检测靶核酸的方法 聚合酶链反应(PCR)的最新发展为检测低浓度核酸序列提供了重要的工具(Mullis.K.B等，美国专利第4,683,195号和第4,683,202号)。在PCR中，由两个寡核苷酸延伸引物决定其末端的靶序列通过重复的酶促反应循环而被扩增，以便为进一步扩增反应提供更多的模板。因此，少量靶序列能以指数方式得到扩增，并易于检测。
PCR的主要缺陷在于极易产生副产物，这是由非特异性引导引起的，例如，核酸模板的随机引导和/或延伸引物的自身引导。因此，当需要以较多的扩增循环次数扩增以较低浓度存在的靶序列时，非特异性引导的产物会明显降低PCR的敏感性。
PCR的另一个与此相关的缺陷在于检测扩增产物之前要有一个分离步骤。根据标准PCR条件，检测扩增靶序列的先决条件是从非特异性引导产物中分离出扩增的靶序列。使PCR操作自动化的一个障碍是无法进行同源扩增反应，所谓同源扩增反应就是在同一反应容器中进行扩增和检测。另外，需要进行分离也使PCR混合物在分离步骤中容易受到污染，污染地可能性严重限制了PCR在常规临床诊断中的潜在应用。
已有文献报道，有人试图发展出一种均相检测法，用于扩增和检测。Holland等(1991.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 88：7276)有类似报道，他们利用Taq聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性，伴随PCR扩增产生检测信号，从而进行检测。然而，随后还需进行一个分离步骤以检测外切核酸酶产生的信号。Higuchi等(1992 Bio/Technology 10：413)报道了一种均相检测方法，该方法是基于对溴化乙锭插入双链扩增产物后增强的荧光进行监测。这种检测方法对靶序列无特异性，因而易受到所存在的任何双链DNA的干扰。另一种方法是利用荧光极化来测定荧光核酸探针或荧光引物延伸产物的杂交(German，A.J.等，欧洲专利局公开号第382,433号)。这种检测方法能够区分杂交或延伸的探针和未反应的探针，前者具有较高的分子量(因而荧光极化值降低)。然而，具有较高极化值的未杂交探针的存在强烈地影响观测到的极化值，因而背景较高。
两个荧光部分极度接近时的无辐射能量转移可被用作一种有效的信号检测方式。基于荧光能量转移的均相免疫测定已有文献报道(Patel等。欧洲专利申请第137,515号)。荧光能量转移也被用来测定核酸杂交(Heller等，欧洲专利申请第070,685号和美国专利第4,996,143号)。在这些申请中，当带有不同荧光部分的探针，由于与一条靶核酸杂交而相互极度接近时，就产生了荧光能量转移信号。
一方面，本发明涉及到一种检测靶核酸的方法。该方法包括以下步骤：(i)扩增靶核酸获得扩增产物，扩增时使用聚合酶、第一引物和第二引物，第一引物具有或没有与第一引导序列不相邻的片段，第二引物具有或没有与第二引导序列不相邻的片段，扩增在一种寡核苷酸存在下进行，该寡核苷酸不能作为所述聚合酶的引物，其中，该寡核苷酸具有至少5个(优选至少8个)连续的核苷酸完全互补于第一引物的至少5个(优选至少8个)连续的核苷酸；(ii)通过监测扩增过程检测靶核酸的存在。
第一和第二引物相当于PCR方法中的引物对，它们在被聚合酶延伸以前，分别与靶核酸中的第一和第二引导序列杂交。本申请中，“聚合酶”指既具有核苷酸聚合酶活性，又能除去“下游”单链寡核苷酸的催化剂。
