隆接合形成图14所示的序列(见下面)。对于MV，以上面描述的方式可结合两个克隆形成图15所示的序列。
为了在MC克隆中紧接ATG起始密码子之前加入PstI，PvuII，AscI和NcoI限制性位点，使用下面的寡核苷酸作为上游引物：AAACTGCAGCTGGCGCGCCATGGCAGGATTTTCTGAT含图4 bp1297-1318的互补序列的引物作为下游引物再进行一次PCR。
经过将基因5′端以来自基因组克隆之一(第一克隆)的BglII-EcoRI片段克隆进Stratagene pBluescript II KS+载体的BamHI-EcoRI位点产生MC的完整序列。用EcoRI和EcoRV消化修饰的pBluescript II KS+载体后经过连接来自另一基因组克隆(第二克隆)的NspV(已钝端化，使用Amersham International DNA钝端试剂盒)-EcoRI片段将该基因的3′端克隆进修饰的pBluescript IIKS+载体中。然后，将该基因的中间部分片段以来自第一克隆的EcoRI片段的形式克隆进进一步修饰的pBluescript II KS+载体中，这经过将该片段连接到用EcoRI消化的进一步修饰的pBluescript IIKS+载体中实现。B.4. GL基因在微生物中的表达
可将编码GL的DNA序列导入微生物中以便生产高比活和高产量的该酶。
关于这点，将MC基因(图14)以XbaI-XhoI钝端化(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)片段克隆进用EcoRI消化且钝端化(使用Amersham International的DNA钝端试剂盒)的毕赤氏酵母属表达载体pHIL-D2(含AOX1启动子)中以便在 巴斯德 毕赤氏酵母中表达(根据Invitrogen提供的毕赤氏酵母属表达试剂盒中记载的方案)。
在另一实施方案中，将MC基因1(与图14相同，除了按上述经PCR导入限制性位点进行修饰)以Pvu II-Xho I钝端化片段(使用Amersham International DNA钝端试剂盒)克隆进用SmaI消化的曲霉属表达载体pBARMTE1(含来自Neuropera crassa的甲基色氨酸抗性启动子)中以便在黑色曲霉中表达(Pall et al(1993)FungalGenet Newslett.Vol 40 pages 59-62)。根据Daboussi等(CurrGenet(1989)Vol 15 pp453-456)使用溶胞酶Sigma L-2773和溶胞酶Sigma L-8012制备原生质体。接着根据Buxton等(Gene(1985)Vol 37 pp207-214)记载的方案进行原生质体的转化，除了涂布转化的原生质体按照Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)阐述的方案进行但使用0.6％等渗稳定的顶级琼脂糖。
结果表明在转化的巴斯德毕赤氏酵母和黑色曲霉中观察到裂解酶活性。
毕赤氏酵母属裂解酶转化子和曲霉属
裂解酶转化子的分析一般方法：无细胞提取物的制备：
以9000rpm离心5分钟收获细胞，用0.9％NaCl洗涤并重悬于破碎缓冲液(50mM磷酸钾，pH7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中。使用玻璃珠和vortex处理破碎细胞。破碎缓冲液含1mM PMSF(蛋白酶抑制剂)。以9000rpm离心5分钟，接着以20,000×g离心5分钟获得裂解酶提取物(上清液)。
以碱性3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS)试验裂解酶活性。
将1体积的裂解酶提取物与等体积4％支链淀粉溶液混合。然后在控制的温度下保温反应混合物，以限定的时间间隔取样并分析AF。
也使用放射活性方法分析了裂解酶活性。
反应混合物含10μl 14C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反应混合物在25℃静置过夜，然后在通常的TLC系统中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc.，Meriden，CT)检测产生的放射活性AF。
电泳和Western印迹
使用8-25％梯度凝胶和PhastSystem(Pharmacia)进行SDS-PAGE。也在PhastSystem的半干燥转移单位上进行了Western印迹。产生的抗从青岛(中国)收集的红海藻中纯化的裂解酶之第一抗体以1∶100稀释使用。与碱性磷酸酶连接的猪抗兔IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗体并以1∶1000稀释使用。I部分，含上述构建体的毕赤氏酵母属转化子的分析
在巴斯德毕赤氏酵母细胞内表达的MC-裂解酶
培养物名称 比活性*
A18 10
A20 32
A21 8
A22 8
A24 6*比活性定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值。II部分：曲霉属转化子结果：I.培养5天后(含0.2％酪蛋白酶促水解产物的基础培养基)以碱 性3，5-二硝基水杨酸试剂分析来测定裂解酶活性：无细胞提取物中的裂解酶活性分析：
培养物名称 比活性*
8.13 11
8.16 538
8.19 37*比活性定义为在25℃下每mg蛋白质每分钟产生的AF nmol值。
结果表明：在黑色曲霉细胞内表达MC-裂解酶。II，以放射活性方法试验裂解酶活性
下列培养物的无细胞提取物含14C标记的AF。51+，54+，55+，59+，512，513，514，515，516，518，519。
使用14C-淀粉作底物的α-1，4-葡聚糖裂解酶反应之降解产物的TLC如图20所示。将反应混合物上样到TLC上。泳道号与培养物名称相对应：1，512；2，513；3，514；4，515；5，516；6，517；7，518；8，519；9，520。快速移动点是AF。C.来源＝藻类本身
用于酶纯化和从Gracilariopsis lemaneiformis(从Santa Cruz获得)获得的α-1，4-葡聚糖裂解酶的鉴定之方案基本上与上面所述的方案(例如，用于Morchella costata的方案)相同(结果相似)。1.从加利福利亚收集的无寄生物的红海藻Gracilariopsis lemaneiformis的α-1，4-葡聚糖裂解酶的鉴定裂解酶的氨基酸组成在下表中给出：
氨基酸残基 每种残基的mol％
Asx 15.42
Thr 5.24
Ser 6.85
Glx 9.46
Pro 5.46
Gly 9.08
Ala 5.38
1/2Cys 1.57
Val 6.60
Met 2.90
Ile 3.66
