产生以温度调节方式表达蛋白的细菌的培养方法 本发明涉及培养细菌的方法。更确切地说，本发明与培养质粒中带有基因的细菌有关，质粒中所带基因编码表面或膜结合抗原或其它蛋白，并且以温度调节的方式表达来生产需要的细菌产物。
背景
细菌和病毒常常在它们的膜上或在膜内表达蛋白，此蛋白在某种环境下起生物体的支持物的作用，使其以特定的方式与表面连接或粘附。此表面可以是胃肠道的内壁、食道、人类或动物体内任何其它生物学的表面或膜，在此生物体可以找到最佳的环境来生长。这种膜蛋白常被命名为移居(colonization)因子抗原(CFA)或菌毛(fimbriae)。文献中，其它一些词，象伞毛(pili)、血细胞凝集素、菌丝(filamentous)或纤丝(fibrillar)蛋白指的是同一种物质。为方便，此处使用“CFA”包括所有这些也具有抗原特性的膜蛋白。
一些具有医学重要性的细菌已显示出产生与它们的膜有关地CFAs。其中那些对人类最为重要的是移居于人胃肠道和呼吸导气管的生物体。移居胃肠道的微生物例子有产肠毒素的大肠杆菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、Campylobacter、志贺杆菌属、沙门氏菌属和Yersinia。
特别具有医学重要性的是产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)，因为它是造成发展中国家儿童腹泻的主要原因，是超过10亿次腹泻发作的原因，每年至少1百万死亡，主要是儿童。霍乱弧菌和弯曲杆菌以同样的方式在发展中国家人群中造成腹泻。ETEC和弯曲杆菌也是造成到这些地区旅游者腹泻的主要原因。由于与胃部溃疡有关，幽门螺杆菌近来变得重要起来。
对多数的这些微生物，定居因子抗原的产生受环境中各种因子的控制，这些因子又会活化质粒DNA中的调节基因。
所以，对于在人肠中有其自然生长环境的细菌，优化其在肠中生长和生存可能性的条件是有利的。换句话说，存在一种生存的优化策略，这意味着在具有合适生存条件的环境中产生粘连蛋白。
如从文献所知，一种能活化质粒调节基因的参数是温度，这意味着在许多细菌中CFAs的生产是由温度调节的。多种人类致病生物体已表明仅在高于室温时产生CFAs，而在室温则无此能力。由于已表明可能生产口服疫苗来对付这些生物体或细菌，所以某些生物体具有特别的商业价值。
在WO 92/14487中，公开了一种生产和使用口服ETEC疫苗的方法。ETEC细菌从琼脂平板移至液体培养基在37℃培养，以获得商业数量的具有CFAs及其亚组分(CS-抗原)的ETEC细菌。这些后来用福尔马林杀死的细菌可用作抗ETEC细菌的口腔疫苗。CFA和CS抗原因而将在肠中发生的免疫学过程中起抗原作用。
在规模化生产具有CFAs的ETEC细菌时，惊奇地发现每产生新的一代细菌，ETEC细菌会丢失更多产生CFAs的能力。研究其原因发现，高于室温时细菌生产CFAs能力的丧失伴随着位于细菌质粒上的调节基因的丢失。
发明描述
本发明的目标是一种培养质粒中具有基因的细菌的方法，此基因编码表面或膜结合抗原或其它蛋白，并以温度调节的方式表达以生产所需细菌产物，其中
所述的细菌先在使细菌保持其质粒并无表达出现的温度条件下，在培养基中培养成接种物，然后
所述接种物进一步在发生表达的温度条件下的培养基中培养，并且在细菌丢失质粒之前收集质粒，然后分离目的产物。
位于质粒中，能编码其它蛋白并以温度调节的方式表达生产所需细菌产物的基因的实例，是质粒中的重组基因，它保留了温度调节表达并产生所需的蛋白产物。
在优选的实施方案中，对接种物首次培养在室温进行，进一步在哺乳动物的体温下进行培养。
在另一个优选实施方案中，室温约20℃，哺乳动物体温是34-39℃。
再一个优选实施方案中，对接种物的首次培养以两步进行，先在培养平板，然后在液体培养基中进行。
在本发明的又一个优选实施方案中，进一步的培养在液体培养基中进行。