上述寡核苷酸为本发明中的“封闭寡核苷酸”。为方便起见，任何寡核苷酸只要符合下述条件，在本申请中均称为“封闭寡核苷酸”：(a)不能作为PCR引物，(b)具有至少5个连续的核苷酸完全互补于一个引物(具有或没有一个相邻的片段)的至少5个连续核苷酸。封闭寡核苷酸封闭引物，是指它与引物杂交，使引物与靶核酸中相应的引导序列结合的机率减小。在该方法的一个优选实施方案中，扩增步骤是在同时存在用于第二引物的另一种引物封闭寡核苷酸的条件下进行的。
5碱基完全互补序列可在封闭寡核苷酸和引物的相邻片段或不相邻片段之间形成。引物的相邻片段为与靶核酸中引导序列互补的序列。反之，引物的不相邻片段为不与靶核酸中引导序列互补的序列。
本发明的引物和封闭寡核苷酸的优选长度为10-50个核苷酸(更优选15-40个核苷酸)。封闭寡核苷酸的使用浓度受几种因素的影响，变化很大，这些因素包括封闭寡核苷酸和其相应引物的互补程度、试验温度等。一般情况下，本领域的技术人员无需过多试验即可确定该使用浓度。封闭寡核苷酸与其相应引物的摩尔比在0.3-5.0(或0.5-2.5)之间通常是可以接受的。
检测步骤是通过在电泳后监测凝胶上的靶核酸扩增产物而进行的。或者可将两种荧光团分别共价连接于第一或(第二)引物及其相应封闭寡核苷酸上，两种荧光团中，一种为供体荧光团，另一种为受体荧光团。当第一引物与其封闭寡核苷酸杂交时，供体荧光团与受体荧光团极度接近，相互之间可发生共振能量转移。当封闭寡核苷酸与其相应引物这样以荧光团标记后，就可监测在用激发光辐射供体荧光团时受体荧光团的荧光发射变化，对靶核酸的扩增进行定量，因为该变化反映了被封闭的引物与封闭寡核苷酸解链及随后掺入靶核酸扩增产物的程度。
另一方面，本发明涉及到用于检测靶核酸的试剂盒。例如，本发明的一种检测试剂盒可以包括：(i)一对引物(10-50碱基或15-40碱基)，它们与聚合酶一起被用于扩增靶核酸，引物具有或没有一个与其引物序列不相邻的片段；(ii)封闭寡核苷酸(10-50碱基或15-40碱基)，它能够封闭两个引物中的一个。封闭寡核苷酸和其相应引物最好均以上述方式用荧光团标记。封闭寡核苷酸及其相应引物可以双联体(即荧光团标记的“特异检测双联体”，见图1中间和图2上部，讨论见后)提供。该试剂盒最好还包括下述试剂之一或全部：一种聚合酶和封闭其他引物的另一种封闭寡核苷酸。
在另一实施例中，本发明的一种试剂盒可以包括：(i)第一个荧光团标记的寡核苷酸(10-50碱基或15-40碱基)，它不能作为聚合酶扩增的引物；(ii)第二个荧光团标记的寡核苷酸(5-30碱基或7-15碱基)，它具有自由3′OH。两种寡核苷酸通过至少5个(优选至少8个)连续的完全互补的核苷酸配对而相互杂交，第一寡核苷酸伸出第二寡核苷酸3′末端1-12个碱基(优选4-8个碱基)。并且，第一和第二荧光团中，一种为供体荧光团，另一种为受体荧光团，它们在杂交后极度接近，相互之间可发生共振能量转移。第一和第二寡核苷酸可以双联体提供，即“通用检测双联体”(见以下讨论)。优选试剂盒还包括其它试剂，如连接酶、激酶和具有或没有5′→3′外切核酸酶活性的聚合酶，连接酶和激酶(或具有或没有5′→3′外切核酸酶活性的聚合酶)可被用来把任何选定引物连接在通用检测双联体上，从而把后者转变成为特异检测双联体。
上述特异和通用检测双联体，以及组成双联体之一链的无效寡核苷酸均属于本发明的范围。
本发明的其它特征和优点可从以下附图和优选实施方案的描述、以及所附权利要求中看出。
首先介绍附图。
图1为本发明的方法的一种实施方案。
图2为本发明的方法的另一种实施方案。
图3为凝胶照片，显示封闭寡核苷酸减少非特异性引导的效果。
图4为柱形图，显示使用荧光团标记的封闭寡核苷酸监测特异性引导。
