需氧微生物发酵过程控制菌体代谢节律的培养方法 本发明涉及一种需氧微生物的培养方法，这个方法是把发酵罐内的Fed-Batch过程看作一个时空混沌体系，在线控制其中的非线性变量，使生物活体的酶促生化反应在节律状态下完成。
在生化工业里典型的菌体培养程序是先在一个种子发酵罐中(体积大约2M3)进行种子培育，种子培养基输送到种子罐中煮沸消毒后，把经过无菌培养过的微生物细胞(菌株)接进罐让它生长，经过一定时间(大约16小时)当细胞数目表明微生物是处于对数生长期时就被输送到主发酵设备开始发酵培养和获取产物，现有技术关于监测和控制都是针对主发酵设备里的发酵生化过程。
主发酵过程一般分为三个阶段，发酵前期是长菌阶段，发酵中期和后期是产物积累和排泄阶段也就是菌体的代谢过程。在需氧微生物的培养过程中，及时准确地调节温度、pH、通风量和流加氮源，碳源，可以控制菌体繁殖、底物消耗速率，提高产物形成速率。迄今为止大多数发酵工业仍采用每几个小时从发酵罐内取出样品，离线进行生化分析，测定菌体浓度、碳源浓度和产物浓度，以便采取相应操作进行过程控制。
欧洲专利EP0661380A2“需氧微生物培养的方法和设备”所介绍的现有技术包括方法和设备，其方法是开发一种在线测量发酵液里的菌体浓度、碳源浓度和产物浓度以及氨离子浓度的方法，根据这些测量值去计算流加速率。定量控制发酵液的碳源浓度和氨离子浓度，使需氧微生物在Fed-Batch培养过程中保持微生物菌的适当生长。实施这个方法的设备包括一台近红外分光光度计和与此仪器相接的计算机以及与计算机相接的控制部件包括温度、pH、流加碳源、罐压和通风。计算机及其控制部件组成一个在线系统。每10分钟自动取一次发酵液，由近红外分光光度计进行在线分析。在线分析的方法是根据校正曲线所提供地经验数据计算： 碳源浓度＝32.36+0.900×1295.2×(F[2270]-1019.0×F
[2180]-165.7×F[1982]+848.3×F[2100]) 谷氨酸浓度＝-4.064+1.079×(-383.2×F[2190]+1233.0×F[2139]
+122.9×F[1982]-998.5×F[2100]) 菌体浓度＝-1.570+0.321×(-100.1×F[2348]+71.18×F
[2208]+53.83×F[1445] 氨离子浓度＝-2.817+0.856×(-846.5×F[1818]+878.6×F
[1778]-15.8×F[2100])根据在线分析的结果确定流加碳源速率：1.当分析结果＞SV+0.2流加速率＝0.8×C源消耗速率2.SV+0.2≥分析结果＞SV+0.1 流加速率＝0.9×C3.分析结果＝SV 流加速率＝1×C4.SV-0.1＞分析结果≥SV-0.2 流加速率＝1.1×C5.SV-0.2＞分析结果 流加速率＝1.2×C
近红外分光光度计的分析结果输入计算机，计算机按照上述方法计算流加速率，其中SV表示每10分钟大致耗掉多少碳源(这是人为确定的设定值)，碳源消耗速率C是指十分钟前与十分钟时的碳浓度差与时间之比，五种流加速率由计算机确定一种，通过控制器进行流加。
根据上述公式计算的菌体浓度用来确定菌体生长状态，进行温度控制：
初始温度 第一次升温 第二次升温
31.5℃ 当菌体浓度≥5.6g/l 当菌体浓度≥8.0g/l
36℃ 39℃现有技术对pH、罐压和通气量基本保持在一定值，不进行调节。
现有技术有以下不足之处：
1.现有技术提出的培养方法仅仅是用计算机代替人工取样和输送到近红外分光光度计进行分析计算，在测量发酵液里的菌体浓度和其它浓度的方法方面并没有先进新技术。实际上国内早已采用远红外分光光度计721测定菌体浓度和碳源浓度而用酶膜传感技术测定产物浓度，这些都是经典的方法。
2.现有技术提出的在线检测方法是一种静态线性系统定量方法，把样品在各种波长的光照下的吸收率按照经验公式和标准曲线，计算菌体浓度，碳源浓度和产物浓度。事实上，微生物的培养过程表现出随机而非线性的行为，常常不是一堆经验数据能够框住的，譬如用现有技术检测的菌体浓度所反映的是包括死的菌体在内的菌体个数，不能反映菌体的真实生长发育情况，所以这种经典的估算方法只能作为参考。