Leu 6.00
Tyr 6.00
Phe 4.37
His 1.65
Lys 4.44
Arg 4.17
Trp 1.75
总计： 100.002.序列分析：
比较来自加利福利亚藻类的肽序列与来自中国真菌感染的藻类的氨基酸序列表明两蛋白质序列之间显示出高度同源性(从PCR片段产生的氨基酸序列与中国藻类GL的相应序列之间有78％到80％的相同性)。
从加利福利亚藻类的两个序列产生了3个寡核苷酸以产生大约970bp的PCR片段。
引物1：ATGAC(GATC)AA(CT)TA(CT)AA(CT)TA(CT)GA(CT)AA
引物2：(AG)TG(GATC)GGCATCAT(GATC)GC(GATC)GG(GATC)AC
引物3：GTCAT(GA)TC(CT)TGCCA(GATC)AC(GA)AA(GA)TC
在第一次PCR扩增中引物1用作上游引物，引物2用作下游引物。在第二次PCR扩增中，引物1用作上游引物，引物3用作下游引物。产生了一个预期大小的PCR片段并将它克隆进Novagen pT 7 blue载体中。测序了含PCR片段的3个独立的质粒，可见这三个克隆的PCR片段含来自3个不同蛋白质的肽序列的密码子。这表明在加利福利亚藻类中至少有3种不同的编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。3.在达到最大速度一半时的底浓度对支链淀粉是3.76mg/ml，对糖原是3.37mg/ml。
4.下面给出了裂解酶对各种底物的降解率：
底物 释放的AF(nmol)
麦芽糖 657
麦芽三糖 654
麦芽四糖 670
麦芽五糖 674
麦芽六糖 826
麦芽七糖 865
糊精 20 775
糊精 15 775
糊精 10 844
支链淀粉 732
糖原 592
反应条件：反应混合物含10mM HOAc-NaOAc(pH3.8)。底物浓度是10mg/ml。加入裂解酶和水后的终体积是100μl。在45℃下的反应时间为40分钟。
裂解酶不能降解出芽短梗孢糖，黑曲霉四糖，海藻糖，异麦芽糖，葡萄糖，α-，β-和γ-环糊精。裂解酶降解6-α-葡糖基麦芽糖和nigerose，尽管其降解速率缓慢。5.当使用支链淀粉作底物时裂解酶的温度最适值为48℃，当使用糖原作底物时为50℃。在50℃时，糖原反应性与支链淀粉相似；在50℃以下，支链淀粉是比糖原更好的底物。6.裂解酶的pH最适值范围在pH3.5和pH7.0之间；最适pH为3.8。在pH试验中所用的缓冲液是甘氨酸-HCl(pH 2.2-3.6)；NaOAc-HOAc(pH 3.5-5.5)；Mes-NaOH(pH 5.5-6.7)；Mops-NaOH(pH 6.0-8.0)和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH 7.6-9.0)。所用的全部缓冲液是40mM。7.终浓度为2mM时，对氯汞苯甲酸(PCMB)抑制96％的裂解酶活性，表明-SH基团对酶活性是必需的。
7.进一步的研究7.1 醇类在增加从真菌感染的藻类中纯化的裂解酶活性和稳定性中
的影响。
以下面浓度(0％，1％，5％和10％)试验了1-丙醇，2-丙醇和1-丁醇。1-丙醇的最佳浓度为5％，保温6天后可增加34％的AF产率；2-丙醇的最佳浓度1％，保温10天后可增加20％的AF产率；1-丁醇的最佳浓度5％，保温3天后增加52％的AF产率。
以下列浓度(0，1，3，5，7，9，11，13，15％)试验了乙醇。保温7天后的最佳浓度为5％，它能增加12％的AF产率。对于10天保温，最佳浓度为3％，它能增加16％的AF产率。1-丙醇的影响：1-丙醇浓度 反应时间(天)(v/v) 0 1 3 6 10
AF产量(μmol)0％ 0 84 261 451 6891％ 0 80 280 530 8035％ 0 115 367 605 85310％ 0 107 307 456 5837.2. 不同反应介质对真菌感染的藻类纯化的裂解酶和M.costata
及普通羊肚菌的真菌裂解酶产生AF的影响。2.1. 来自真菌感染的藻类的裂解酶
结果(见下表)表明：最佳反应介质是5mM的HOAc-NaOAc(pH3.9)(BACE for short)和含mM浓度的Na2-EDTA。使用纯水或0.85％NaCl作反应介质的AF生产减小了产率。在BACE中含有0.85％NaCl时也减少AF产率。反应介质 反应时间(天)
U 1 3 8
AF产量(μmol)BACE 0 229 498 575水 0 46 128 217NaCl(0.85％) 0 123 239 249BACE+NaCl(0.85％) 0 153 281 3032.2. 下列缓冲液：Mes-NaOH，Mops-NaOH，Hepes-NaOH，和N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH是M.costata和普通羊肚菌裂解酶的最适反应介质。在HOAc-NaOAc缓冲液中，裂解酶不稳定，因此使用该缓冲系统引起AF产率减少。7.3. 内切淀粉酶和脱支酶对AF生产的影响3.1. 内切淀粉酶的影响
用于AF生产的淀粉可首先经内切淀粉酶或经酸水解液化。
与天然淀粉相比，内切淀粉酶降解的淀粉更适于作裂解酶的底物。在用于裂解酶催化的反应的温度下，淀粉具有有限的溶解力。用内切淀粉酶处理淀粉导致葡萄糖产量增加。关于AF生产，发现还原物质为大约10-15％(根据干物质)时最适于作为裂解酶底物，而用内切淀粉酶进一步处理成19％的还原物质时不再适合于裂解酶。3.2. 支链淀粉酶和异淀粉酶的影响。
从下面结果可见，在pH4.5和5.0时异淀粉酶和支链淀粉酶都增加AF产率达50％。反应系统由加入或不加异淀粉酶或支链淀粉酶(MegaZyme Ltd.)的真菌感染的红藻裂解酶组成。支链淀粉用作底物。在仅有裂解酶存在的条件下产生的AF表达为100％
反应介质的pH
加入的酶 3.5 4.5 5.0
仅有裂解酶 100 100 100
裂解酶+异淀粉酶 136 152 150
裂解酶+支链淀粉酶 132 158 1554. 真菌裂解酶对各种底物的有关降解率4.1. M.costata裂解酶用麦芽四糖观察到的活性表达为100％。底物浓度 2mg/ml 4mg/ml 10mg/ml麦芽糖 0.5 1.6 2.2麦芽三糖 40.6 58.6 56.0麦芽四糖 100 100 100麦芽五糖 107.1 100.1 99.7麦芽六糖 86.6 98.2 95.9麦芽七糖 82.2 81.5 75.7糊精10* -** - 68.3糊精15* - - 61.1糊精20* - - 46.6可溶性淀粉 - - 92.9支链淀粉 - - 106.5糖原 - - 128.5* 数字表示还原物质的干重含量。**，未检测到。4.2.普通羊肚菌裂解酶
用麦芽四糖观察到的活性处理为100％。全部底物的终浓度为10mg ml-1。