图5为曲线图，显示使用本发明的两种探针检测两种不同靶序列的分辨率和敏感性。
此处“扩增”是泛指使用聚合酶和一对引物产生任何特定核酸序列的过程，特定核酸序列即“靶核酸序列”或“靶核酸”，产生量较初始存在的量要多。
本发明涉及到一种方法，该方法通过监测引物掺入特定核酸的扩增产物的过程，来检测特定核酸序列的存在。本发明中，封闭寡核苷酸被用来防止扩增过程中发生非特异性引导。在一优选实施方案中，通过荧光监测封闭寡核苷酸与其互补引物的解链而检测扩增的靶序列。
扩增依赖于每一对引物与其特定引导序列的杂交，特定引导序列指起始核酸模板中的一段序列，它与引物的互补程度最高，而且最易与其杂交。除特定引导序列之外，起始核酸模板还可以包括非特异性引导序列，引物与其也能杂交。非特异性引导是指使模板中的特定核酸序列之外的一段序列得到扩增的现象，它包括诸如引物与模板中的引物序列之外的序列杂交的反应以及诸如由于引物的分子间相互作用导致的双引物化的自身引导(Chou等Nucleic Acid Research，(1992)20：1717)。
引物是一段寡核苷酸，可由限制酶消化产物纯化得到或由有机方法制备得到，在合适的条件下，它可作为互补于靶序列的引物延伸产物合成的起点。本发明的引物除了包括与起始核酸模板的特定引导序列互补的序列之外，还可包括5′端一段与起始模板的引物序列不相邻的序列。换句话说，相邻片段为引物3′端一段序列，它与起始核酸模板的特定引导序列互补，而不相邻片段为引物5′端一段序列，它不与起始核酸模板的引导序列互补。
此处，起始核酸模板是指含有或怀疑含有靶序列的样品中纯化或未纯化的核酸。因此，该方法可使用DNA、RNA或DNA：RNA杂合体。起始核酸模板并不局限于最终翻译为蛋白质产物的DNA或RNA，也可包括非编码核酸或编码序列之间的非编码核酸序列。
为了有效地减少非特异性引导的发生，本发明提供了封闭寡核苷酸，它和非特异性引导序列竞争与引物进行杂交。本发明的封闭寡核苷酸“不能作为聚合酶的引物”，即不能作为延伸产物合成的起点。使封闭寡核苷酸不能作为延伸反应的引物可通过如下方式达成：除去或修饰3′末端羟基，如加上末端3′-双脱氧核苷酸或3′-磷酸化、3′-氨基化修饰，以及在3′末端附近连接上诸如罗丹明的大分子，立体阻止聚合酶催化延伸反应。延伸产物合成的代表性条件参见实施例。
多数情况下，当引物与其封闭寡核苷酸杂交形成“引物：封闭寡核苷酸双联体”时，引物的3′-末端伸出或超过其封闭寡核苷酸较为理想，这样可以排除引物沿5′→3′方向进行不必要的延伸。关于这一点，应当指出，引物：封闭寡核苷酸双联体的形成是一个可逆的过程，因而，在合适的条件下(如增温继之以降温)，双联体可重复解链和重新连接。
“封闭寡核苷酸”一词泛指能够与引物杂交以防止非特异性引导的寡核苷酸。由于封闭寡核苷酸与其相应引物充分互补，在合适浓度下，它可稳定未参与特异性引导的引物，从而防止发生非特异性引导。“充分互补”指两个序列的核苷酸互补程度应足以使杂交发生。最好在扩增反应开始时每一引物均有封闭寡核苷酸。
本领域的普通技术人员可以理解，两条链发生杂交时，互补程度和浓度为相互影响的变量。因而，封闭寡核苷酸可与其相应引物高度互补，或不与其相应引物高度互补，只要寡核苷酸的浓度足以阻止引物与非特异性序列的结合。通常核酸样品是双链的，因而在延伸产物合成之前必须分开双链。在以下的实施例中，热变性被用来分开核酸样品的双链。然而分开双链也可使用本领域中已知的其它试剂，包括诸如RecBCD蜗牛酶的酶试剂，参见Muskavitch等(1981，Enzgme 14：233)。引物和其封闭寡核苷酸可以双联体或两个单体形式加入核酸样品。如果引物和其封闭寡核苷酸以双联体形式加入，使核酸样品变性的步骤同样会使引物：封闭寡核苷酸双联体分开形成相应单链。