3.现有技术忽略了需氧微生物培养的最重要条件之一是氧的供给，事实上菌体的需氧情况是随着菌的繁殖和代谢的不同阶段而不同的。现有技术认为pH、罐压和通风量基本维持在一定值而没有通过监测的菌体浓度改变pH和通气量，说明现有技术的方法不合理。
4.现有技术提出的培养方法的重点是根据在线检测的碳源浓度，估算碳源消耗速率，去确定碳源的流加速率。这里存在二种误差：一是近红外分光光度计对不同碳源原材料的透光率不同产生的测量误差；二是碳源消耗速率计算的累计误差，因为碳源的消耗速率是用当前测定的碳浓度减去前次测定的碳浓度除以时间，所以一次计算的流加速率不准确，将会造成后10分钟流加速率不准确，以后每10分钟依次类推，积累误差，直接影响流加碳源的正确性。
5.在现有专利中用近红外分光光度计在线检测氨离子的目的是为了流加氮源，而现有专利又用pH电极检测pH值其目的也是为了流加氮源，这二者以何种检测为流加氮源的依据，因二种测试没有关联，而且氨离子浓度与氨基之间也没有关联，所以控制氨离子浓度没有新的实用意义。
本发明提出一套新的培养方法，是激励微生物菌对碳、氮、氧的摄取，促进菌体生长发育和代谢活力，最终提高产量的方法。本发明方法的重要特征是在通气培养过程中，控制微生物在培养液里的pH和排气中的二氧化碳，使它们呈现反相节律状态。所谓节律状态，就是具有一定周期和强弱幅度变化的脉动或振荡行为。反相节律状态是指CO2和pH的变化周期相同，但是当CO2上升时，pH下降，而CO2下降时，pH上升。CO2达到高峰时，pH恰处在低谷，如图1所示。产生代谢节律的方法是用计算机监测CO2和pH，并由计算机运行控制算法以实现各项操作的协同作用。本发明方法的技术路线如下：
1.根据菌体在培养过程中的不同阶段确定CO2和pH的振荡幅度(设定值)，当CO2达不到设定值时，改变温度、降低风量、补充生物素等，使CO2上升；当CO2达到设定值时，提高风量、流加氮源、流加碳源等，使CO2在设定值以下周期性变化。
2.根据培养过程中各阶段的pH调节范围，用流加氮源来控制振荡周期。培养过程中的各种操作，包括改变温度、pH、供氧量和流加氮源、碳源等，都是用阶跃或开/关方式来完成。
在这样一种培养方法中，每隔1分钟检测一次CO2和pH，并且用实时显示的图形表现它们的动态趋势，经过计算机判断氮源和碳源的消耗状况及时定量补给。与现有技术的根本不同是本发明方法对培养过程进行了动态的优化控制，因为随时可以根据CO2和pH的图形轨迹调整操作设定值，因此培养过程中各种操作均能够被定量化，使复杂的工艺能够被简化，背景材料中现有技术的所有不足之处均可避免。
本发明提出的需氧微生物培养方法中涉及的控制代谢节律的具体做法是建立4组控制回路，如图2所示，其中以pH和CO2的关系为核心，通过多变量控制器把它们与流加氮源、改变通风量、流加生物素、流加碳源结合起来进行协同控制。这四组回路，分别介绍如下：
控制回路(1)：流加氮源作为输入变量，pH和CO2为输出变量，通过多
变量控制器给定pH设定值，控制氮源流加。
控制回路(2)：改变通风量作为过程的输入变量，pH和CO2为输出变
量，通过多变量控制器把CO2的变化反馈给输入，由多变
量控制器给定CO2的设定值，控制风量。
控制回路(3)：流加生物素为输入变量，pH和CO2为输出变量，通过多
变量控制器把CO2的变化反馈给输入，由多变量控制器控
制生物素的流加量，或者改变CO2设定值。
控制回路(4)：流加碳源为输入变量，pH和CO2为输出变量，通过多变
量控制器把CO2的变化反馈给输入，由多变量控制器调节
碳源的间歇流加量，并调节CO2的振荡幅度设定值。
上述四组控制回路中，回路(1)的输入必须采用开/关阀自动执行，其余回路(2)～(4)可以自动也可以人工操作(通常控制回路(2)用人工操作)。
多变量控制器是贮存在计算机微处理器里的程序模块，用来顺序执行预定的控制算法。在本发明方法中多变量控制器的控制算法包括以下二方面内容：
1.振荡周期的设定：
振荡周期的大小与pH的调节度成正比。调节度大，振荡周期大；调节
度小，振荡周期小。
pH控制范围＝pH设定值±pH调节度
pH调节度＝pH调节率％×(pH上量程-pH下量程)