底物 活性(％)
麦芽糖 10.1
麦芽三糖 49.8
麦芽四糖 100.0
麦芽五糖 79.3
麦芽六糖 92.4
麦芽七糖 73.9
糊精10 62
糊精15 45
糊精20 37
可溶淀粉 100.5
支链淀粉 139.9
糖原 183.3
来自M.costata和普通羊肚菌的裂解酶不能降解下列糖类。
对于海藻糖，6-α-葡糖基麦芽糖，nigerose，黑曲霉四糖，葡萄糖，异麦芽糖，α-，β-和γ-环糊精，出芽短梗孢糖和非还原端封闭的对硝基苯基α-D-麦芽七糖，将这些底物与真菌裂解酶保温48小时后，在TLC板上检测不到AF。7.5. 裂解酶催化反应的pH和温度最适值：GL来源 最适pH 最适pH范围 最适温度M.costata 6.5 5.5-7.5 37℃；40℃a普通羊肚菌 6.4 5.9-7.6 43℃；48℃a真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis 3.8 3.7-4.1 40℃；45℃aa使用糖原作底物测定的参数；使用支链淀粉作底物测定其它参数。7.6. 糖原对真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的裂解酶
的稳定影响。
结果表明当使用糖原作底物代替支链淀粉时，温度越高，反应率越高。
反应温度底物 25℃ 30℃ 45℃支链淀粉 0.818a 1.133a 1.171a糖原 0.592a 0.904a 1.861a糖原和支链淀粉之间相对反应率的比率(％)
72.4 79.8 158.9a，相对反应率7.7. 裂解酶的分子量和pI值：
使用SDS-PAGE在梯度凝胶(8-25％)上估测真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶，明显无真菌的G.lemaneiformis裂解酶的两种形式，M.costata和普通羊肚菌裂解酶的分子量为110,000±10,000道尔顿。
真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶的pI为大约3.9。对于普通羊肚菌裂解酶，pI为大约pH4.6，M.costata裂解酶的pI为大约5.0。这些值经过在具有pH梯度从3到9的凝胶上等电聚焦获得。
从氨基酸组成推断的pI值：真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶为4.58，M.costata裂解酶为6.30。7.8. 经Western印迹对裂解酶进行免疫学试验。
结果表明：以Western印迹揭示了抗藻类裂解酶的抗体可识别无细胞提取物中和纯化形式的真菌裂解酶。抗从中国收集的藻类的藻类裂解酶纯化形式的抗体也识别从加利福利亚Sant Cruz收集的藻类的裂解酶。GL来源 与抗真菌感染的G.lemaneiformis
GL抗体的反应性真菌感染的G.lemaneiformis 强烈加利福利亚G.lemaneiformis的GL两种形式 强烈M.costata 中等普通羊肚菌 中等7.9. 真菌裂解酶的可逆的和不可逆的抑制剂9.1. 可逆的抑制剂，葡萄糖和麦芽糖。
当使用支链淀粉作底物时，在10mg/ml的底物浓度下，当存在0.1M葡萄糖时，M.costata裂解酶活性减小19.3％；当使用糖原作底物时，活性不受影响。在0.1M麦芽糖存在的条件下对糖原和支链淀粉基活性分别减小48.8％和73.4％。底物浓度 抑制剂
葡萄糖 麦芽糖支链淀粉1％(2％) 19.3％(7％) 73.4％(67.2％)糖原1％(2％) 0.000(-) 48.8％(49.7％)
似乎0.1M葡萄糖的抑制是竞争性的，因为随着底物从1％增加到2％，抑制从19.3％减小到7％，而0.1M麦芽糖的抑制是非竞争性的，因为底物的增加不明显影响抑制程度。
对于普通羊肚菌裂解酶，当使用支链淀粉或糖原作底物时，0.1M葡萄糖和麦芽糖不抑制反应。底物 葡萄糖 麦芽糖支链淀粉(1％) 28％ 80％糖原(1％) 5％ 57％9.2. 可逆的抑制剂deoxyjirimycin
使用支链淀粉作底物，在最终底物浓度为2％时，25μMdeoxyjirimycin的存在使藻类裂解酶和M.costata裂解酶活性减小10.4％。在100μM时，两种裂解酶的活性完全丧失。9.3. 不可逆抑制剂：PCMB
在相同的试验条件下，当存在2mM PCMB时，M.costata裂解酶活性减小60％，真菌感染的红藻裂解酶减小98％。这意味着真菌裂解酶对重金属抑制的敏感性小得多。7.10. 实验室规模生产AF的实施例
反应器含1000g糊精(经过用Termamyl将淀粉处理成最终还原物为10％获得)，终体积为4.6升(HOAC-NaOAc，pH3.9，含5mMNa2-EDTA)。经过加入3mg从真菌感染的藻类纯化的裂解酶。反应在室温下进行。在第19天，加入另一批裂解酶(4mg)。反应时间(天)
0 1 7 13 19 24 31产生的AF(克)
0 18 116 195 264 500 66810.2. 使用14C-淀粉产生14C-AF
将不均匀标记的14C-淀粉(340μCi，从Sigma获得)真空干燥以去掉其包含的乙醇，然后溶于2ml水中。经过加入20μl从真菌感染的藻类纯化的裂解酶和20μl支链淀粉酶(MegaZyme Ltd.)起动反应。反应在30℃下进行过夜。在反应中止时，使用截留分子量为10,000的滤膜过滤反应混合物以去掉酶和未反应的淀粉分子。
使用Waters HPLC在Ca2碳水化合物柱(Chrompack)上进行过滤。使用水作洗脱液。流速为0.5ml/分。AF可有效地从葡萄糖和麦芽糖中分离出来。合并的AF馏分冻干，获得总共140μCi 14C-AF。
这些发现涉及本发明更进一步的方面，称为可增加反应介质(优选醇类)疏水性的试剂在增强根据本发明的裂解酶的稳定性和活性中的应用。这种增强的稳定性导致AF产率增加。
对于本领域的技术人员而言，不偏离本发明的范围而对本发明进行的其它修改将是显而易见的。
序列描述(1)一般资料：
(i)申请人：
(A)名称：DANISCO A/S
(B)街道：Langebrogade 1
(C)城市：哥本哈根
(D)州：哥本哈根K
(E)国家：丹麦
(F)邮编(编码)：DK-1001
(ii)发明题目：酶的应用
(iii)序列数：39
(iv)计算机可读形式：
(A)媒体类型：Floppy盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)
(v)当前申请资料：
申请号：WO PCT/EP94/03397(2)SEQ ID NO：1资料：
(i)序列特征：