链分开后，反应混合物置于合适的杂交条件下，促进引物与其模板的引导序列杂交形成引物：模板复合体，或与其封闭寡核苷酸杂交，形成引物：封闭寡核苷酸双联体。合适的杂交条件在本领域中广为人知，其中一些可参考以下实施例。
一旦引物与模板的引导序列杂交后，将反应混合物置于合适的延伸反应条件下，使引物作为延伸反应，即聚合反应的起点。引物与模板的杂交和引物延伸不一定要在两个不同的反应中进行，因而，综合杂交所需条件与延伸所需条件，杂交与延伸可同时进行。合适的延伸反应条件在本领域中广为人知，它是一些受控的条件(如温度、pH和离子强度)，在DNA聚合酶等催化剂存在下加入核苷酸，可诱导延伸产物在与核酸模板杂交的引物3′端合成。代表性的延伸反应条件也可参见以下实施例。
延伸反应的催化剂通常是DNA聚合酶，如Thermus aquaticus或Thermusthermophilus的耐热聚合酶(Kong等，J.Biol.Chem(1993)268：1965)。为实现本发明，很关键的一点是聚合酶能够除去模板上与引物杂交的序列的下游杂交的寡核苷酸。在合适的延伸反应条件下，聚合酶向延伸引物3′末端逐个加上核苷酸，除去可能存在的、与引物下游序列结合的封闭寡核苷酸，从而合成一种延伸产物，其序列与模板的靶序列互补，并包括封闭寡核苷酸序列。
若模板为双链核酸，则首先合成两种延伸产物，每一延伸产物相应于靶序列的一条链。新合成的延伸产物不仅是靶序列的复制品，而且包括引导序列，该引导序列可能含有或没有一段不相邻的序列。新合成的延伸产物随后与起始模板链分开，并作为合成另外的延伸产物的模板。此后，引物若含有与起始模板的引导序列不相邻的片段，则该片段也被复制，并整合到延伸产物之中。应指出，每一延伸产物在后续延伸反应中又可作为模板，它由两个共价连接的部分组成：(i)整个引物，包括可能存在的不相邻的片段，(ii)互补于靶序列一条链的扩增核酸序列。双链分开、杂交和延伸/位移的完成组成了扩增反应的一个循环。因而，延伸产物的浓度随扩增循环的增加以指数速度增加。
在一优选实施方案中，引物与其封闭寡核苷酸分别标记，如分别以供体荧光团和受体荧光团标记，它们通过杂交而相互极度接近，因而可发生共振能量转移。随着延伸反应的进行，由于标记引物不断被掺入延伸产物中，能够得到的标记引物不断减少，这就减少了能够与标记封闭寡核苷酸杂交的标记引物的数量。随着延伸反应的重复进行。产生了能够与引物结合的未标记延伸产物，它和标记封闭寡核苷酸竞争与引物杂交。因而，在这个优选实施方案中，封闭寡核苷酸起双重作用：(1)作为封闭分子，减少或消除非特异性引导，(2)作为信号探针，参与检测过程。
当荧光团被用来实现本发明时，供体和受体荧光团被连接于封闭寡核苷酸和其相应引物上，这样，当封闭寡核苷酸和引物相互杂交形成双联体时，它们之间的距离在共振能量转移的范围之内。荧光团之间最好由至少一个核苷酸隔开。但距离不要大于100A(Clegg，Methods ib Enzymology 211：253)。荧光团连接于内部核苷酸上也比较理想。若有必要的话，可使用两个以上荧光团。还应当指出，荧光团可以相同或不同。供体荧光团的发射光谱和受体荧光团的激发光谱的重叠，使得可在它们之间发生能量转移。因而，当引物：封闭寡核苷酸双联体变性或分开时(如在延伸反应中那样)，由于能量转移中断就产生了信号变化。
