制备方法 本发明涉及[3’-脱氧-3′-氧代-MeBmt]1环孢菌素(cyclosporin)的制备方法。特别涉及[3’-脱氧-3′-氧代-MeBmt]1-[Nva]2-Ciclosporin或[3′-脱氧-3’-氧代-MeBmt]1，[Val]2-Ciclosporin的制备方法。
按照本发明提供的分子式II的[3’-脱氧-3′-氧代-MeBmt]1环孢菌素的制备方法其中：
A是3’-脱氧-3’-氧代-MeBmt残基；
B是-αAbu-、Thr、-Val-或-Nva-；
X是-Sar-或旋光性残基、D构形的α-N-甲基化地α-氨基酸残基，和
Y是-Val-或当B是Nva时是另外的Nva，该方法包括培养微生物以制备其中A是MeBmt的分子式II的环孢素中间产物、回收环孢菌素并选择性地氧化环孢菌素中间产物来制备其中A是3’-脱氧-3’-氧代-MeBmt残基的分子式II的环孢菌素。
其中A是[3’-脱氧-3′-氧代-MeBmt残基的分子式II的化合物有益于增加对化疗药物的敏感性，或增加化学药物疗法的疗效及特别有效于回复各种形式的(例如后天的或先天的)病对化疗药物的耐药性，或增加或恢复对药物治疗的敏感性。可应用这些化合物的各种化疗方法包括，例如抗寄生的比如抗病毒、抗菌或抗原生动物的化学疗法和尤其是抗肿瘤的或抑制细胞生长的化学疗法。
可以使用本发明方法制备的特别优选的环孢菌素是[3’-脱氧-3’-氧代-MeBmt]1-[Nva]2-Ciclosporin或特别是[3’-脱氧-3’-氧代-MeBmt]1-[Val]2-环孢菌素。这些化合物是由氧化[Nva]2-Ciclosporin和[Val]2-Ciclosporin制备的，这些氧化方法本身是包括在本发明范围内。
因此在本发明进一步的主题中提供了制备[3’-脱氧-3’-氧代-MeBmt]1-[B’]2-Ciclosporin的方法，包括氧化[B’]2-Ciclosporin，其中B’是Nva或Val。[Val]2-Ciclosporin也称为环孢菌素D。
在氧化方法中使用的[B’]2-Ciclosporin可由培养生成[B’]2-Ciclosporin的菌种获得，或由部分或完全合成来制备，包括从不同的环胞菌素或有关的发酵产物衍生。
任何适用的氧化剂、溶剂、催化剂或反应条件或方案可用于本发明方法的氧化步骤或另外方面的方法。氧化反应适用的反应剂包括和N-氯-琥珀酰亚胺混合在一起的二甲基硫化物或优选和N，N′-二环己基碳化二亚胺混合的二甲基亚砜，优选在诸如甲苯的非极性有机溶剂中。更优选的是和N，N′-二环己基碳化二亚胺混合的十二烷基甲基亚砜在诸如甲苯的溶剂中用作氧化剂。十二烷基甲基亚砜优于二甲基硫化物和二甲基亚砜，因为二甲基硫化物对安全和生态学是不合适的，而二甲基亚砜提高了反应中副产物二甲基硫化物的生成量。与使用十二烷基甲基亚砜有关的也有一个不希望有的气味问题。优选的氧化反应在低温下进行，例如-15-+20℃。
本发明仅由下述实施例进一步说明，下面的实施例叙述3[3’-脱氧-3′-氧代-MeBmt]1-[Val]2-Ciclosporin的制备方法。实施例a.环孢菌素D的制备
环孢菌素D(也称为[Val]2-Ciclosporin)由适合的菌种例如Tolypocladium inflatum GAMS(由美国北部地区研究实验菌种保藏室保藏，保藏号为NRRL 8044)发酵制备，从发酵肉汤中回收，其后由下述方法纯化。
每升中含40g葡萄糖、2g酪蛋白酸钠、2.5g磷酸铵、5g MgSO47H2O、2gKH2PO4、3gNaNO3、0.5gKCl、0.01g FeSO4并加软水至1升的500l营养液用50l预培养的NRRL 8044菌种接种，并在钢制发酵缶中，在搅拌下(170rpm)保温培养，然后在27℃下曝气(1l空气/分钟/l营养液)13天(见公开的德国专利申请1455859)。
培养液与等量的醋酸正丁酯搅拌，在分离有机相后在真空中蒸发浓缩，粗提取物由三步分配色层法在甲醇/水(9∶1)和石油醚之间脱脂。分离甲醇相，在真空中蒸发浓缩。加入水沉淀粗产物。经过滤得到的物质用己烷/丙酮(2∶1)作为洗脱剂进行硅胶色谱分离。初始洗脱级份主要含环孢菌素A和环孢菌素D，后面的洗脱级分主要含环孢菌素C。为了进一步纯化，含环孢菌素A和D的级份在-15℃从2-2.5倍量的丙酮中结晶，结晶物再在硅胶上层析二次，级份先用水饱和的醋酸乙酯洗，所含环孢菌素D呈极浓缩态。然后溶在两倍量的丙酮中，在-15℃下结晶。为了再次纯化，将产生的粗环孢菌素D结晶产物溶在10倍量的丙酮中，加入2％重量活性碳并加热5分钟使温度达60℃。在滑石上经过滤得到的透明并几乎无色的滤液蒸发浓缩成它的体积的三分之一，冷却到室温，随后环孢菌素自然结晶。静置在-17℃下完成结晶。过滤得到的晶体用少量冰冷的丙酮洗涤，随后在80℃下，在高真空中干燥2小时。