(A)长度：1088个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Phe Ser Thr Leu Ala Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Ser1 5 10 15Thr Phe Val Gly Ala Glu Val Arg Ser Asn Val Arg Ile His Ser Ala
20 25 30Phe Pro Ala Val His Thr Ala Thr Arg Lys Thr Asn Arg Leu Asn Val
35 40 45Ser Met Thr Ala Leu Ser Asp Lys Gln Thr Ala Thr Ala Gly Ser Thr
50 55 60Asp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Tyr Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Gly Val65 70 75 80Trp Gly Phe Ser Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly Ser
85 90 95Ser Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val Asn
100 105 110Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Ile Thr Val Gln His Pro Val Gln
115 120 125Val Gln Val Thr Ser Tyr Asn Asn Asn Ser Tyr Arg Val Arg Phe Asn
130 135 140Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Thr Arg Gly Pro Ile Leu Lys Gln145 150 155 160Gln Leu Asp Trp Ile Arg Thr Gln Glu Leu Ser Glu Gly Cys Asp Pro
165 170 175Gly Met Thr Phe Thr Ser Glu Gly Phe Leu Thr Phe Glu Thr Lys Asp
180 185 190Leu Ser Val Ile Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg Lys
195 200 205Ser Asp Gly Lys Val Ile Met Glu Asn Asp Glu Val Gly Thr Ala Ser
210 215 220Ser Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr Gly225 230 235 240Asn Ala Ile Ala Ser Val Asn Lys Asn Phe Arg Asn Asp Ala Val Lys
245 250 255Gln Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Lys Tyr Gln Asp
260 265 270Thr Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr
275 280 285Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Trp Asp Leu Arg Pro Pro His His Asp
290 295 300Gly Ala Leu Asn Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr Tyr Ala Ala Pro305 310 315 320Trp Leu Ile Val Asn Gly Cys Ala Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Tyr
325 330 335Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met Asn Thr Gly Asp
340 345 350Thr Thr Trp Asn Ser Gly Gln Glu Asp Leu Ala Tyr Met Gly Ala Gln
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(A)长度：317个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：肽 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰位点
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(A)长度：323个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：肽 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的位点
(B)位置：272
(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸” (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的位点
(B)位置：273
(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸” (ix)特征：
(A)名称/键：修饰的位点
(B)位置：274
(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸” (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Tyr Asn Tyr Asn Gln Ser Asp Leu1 5 10 15Ile Ala Pro Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Phe Tyr Ile Pro Met Tyr
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260 265 270Xaa Xaa Tyr Ile Gly His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Cys Asp
275 280 285Ala Leu Phe Pro Asp Trp Gly Arg Pro Gly Val Ala Glu Trp Trp Gly