若需要的话，可首先制备一种荧光团标记的封闭寡核苷酸，它与引物或起始模板的靶序列均不能充分互补(即至少有5个碱基配对的互补性)。通用检测双联体由封闭寡核苷酸和另一种由荧光团标记的寡核苷酸组成，其中封闭寡核苷酸与第二寡核苷酸互补，并伸出第二寡核苷酸的3′末端。在混合特定引物与起始模板以进行延伸反应之前，封闭寡核苷酸通过连接反应成为引物的互补链。在连接反应中，第二寡核苷酸的3′末端与引物的5′末端共价连接。换句话说，“通用检测双联体”是指由封闭寡核苷酸和与其互补的不作为引物的寡核苷酸形成的寡核苷酸对，显而易见，通用检测双联体的两种(或更多种)荧光团必须极度接近。在一特别优选实施方案中，供体荧光团和受体荧光团分别连接于弱稳定性的通用检测双联体的相应寡核苷酸上，随后引物连接于双联体上形成较为稳定的双联体-引物。因而，两种荧光团之间的能量转移效率提高了。
与通用检测双联体不同，特异检测双联体无需修饰即可用于扩增/检测靶核酸，参见图1，实心圆和实心方块代表两种荧光团，空心圆代表封闭寡核苷酸的无效3′末端。应注意到在图1所示的实施方案中，标记引物包括不与其引导序列相邻的片段。而且，预先进行的不对称扩增优先扩增与标记引物结合的链，以便能提高敏感性。不对称扩增可通过以下方法引发：提供不等量引物，即一种引物过量而另一种引物限量，或提供与特定引导序列互补程度不同的引物。其它因素，如每一模板链的合成速率的差异，可能也有助于不对称扩增。不对称扩增的最佳引物比可凭经验确定(Shyamala等，1989.J.Baceriol.171：1602)。
本发明的方法使用的另一类“特异检测双联体”见图2。在该实施方案中，使用了两种未标记的特异检测双联体(即两个封闭寡核苷酸：引物对)。两个引物均不具有与其引物序列不相邻的片段。同样，空心圆代表封闭寡核苷酸的无效3′末端。应注意的是，该图中示出了除去下游封闭寡核苷酸的重要过程，而图1中未示出。
本发明的方法可于一种仪器上进行，在该仪器上，核酸模板中靶序列的扩增与测定扩增的靶序列可同时进行，无需分离步骤。该仪器包括：(1)盛放寡核苷酸的寡核苷酸容器；(2)盛放核酸样品的反应容器，该反应容器与寡核苷酸容器的连接方式使寡核苷酸容器中的内含物能够自动进入反应容器；(3)混合寡核苷酸与样品的控制器；(4)控制反应容器温度的温度控制器；(5)辐照源；(6)测定由反应容器发出的辐射的检测器。优选反应容器为多孔微量滴定板之一孔。通常，辐照源为能够产生选定波长的光子的装置，该装置是本领域的普通技术人员熟知的，且可商购(如钨灯或离子激光灯)。检测器为能够将光子能量转换为电信号的装置，同样，该装置也广为人知，并可由众多供应商提供，该装置的实例包括光电倍增管和半导体光子检测器。
特别优选该仪器还包括一个数据处理器，以处理检测器接受到的信号数据。该仪器也可包括一种控制机构，当检测器检测到预先确定的辐射水平，即相当于预先选定的扩增水平时，该控制机构自动终止扩增反应。因而，该仪器提供了一种“联机”监测扩增反应的方法，该方法类似于大规模重组蛋白合成中用到的联机监测发酵产物的方法。因而，均相扩增和检测方法与此处公开的仪器联合使用，可消除反应容器的污染，因为没有必要由反应混合物中取样以确定靶序列扩增的程度。
可以相信，无需进一步说明，本领域的技术人员根据此处的描述即可充分利用本发明。因而，以下的具体实施方案应理解为仅仅作为例证，而不是以任何方式对其余公开部分进行限制。
实施例I：封闭寡核苷酸在减少非特异性引导方面的效果