振荡周期＝n×pH调节度 式中n＝每单位pH值下降所需的时间
2.振荡幅度的调节：
振荡幅度的调节采用人工智能逻辑判断算法，例如：发酵前期约0～6
小时之间，提高通气量使CO2达到最大值；发酵中期约6～24小时之间
再次提高通气量，同时流加氮源使CO2控制在中等大小量，发酵中期主
要用提高通气量和补充生物素来调节CO2幅度。在此期间大约从16小时
开始参考离线分析的底物浓度确定流加碳源，保持CO2的振幅。在发酵
后期约24小时～30小时以降低通气量控制CO2在一定值。整个培养过
程CO2的振幅控制在大、中、小三种值。为实现本发明提出的方法，所用的装置和装置里各组成部分如图3所示，需氧发酵过程代谢节律控制装置的结构包括传感器与仪表、控制箱、计算机系统、驱动和执行机构四部分。
1.传感器与仪表：用来在线检测发酵培养液里的温度，pH和排气CO2。
2.控制箱：由多种接口卡组成，用来联接仪表与计算机，进行数据采集
和产生控制信号。
3.计算机系统：用来进行监督控制，执行多变量控制算法，对过程进行
智能化决策，其中包括图形显示和报警，数据贮存和图形数
据的输入/输出。
4.驱动和执行机构，用来完成最优节律控制下的各项操作。上述装置的四个组成部分主要完成检测、过程监督和决策、控制三种功能。各部件内部的连接和详细作用介绍如下：
1.检测：本发明主要的检测量是温度、pH和CO2，其中温度和pH的传感器分别安装在发酵罐罐体上，插到罐内培养基里，传感器输出信号经过变送器输送到控制箱内的信号调理电路，CO2的检测是从发酵罐通气口引出的管道经过干燥器和过滤器输入CO2测示仪，测出的电信号输入控制箱内的信号调理电路。
2.过程监督和决策：这些功能由控制箱和计算机来完成。
(1)控制箱：由电源卡、通信卡、信号调理卡和模数、数模转换、数入/数出卡组成，各卡的作用如下：电源卡用来提供±12、±15V直流稳压电源。通信卡是计算机母线在控制箱内的扩展，使计算机与控制箱联接，传送控制信号和接收从控制箱来的信号。信号调理卡接收来自于检测仪表的信号后，经过隔离、放大、阻抗匹配，输送给模/数转换卡，由计算机完成数据采集。
(2)计算机：包括微处理计算器、批报数据及图形输出打印机、显示器、存储器四个主要部件，各部件的作用如下：微处理计算器一方面进行过程监测和报警，把控制箱输送过来的数据采集信号用图形显示在显示屏幕上，便于操作人员监视培养过程，当培养过程出现异常时自动用声光提示，便于人工干预，消除异常；另一方面依靠微处理器自动执行控制算法(如前面提到的人工智能逻辑判断算法)，确定各控制回路的设定值，同时发出操作指令通过控制箱的数入/数出卡去驱动执行机构。批报及图形输出打印机用来输出每批培养的中间或最终技术资料。显示器用来显示所有图形和数据。存储器用来贮存技术资料档案。
3.控制：发酵过程的控制是由计算机和控制箱通过驱动器和执行机构来完成的，主要的功能部件包括驱动电路和执行机构。其中驱动电路接受来自于控制箱的控制信号，用继电器驱动执行机构。执行机构包括流加氮源和流加碳源的二组计量器和阀门，阀门直接安装在发酵罐顶的输送口上，计量器安装在管道里用来定量流加量。
本发明提出的控制菌体代谢节律的方法不受微生物菌种类不同的限制，适合于任何需氧微生物的培养过程。用于生产各种氨基酸，核酸和古龙酸例如用在生产L-谷氨酸的培养过程中，对T6-13菌或F9114菌同样有效，同样具有激励菌体生长和代谢活力，促进菌体排泄功能的作用。无论是分批发酵工艺(一次投料产出)或是补料—分批发酵工艺(Fed-Batch)过程，本方法同样能够获得提高产率和缩短周期的效果。本方法籍助于计算机显示微生物呼吸和消耗氮源的动态轨迹，直接进行自动相关控制，对离线取样分析的菌体浓度、碳源浓度、产物浓度的依赖性比任何其他培养方法小得多，另外本发明所使用的发酵罐可以是任意规格和任何形状，例如：各种吨位的搅拌式发酵罐或是气升式发酵罐。还有，对于所用氮源的种类没有任何限制，例如可以是尿素、气氨或液氨。这些都说明本发明方法特别适合于工业规模的发酵过程。