290 295 300Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Phe Lys Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln305 310 315 320Asp Met Thr (2)SEQ ID NO：11资料： (i)序列特征：
(A)长度：202个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：肽 (ix)特征：
(A)名称/键：修饰位点
(B)位置：43
(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸” (ix)特征：
(A)名称/键：修饰位点
(B)位置：176
(D)其它资料：/注＝“X是misc氨基酸” (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Pro Asp Val1 5 10 15Val Pro Pro Gly Tyr His Asp His Pro Asn Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr
20 25 30Tyr Ala Ala Pro Trp Leu Val Val Gln Gly Xaa Ala Gly Thr Ser Lys
35 40 45Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met
50 55 60Asn Thr Gly Asp Thr Ala Trp Asn Cys Gly Gln Glu Asn Leu Ala Tyr65 70 75 80Met Gly Ala Gln Tyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Asp
85 90 95Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Lys Ala Phe Ser Phe Leu Gln Gly
100 105 110Lys Glu Phe Glu Asp Lys Lys Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro
115 120 125Lys Tyr Val Phe Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Ala Leu Ser Leu
130 135 140Leu Lys Gln Asn Leu Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Gln Glu145 150 155 160Ile Val Glu Gly Tyr Gln Asp Asn Asp Tyr Pro Phe Glu Gly Leu Xaa
165 170 175Val Asp Val Asp Met Gln Asp Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr Lys Pro
180 185 190Glu Tyr Trp Ser Ala Asn Met Val Gly Glu
195 200(2)SEQ ID NO：12资料： (i)序列特征：
(A)长度：953个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(573，″″)
(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(601，″″)
(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸” (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：ATGACAAACT ATAATTATGA CAATTTGAAC TACAATCAAC CGGACCTCAT CCCACCTGGC 60CATGATTCAG ATCCTGACTA CTATATTCCG ATGTACTTTG CGGCACCATG GGTGATCGCA 120CATGGATATC GTGGCACCAG CGACCAGTAC TCTTATGGAT GGTTTTTGGA CAATGTATCC 180CAGTCCTACA CAAACACTGG CGATGATGCA TGGGCTGGTC AGAAGGATTT GGCGTACATG 240GGGGCACAAT GTGGGCCTTT CGATCAACAT TTTGTGTATG AGGCTGGAGA TGGACTTGAA 300GACGTTGTGA CCGCATTCTC TTATTTGCAA GGCAAGGAAT ATGAGAACCA GGGACTGAAT 360ATACGTTCTG CAATGCCTCC GAAGTACGTT TTCGGATTTT TCCAAGGCGT ATTCGGAGCC 420ACATCGCTGC TAAGGGACAA CTTACCTGCC GGCGAGAACA ACGTCTCTTT GGAAGAAATT 480GTTGAAGGAT ATCAAAATCA GAACGTGCCA TTTGAAGGTC TTGCTGTGGA TGTTGATATG 540CAAGATGACT TGAGAGTGTT CACTACGAGA CCGGCGTTTT GGACGGCAAA CAAGGTGGGG 600GAAGGCGGTG ATCCAAACAA CAAGTCAGTG TTTGAGTGGG CACATGACAG GGGCCTTGTC 660TGCCAGACGA ATGTAACTTG CTTCTTGAAG AACGAGAAAA ATCCTTACGA AGTGAATCAG 720TCATTGAGGG AGAAGCAGTT GTATACGAAG AGTGATTCCT TGGACAACAT TGATTTTGGA 780ACTACTCCAG ATGGGCCTAG CGATGCGTAC ATTGGACACT TAGACTACGG TGGTGGTGTG 840GAGTGTGATG CACTATTCCC AGACTGGGGT CGACCAGACG TGGCTCAATG GTGGGGCGAT 900AACTACAAGA AACTATTCAG CATTGGTCTC GACTTCGTAT GGCAAGACAT GAC 953(2)SEQ ID NO：13资料： (i)序列特征：
(A)长度：969个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(814..821，″″)