为了说明封闭寡核苷酸对引导效率的影响，L SRY基因(Sinclair等，1990，Nature，346：240)的127bp片段在封闭寡核苷酸存在或不存在的情况下进行扩增。寻靶引物序列为：引物(A)5′-AACTC AGAGA TCAGC AAGCAGCTGG GATAC-3′，引物(B)5′-ACTTA TAATTTR CGGGT ATTTC TTRCTCTGTGCA-3′。TTR表示一个由德克萨斯红缀合的氨基-C6-dT残基(GlenhResearch，Sterling.VA)，而且德克萨斯红是按照供应商建议的方法缀合于引物(B)上(Molecular Probes，inc.Eugene.OR.U.S.A)。所用的封闭寡核苷酸与引物(A)的24个碱基互补，其序列为5′-CAGCT GCTTG CTGAT CTCTG AGTTL-3′，其中，“L”表示3′-胺末端(3′-胺-ON CPG，Clontech，Palo Alto，CA)。
所有寡核苷酸均由Operon technologies，Inc.(Alameda，CA)合成，然后在8M尿素/15％丙烯酰胺凝胶上电泳纯化。寡核苷酸特异带被电泳洗脱下来，并通过测260nm处的紫外吸收进行定量。
用作靶DNA的男性人体基因组DNA是采用DTAB/CTAB法由全血中提取的(Gustinicich等，1991.Biotechniques 11：298)，260nm处测光吸收进行定量，以TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)连接稀释，采用50ng/μl酵母tRNA作为载体。
扩增采用AG-9600 Thermal Station(MJ Research，Watertown，MA)，在96孔聚碳酸酯微量滴定板上进行。反应体系体积为10μl，含有50mM Tris-HCl，pH8.7，40mM KCl，5mM NH4Cl，2mM DTT，0.1％ Triton X-100，100μM dNTP，0.3单位Tth DNA聚合酶(Carballeira等，1990.Biotechniques9：276-281)和不同量的靶DNA(102，103和104)，加入每种引物各30ng，封闭寡核苷酸与引物等量加入或不加。将酵母tRNA和鲑精DNA作为阴性对照。总共进行35个热循环(94℃25秒，60℃20秒，72℃40秒)。随后，采用9％丙烯酰胺凝胶电泳进行样品分析，电泳缓冲液采用TBE缓冲液，电压为10v/cm，凝胶电泳的分子量标记为HpaII消化的pBR322 DNA。凝胶以溴化乙锭快速染色，在紫外光下照相，照片如图3所示。
参见图3，凝胶上每一泳道的含义均被示出。其中，tRNA代表酵母tRNA，SS代表鲑精DNA，M代表分子量标记，数字代表靶分子的量，符号“+”或“-”表示有或没有封闭寡核苷酸。有封闭寡核苷酸的反应体系中，127bp SRY特异序列带的亮度更高，在靶DNA剂量较低时尤为明显。反之，未加入封闭寡核苷酸的反应体系中，引物双体带的亮度更高。因而，特异靶序列的扩增效率直接受非特异性引导，如形成引物双体的干扰程度的影响，这种引物双体在不含封闭寡核苷酸的反应体系中明显较多。
实施例II：采用荧光团标记的封闭寡核苷酸监测靶核酸的扩增
本实施例说明封闭寡核苷酸不但可用来减少非特异性引导，而且用荧光团标记后，还可用来监测扩增过程。本实施例中所用靶DNA、封闭寡核苷酸和引物基本上与实施例I中的相同，只有指示探针不同，该探针与引物(B)的20个碱基互补，其序列为5′-AGAGA GAAAT ACCCG AATTAL-3′，它参与与引物(B)的荧光能量转移。“L”表示3′-胺末端(3′-胺-ONCPG，Clontech，Palo Alto CA)。纯化后，指示探针再与荧光素缀合，缀合按供应商(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR.USA)建议的方法进行。