本发明的这些优选实施方案使得培养质粒中具有基因的细菌成为可能，此基因编码表面或膜结合抗原或其它蛋白，并在大型工业发酵罐中以温度调节的方式表达，大规模生产目的细菌产物。
在本发明的实施方案中，培养的细菌为大肠杆菌，它表达选自CFA/I，CS1，CS2，CS3，CS4，CS5和CS6中至少一种类型移居因子抗原。
在这样的培养中，所需的细菌产物可以是带有定居因子抗原CFA/I，CS1，CS2，CS3，CS4，CS5和CS6中至少一种的大肠杆菌，或者从细菌中分离得到的这种移居因子抗原。
图的简单描述
图1说明在20℃，20°+37℃和37℃，表达CS2+CS3抗原ETEC-菌株的培养。
实施例
下列实施例中，CFA介质被用作培养基。液体CFA介质的组成如下：水解酪蛋白氨基酸1％(w/v)，酵母提取物0.078％(w/v)，MgSO4 0.4mM，MnCl2 0.04mM，去离子H2O，pH7.4。CFA琼脂平板用作培养平板。这些包括每升琼脂中加入20g CFA介质。
实施例1
从-70℃取出表达CS2+CS3抗原的ETEC菌株，并根据以下膜组分的表达来评价此菌株。
CFA琼脂平板上接种菌株CS2+CS3并在20℃或37℃温育24小时。从平板上收集细菌，每个含40×106细菌的样品进一步接种在800ml CFA培养基中，振荡培养，20℃或37℃再温育24小时。在70小时，从20℃培养基中取出4.5ml的样品并再在37℃，800ml培养基中，振荡培养，CFA。用已显示对CS2抗原具有特异性的单克隆抗体，通过ELISA技术分析不同时间间隔CS2的表达。所有ELISA结果已被用光密度测定的细菌标准数量校准。以任意的ELISA习用(arbitrary)单位测得的结果示于表1。
表1时间(小时)20℃的ELISA单位20℃+37℃的ELISA单位37℃的ELISA单位 0 88 8 24 88 643 48 88 762 54 88 897 70 2525 1127 74 58 361 814 79 64 736 537 96 85 850 214
表1中的数据在Fig.1中也有说明。
实施例2
在如实施例1同样的条件下，带有CS4抗原的ETEC细菌在液体CFA介质中生长。在31小时取样后，温度升到37℃。
以ELISA习用单位测定的结果在表2中可见。
表2时间(小时)20℃的ELISA单位20℃+37℃的ELISA单位 0 00 24 00 26 00 29 00 31 00 48 08 52 19 54 110
实施例3
在如实施例1同样的条件下，带有CS5抗原的ETEC细菌在液体CFA介质中生长。在31小时取样后，温度升到37℃。
以ELISA习用单位测定的结果在表3中可见。
表3时间(小时)20℃的ELISA单位20℃+37℃的ELISA单位 0 00 24 00 26 00 29 00 31 00 48 15 52 18 54 18
实施例4
表达抗原CS1的ETEC细菌培养物在液体CFA介质中于37℃摇床上生长过夜。将菌落在CFA琼脂上铺板，并在37℃温育过夜。第二天，用CS1特异鼠单克隆抗体作为第二抗体，通过将菌落印迹法检查表达CS1菌毛的菌落。免疫印迹用氮蓝四唑盐染色剂显色。CS1菌毛阳性和阴性菌落被单独挑取出来，并如上所述在CFA琼脂平板上铺展培养。
这次每块平板如上所述用CS1特异的单菌落抗体的滤膜探测，并且还用一张滤膜与两种放射性标记(32P)探针之一菌落杂交来探测。一种探针对CS1(cooA)的结构基因特异，一种探针对调节RNS蛋白(rns)特异。
阳性菌落：抗体试验获得阳性的所有菌落，与rns探针和CS1探针也获得阳性。
阴性菌落：与抗体作用获得阴性的菌落没有一种同rns探针有任何反应，少数阴性菌落还失去了与CS1探针的反应性，但它们中的多数仍保留着其CS1结构基因。
总之，存在CS1抗体反应性(CS1菌毛的表达)的伴随丢失以及与rns探针反应性的丢失(编码rns基因质粒的丢失)。