(D)其它资料：/注＝“每个在(且包括)814和821之
间的g是misc核酸” (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：ATGACAAACT ACAACTACGA CAACTATAAC TACAACCAGT CAGATCTTAT TGCTCCAGGA 60TATCCTTCCG ACCCGAACTT CTACATTCCC ATGTATTTTG CAGCACCTTG GGTAGTTGTT 120AAGGGATGCA GTGGCAACAG CGATGAACAG TACTCGTACG GATGGTTTAT GGATAATGTC 180TCCCAAACTT ACATGAATAC TGGTGGTACT TCCTGGAACT GTGGAGAGGA GAACTTGGCA 240TACATGGGAG CACAGTGCGG TCCATTTGAC CAACATTTTG TGTATGGTGA TGGAGATGGT 300CTTGAGGATG TTGTCCAAGC GTTCTCTCTT CTGCAAGGCA AAGAGTTTGA GAACCAAGTT 360CTGAACAAAC GTGCCGTAAT GCCTCCGAAA TATGTGTTTG GTTACTTTCA GGGAGTCTTT 420GGGATTGCTT CCTTGTTGAG AGAGCAAAGA CCAGAGGGTG GTAATAACAT CTCTGTTTCA 480GAGATTGTCG AAGGTTACCA AAGCAATAAC TTCCCTTTAG AGGGGTTAGC CGTAGATGTG 540GATATGCAAC AAGATTTGCG GTGTAGTTCA CCACTGAAGA TTGAATTTTG GACGGCAAAT 600AAGGTAGGCA CCGGGGGAGA CTCGAATAAC AAGTCGGTGT TTGAATGGGC ACATGACAAA 660GGCCTTGTAT GTCAGACGAA TGTTACTTGC TTCTTGAGAA ACGACAACGG CGGGGCAGAT 720TACGAAGTCA ATCAGACATT GAGGGAGAAG GGTTTGTACA CGAAGAATGA CTCACTGACG 780AACACTAACT TCGGAACTAC CAACGACGGG CCGGGGGGGG GGTACATTGG ACATCTGGAC 840TATGGTGGCG GAGGGAATTG TGATGCACTT TTCCCAGATT GGGGTCGACC GGGTGTGGCT 900GAATGGTGGG GTGATAACTA CAGCAAGCTC TTCAAAATTG GTCTGGACTT CGTGTGGCAA 960GATATGACA 969(2)SEQ ID NO：14资料： (i)序列特征：
(A)长度：607个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(128，″″)
(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(232，″″)
(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(249，″″)
(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(526，″″)
(D)其它资料：/注＝“g是misc核酸” (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：ATGACAAACT ACAATTACGA CAACTTGAAC TACAACCAAC CAGACGTCGT TCCTCCAGGT 60TATCACGACC ATCCCAACTA CTACATTCCA ATGTACTACG CAGCACCGTG GTTGGTCGTT 120CAGGGATGCG CGGGGACATC GAAGCAATAC TCGTACGGTT GGTTTATGGA CAATGTCTCT 180CAGTCGTACA TGAACACTGG AGATACGGCG TGGAACTGCG GACAGGAAAA CGTGGCATAC 240ATGGGCGCGC AATACGGGCC ATTTGATCAG CACTTTGTGT ATGGTGATGG AGATGGCCTT 300GAAGATGTCG TCAAAGCGTT CTCCTTTCTT CAAGGAAAGG AGTTCGAAGA CAAAAAACTC 360AACAAGCGTT CTGTAATGCC TCCGAAGTAC GTGTTTGGTT TCTTCCAGGG TGTTTTCGGT 420GCACTTTCAC TGTTGAAGCA GAATCTGCCT GCCGGAGAGA ACAACATCTC AGTGCAAGAG 480ATTGTGGAGG GTTACCAGGA TAACGACTAC CCCTTTGAAG GGCTCGCGGT AGATGTTGAT 540ATGCAAGATG ATCTGCGAGT GTTTACTACC AAACCAGAAT ATTGGTCGGC AAACATGGTA 600GGCGAAG 607(2)SEQ ID NO：15资料： (i)序列特征：
(A)长度：90个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：15： Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala 1 5 10 15 Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser
20 25 30 Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp
35 40 45 Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu
50 55 60 Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro 65 70 75 80 Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala
85 90(2)SEQ ID NO：16资料： (i)序列特征：
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(21，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (xi)序列描述：SEQ ID NO：16：ATGTANAANA ANGANTCNAA NGT 23(2)SEQ ID NO：17资料： (i)序列特征：