扩增是采用一台MW-1热循环仪(Techne Inc.Cambridge，England)，在96孔聚碳酸酯微量滴定板(Techne Inc，Cambridge，England)上进行。反应体系体积为20μl，含有50mM Tris-HCl，pH8.7，40mM KCl，5mM NH4Cl，2mMDTT，0.1％Triton X-100，100μM dNTP，0.6单位Tth DNA聚合酶，102个靶DNA拷贝，加入每种引物各20ng，封闭寡核苷酸与引物等量加入或不加。鲑精DNA作为阴性对照。总共进行24个热循环(96℃42秒，53℃42秒，72℃60秒)。随后向每个反应体系中加入指示探针。第25个循环时，使用微量板荧光计(Model 7600，Cambridge Technologies，Inc.，Watertown，MA，USA)对每一反应体系在630nm处进行首次荧光读数，随后在第30个循环和第35个循环再次读数。将荧光读数绘成曲线，并在图4中示出。
图4中条形图说明在扩增开始时加入或不加封闭寡核苷酸的两个不同循环的荧光信号变化程度。荧光信号下降表明引物：封闭寡核苷酸双联体解链，在不存在非特异性引导时，荧光信号下降与引物掺入扩增的靶序列的程度成正比。未加入Tth DNA聚合酶的反应作为荧光信号对照记为“未扩增”。对含102拷贝SRY序列和鲑精DNA的样品平行进行试验，以观察靶DNA特异信号和非特异信号。如图中所示，在扩增后期(第35个循环)，封闭寡核苷酸的存在减少非特异性引导，这可由两个鲑精DNA对照间荧光变化的差导看出，上述两个对照中分别含有或不含封闭寡核苷酸。
实施例III：通用检测双联体与引物连接提高能量转移
本实施例中，两套通用寡核苷酸被用来说明连接反应引发的能量转移提高。连接反应中，以封闭寡核苷酸作为模板，将其互补寡核苷酸与引物连接。
所有寡核苷酸的合成、纯化及与荧光团连接均是按照前述实施例所述方法进行。连接反应中，将200ng封闭寡核苷酸及等摩尔量的其互补寡核苷酸和引物加入20μl反应混合物中，该反应混合物中含0.15单位T4连接酶(NewEngland Biolab，Beverly，MA)、0.5单位T4多聚核苷酸激酶(New EnglandBiolab，Beverly，MA)、1mM ATP和缓冲液(70mM Tris HCl pH＝7.6，10mMMgCl2及5mMDTT)。连接反应进行两次，反应在40℃下进行1小时30分钟，通过在95℃加热10分钟终止反应。每次反应前后，各取一份等量反应混合物，测其在495nm光激发下630nm处的发射荧光强度。
第一套：封闭寡核苷酸序列为5′-TTR TTTT GAACA GGCCT TGTTRG-3′，其互补寡核苷酸序列为5′-CAAGG CCTFG-3′，引物序列为5′-TTCAA ACCTG TGCTT AGGGC ACTG-3′，底线标出的碱基与引导序列互补。TTR表示德克萨斯红缀合的氨基-C6-dT残基，TF表示荧光素缀合的氨基-C6-dT残基。它们与寡核苷酸的连接方法见实施例I和II。
连接反应前反应混合物的荧光读数为900±23，连接反应后的读数为1336±211，因而第一套双联体中连接后能量转移提高了1.48倍。
第二套：封闭寡核苷酸序列为5′-TTR TGGT CTCGA CCTCC TTGTTR G-3′，其互补寡核苷酸序列为5′-CAAGG AGGTFC G-3′，引物序列为5′-AGACC ACCTG TGCTT AGGGC ACTG-3′，底线标出的碱基与引导序列互补。