环孢菌素D的特性：
无色，棱柱形晶体，M.P.148°-151℃
[α]D20＝-245°(c＝0.52，在氯仿中)
[α]D20＝-211°(c＝0.51、在甲醇中)b.十二烷基甲基亚砜的制备
混合478g(2.2mole)十二烷基甲基硫化物、52.5g冰醋酸和1l无水乙醇，然后一边搅拌一边加热至70℃。在90分钟内一边搅拌一边加入215g(2.2mole)过氧化氢溶于540ml水得到的溶液并继续搅拌约1小时直到由气相色谱分析测定完成了至少90％的反应。然后混合物冷却到20-25℃，加入27g偏亚硫酸氢盐溶于41ml水中所得的溶液，搅拌产生的混合物20分钟，同时保持温度为20-25℃。然后加入3l甲苯和93g碳酸氢钠溶于1.07l水中所得的溶液。搅拌混合物并相分离。排去水溶液相，用1l水洗涤有机相，排去洗涤水，在减压下浓缩有机相，使体积达到为约为1.25l。加热浓缩物到50-55℃，并加入1.5l己烷。然后产生的溶液用十二烷基甲基硫化物晶体接种，在一小时内冷却到20-25℃，然后在这个温度下搅拌。然后在约30分钟内将溶液冷却到0-5℃。在这个温度下约搅拌3小时。用离心法收集固体沉淀。然后用400ml冷(0℃)己烷洗涤固体，在减压并且温度不超过60℃下干燥，得到产量为462g十二烷基甲基亚砜(约90％理论产量)。c.将环孢菌素D氧化成[3’-脱氧-3’-氧代-MeBmt]1-[Val]2-Ciclosporin
将269g(.22mole)纯的环孢菌素D溶在2.95l甲苯中，加入如上所述制备的283g(1.22mole)十二烷基甲基亚砜，混合物冷却到0-5℃并加入78g二氯醋酸和另外的50ml甲苯。反应混合物的温度维持在0-5℃约45分钟，此后加入205g(.99moleN，N’-二环己基碳化二亚胺溶于290ml甲苯所得的溶液。搅拌反应混合物约30分钟直到由HPLC色谱法测定反应至少完成了95％。加入81g(.64mole)草酸溶于630ml水中所得的溶液，在0-5℃搅拌产生的混合物约3小时。用离心分离形成的固体，用440ml冷甲苯(5℃)洗涤。然后去掉固体。混合反应混合物的液体部份和洗液，分离此相系，排掉水溶液相，将碳酸氢钠水溶液(80g于1.25l)加到有机相，直到pH值达到7-8。搅拌后分离此相系，排掉水溶液相，用650ml水洗涤有机相。排掉洗涤水，在减压和温度不超过60℃下蒸发有机相至于燥，剩余物溶在560ml醋酸异丙酯和10ml水的混合物中并同时加热到55-60℃。在30分钟内溶液冷却到约40℃并用十二烷基甲基亚砜晶体接种。然后在约90分钟内混合物冷却到-10--15℃，在这个温度下约搅拌4小时。离心除去固体，用390ml醋酸异丙酯洗涤，然后排掉。反应混合物的液体部份和洗液混合，得到1.28kg含约256g[3’-脱氧-3’-氧代-MeBmt]1-[Val]2-Ciclosporin的溶液(约95％的理论产量)。
用硅胶色谱法富集上述获得的溶液。制备二个硅胶柱，每个含1kg悬浮在2.5l醋酸异丙酯的硅胶并且每个装入162g溶液。柱用水饱和的醋酸异丙酯以500ml/小时的流速洗脱，在第一个4l(第一洗脱物)，下一个500ml(第二洗脱物)，再下一个4.5l(第三洗脱物)和再下一个1l(第四洗脱物)收集各级份。由HPLC测定；所需产物在第三洗脱物中。因此排掉第一洗脱物，留下第二和第四洗脱物用于再加工。混合来自两个柱的第三洗脱物，在减压下浓缩使体积达到约为320ml，然后在减压、温度不超过60℃下蒸发至干燥，得到近40g产物。
用从叔丁基甲基醚中结晶再次纯化产物。纯化的[3’ -脱氧-3′-氧代-MeBmt]1-[Val]2-Ciclosporin产物的结果是熔点在195-198℃之间，旋光度[α]D20＝-255.1°(c＝0.5，在三氯甲烷中)，分子量为1214.65。
[3’-脱氧-3′-氧代-MeBmt]1-[Nva]2-Ciclosporin可由基本如上所述氧化[Val]2-Ciclosporin的近似方法氧化[Nva]2-Ciclosporin制备。