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(21，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：ATGTANAANA ANGANAGNAA NGT 23(2)SEQ ID NO：18资料： (i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(3，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (xi)序列描述：SEQ ID NO：18：TANCCNTCNT GNCCNCC 17(2)SEQ ID NO：19资料： (i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(3，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或R” (xi)序列描述：SEQ ID NO：19：GGNCCNAANT TNTACCANTG 20(2)SEQ ID NO：20资料： (i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(3，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (xi)序列描述：SEQ ID NO：20：TANCGNTGGC ANGANGT 17(2)SEQ ID NO：21资料： (i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(3，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：TANAGNTGGC ANGANGT l7(2)SEQ ID NO：22资料： (i)序列特征：
(A)长度：71个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：22：ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGCGGC 60CACGACGGTT A 71(2)SEQ ID NO：23资料： (i)序列特征：
(A)长度：23个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：23： Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly His Asp Gly
20(2)SEQ ID NO：24资料： (i)序列特征：
(A)长度：160个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：24：ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGTGGA 60CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGG AGAATTCGAC CGAACGGAAT 120TGTACTTGCC CGTGCTGACC CAATGGTACA AATTCGGCCC 160(2)SEQ ID NO：25资料： (i)序列特征：
(A)长度：54个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：25： Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val
20 25 30 Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln
35 40 45 Trp Tyr Lys Phe Gly Pro
50(2)SEQ ID NO：26资料： (i)序列特征：
(A)长度：238个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGA ATGCGGCTTT CGGGAAACCG 60ATTATCAAGG CAGCTTCCAT GTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGAC 120CACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGT GTGCACCTGT TGTGTGGGAG 180AATACAACCA GTCGCGATCT GTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCC 238(2)SEQ ID NO：27资料： (i)序列特征：
(A)长度：79个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：27： Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala 1 5 10 15 Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg
20 25 30 Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp
35 40 45 Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr Thr Ser
50 55 60 Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe Gly 65 70 75(2)SEQ ID NO：28资料： (i)序列特征：
(A)长度：28个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：28：GCTCTAGAGC ATGTTTTCAA CCCTTGCG 28(2)SEQ ID NO：29资料： (i)序列特征：
(A)长度：36个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (xi)序列描述：SEQ ID NO：29：AGCTTGTTAA CATGTATCCA ACCCTCACCT TCGTGG 36(2)SEQ ID NO：30资料： (i)序列特征：
(A)长度：34个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (xi)序列描述：SEQ ID NO：30：ACAATTGTAC ATAGGTTGGG AGTGGAAGCA CCGC 34(2)SEQ ID NO：31资料： (i)序列特征：