连接反应前，反应混合物的荧光读数为1489±58，连接反应后读数为3019±94，因而，第二套双联体中连接后能量转移提高了2.03倍。
实施例IV：使用检测双联体监测靶核酸的不对称扩增
为说明检测双联体的应用，我们使用：(A)引物：封闭寡核苷酸双联体，或(B)与引物连接的通用检测双联体监测扩增过程。双联体(A)中，封闭寡核苷酸与引物和起始靶序列均互补。双联体(B)中，引物连接于封闭寡核苷酸的互补寡核苷酸上，在引物和封闭寡核苷酸之间建立互补关系。双联体(A)和(B)均用于同样的扩增反应。将人急性髓样细胞白血病断裂点相关序列(AML-1)和人X-染色体特异性釉原(ameloginen)(AMG-X)的片段作为扩增靶序列，以说明上述双联体的应用。引物：封闭寡核苷酸双联体的制备
双联体(A)：用于AML-1的引物和封闭寡核苷酸的序列分别为5′-ACGGG GATAC GCATC ACAAC AA-3′和5′-TTGAT GCGTA TCCCCGTTT-3′；用于AMG-X的引物和封闭寡核苷酸的序列分别为5′-AGACTGAGTC AGAGT GGCCA GGC-3′和5′-TCCAC TCTGA CTCAG TCTTA-3′。引物和封闭寡核苷酸上用底线标出的位置分别与荧光素和德克萨斯红缀合。封闭寡核苷酸的3′末端为双脱氧核苷酸，因而无法延伸。
双联体(B)：用于AML-1的引物序列为5′-GGGAC GCACG GGGAAACGCA TCACA ACAA-3′；用于AMG-X的引物序列为5′-GGGACGCAGACTGAG TCAGAGTGGC CAGGC-3′。每种引物均连接于类似于实施例III中的检测双联体上。AML-1引物和AMG-X引物与双联体连接后能量转移分别提高了2.62和2.42倍。不对称扩增和检测
AML-1靶序列的过量引物为5′-TGTTT GCAGG GTCCT AACTCAATCG-3′，限量引物为5′-GCGGC GTGAA GCGGC GGCTC G-3′；AMG-X靶序列的过量引物为5′-TGATG GTTGG CCTCAAGCCT GTG-3′，限量引物为5′-TGGGATAGAACCAAG CTGGT CAG-3′。
将人类男性基因组DNA作为靶序列，这种DNA是采用实施例I的方法由全血中提取的。
在加入引物双联体前，将靶序列不对称扩增20个循环。不对称扩增时，过量引物与限量引物比为7.5(1.2μm比0.16μm)，反应体系体积为10μl，含1单位Tth DNA聚合酶、50mM Tris HCl、40mM KCl、5mM NH4Cl、100μm dNTP、5mM MgCl2和0.1％Triton X-100。循环条件与实施例I的相同。反应采用AG-9600 Silver Block Thermal Station(MJ Research，Watertown，MA)，在96孔聚碳酸酯微量板(Costar，Cambridge，MA)上进行。
在室温下把每种引物双联体4ng加入反应孔中以开始扩增和信号检测过程。第21个循环时，在485nm激发下首次测量630nm处荧光发射，作为标准曲线的基线。随后在第28个循环再次测量，以后每隔一个循环进行测量。
第30个循环的检测结果示于图5中，上述结果说明了双联体(A)和(B))的定量分辨率和检测敏感性。如图中所示，荧光强度下降反映了起始靶序列的量。
其它实施方案
根据以上描述，本领域的技术人员很容易确定本发明的实质特征，而且，在不超出本发明的构思和范围的前提下，即可对本发明作出改变和调整，以使其适应各种应用和条件，因而，权利要求中也包括其它实施方案。