(A)长度：75个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：31： Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp 1 5 10 15 Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly
20 25 30 Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe
35 40 45 Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser
50 55 60 Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr 65 70 75(2)SEQ ID NO：32资料： (i)序列特征：
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(3，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(21，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (xi)序列描述：SEQ ID NO：32：CANCANAANA TGCTNAANGA NAC 23(2)SEQ ID NO：33资料： (i)序列特征：
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(3，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(21，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (xi)序列描述：SEQ ID NO：33：CANCANAANA TGTTNAANGA NAC 23(2)SEQ ID NO：34资料： (i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(3，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (xi)序列描述：SEQ ID NO：34：TANAANGGNT CNCTNTGNTA 20(2)SEQ ID NO：35资料： (i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(3，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (xi)序列描述：SEQ ID NO：35：TANAANGGNT CNGANTGNTA 20(2)SEQ ID NO：36资料： (i)序列特征：
(A)长度：37个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (xi)序列描述：SEQ ID NO：36：AAACTGCAGC TGGCGCGCCA TGGCAGGATT TTCTGAT 37(2)SEQ ID NO：37资料： (i)序列特征：
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(12，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(21，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (xi)序列描述：SEQ ID NO：37：ATGACNAANT ANAANTANGA NAA 23(2)SEQ ID NO：38资料： (i)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(1，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是A或G” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(4，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(13，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(16，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(19，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (xi)序列描述：SEQ ID NO：38：NTGNGGCATC ATNGCNGGNA C 21(2)SEQ ID NO：39资料： (i)序列特征：
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：线型 (ii)分子类型：cDNA (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(6，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(9，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是C或T” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(15，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A或T或C” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(18，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (ix)特征：
(A)名称/键：misc＿区别
(B)位置：置换(21，″″)
(D)其它资料：/注＝“N是G或A” (xi)序列描述：SEQ ID NO：39：GTCATNTCNT GCCANACNAA NTC 23
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCT Rule 13bis)
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(PCT Rule 13bis)
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(PCT Rule 13bis)