附图说明图1.CO2与pH之间的非线性对应关系图2.以CO2与pH为主回路的节律控制方法粗框图图3.需氧发酵代谢节律控制装置的结构总框图图4.在谷氨酸生产150M3发酵罐上的应用实例1.和实例2.图5.应用实例1.和实例2.的非线性控制实时图形图6.应用实例1.和实例2.的发酵状态离线分析结果图7.未采用本实用新型和节律控制方法的150M3发酵罐的设备比较例图8.比较例的在线控制图形图9.比较例的发酵状态离线分析结果
应用实例：用控制菌体代谢节律方法发酵生产谷氨酸的工业现场装备配套示意图如图4所示1.实例一：工业谷氨酸发酵，150吨规模 微生物菌 SF119短杆菌 发酵罐 150M3搅拌罐
成分 浓度 培养基配方 淀粉水解糖 16.07％
1.1～1.2％
硫酸镁 0.06～0.07％
玉米浆 0.43％
糖 蜜 0.04％
氯化钾 0.1％控制条件 温度 三级 35℃～37℃～39℃
罐压 0.7MPa
风量设定 三级提风 700→1100→1500→1800
三级降风 →1600→1500→1300
pH设定 7.4→7.3→7.2→7.1→7.0
搅拌速度 150转/分
停止发酵条件 残糖＜0.6％
发酵周期 30小时
流加糖量 3.53％培养方法：主发酵罐内培养基经消毒(140℃)40分钟，冷却后从种子
罐接入SF119菌液开始培养，图4所示为150M3发酵罐上装
备的发酵代谢节律控制装置，其中在线检测量为温度、pH、
CO2，离线检测信号为菌体浓度，残糖浓度和谷氨酸浓度。节律的设定
发酵前期 发酵中期 发酵后期
振荡周期(分钟) 7.5 7.5 7.5
振荡幅度(CO2％) 8～13 6～8 0～6控制回路(1)：
CO2与pH的回路设定值
pH CO2 定时(小时)
7.4 8％＜CO2＜13％ 0＜t＜12
7.2 8％＜CO2＜10％ 12＜t＜24
7.1 5％＜CO2＜8％ 24＜t＜28
7.0 0％＜CO2＜5％ 28＜t＜30
6.9 30＜t＜32控制回路(2)
通风量与CO2之间的关系(用人工调节阀门)
通风量(米3/小时) CO2含量 定时(小时)
700 CO2＝0 t＝0
1100 CO2＞4％ t＜8
1500 4％＜CO2＜12％ t＜8
1800 CO2≥12％ t＜8
1600 9％≤CO2＜12％ t＞24
1500 5％＜CO2＜19％ t＞24
1300 2％CO2＜5％ t＞24控制回路(3)
本批发酵未加生物素，因为离线分析的菌体浊度6小时已
经达到净增＞0.6g/l。同时CO2限幅达到12％，说明菌体数
和发育情况良好，不用再加生物素。控制回路(4)
流加糖控制 残糖含量 CO2含量
24.4％糖液 5.5吨 S≤3.6％ 5％＜CO2＜8％
(计量罐输出量) 4吨 S≤2.6％ 5％＜CO2＜8％
3吨 S≤1.6％ 5％＜CO2＜8％本批发酵产酸率10％，转化率60.8％，发酵周期30小时控制节律如图5(上)所示，谷氨酸发酵过程的三种离线状态分析结果如图6(上)所示。2.实例二：工业谷氨酸发酵，150吨规模 微生物菌 SF119短杆菌 发酵罐 150M3搅拌罐
成分 浓度培养基配方 淀粉水解糖 16.2％ 1.1～1.2％
硫酸镁 0.06～0.07％
玉米浆 0.45％
糖 蜜 0.042％
氯化钾 0.1％控制条件 温度 三级 35℃～37℃～39℃
罐压 0.7MPa
风量设定 三级提风 700→1100→1500→1800
三级降风 →1600→1500→1300
pH设定 7.4→7.3→7.2→7.1→7.0
搅拌速度 150转/分
停止发酵条件 残糖＜0.6％
发酵周期 32小时
流加糖量 3.1％培养方法：主发酵罐内培养基经消毒(140℃)40分钟，冷却后从
种子罐接入SF119菌液开始培养，图4所示为150M3发
酵罐上装备的发酵代谢节律控制装置，其中在线检测量
为温度、pH、CO2，离线检测信号为菌体浓度，残糖
浓度和谷氨酸浓度。节律设定值
发酵前期 发酵中期 发酵后期
振荡周期(分钟) 15 15 10.5
振荡幅度(CO2％) 8～13 6～8 0～6控制回路(1)：
CO2与pH的回路设定值
pH CO2 定时(小时)
7.4 8％＜CO2＜13％ 0＜t＜12
7.2 8％＜CO2＜10％ 12＜t＜24
7.1 5％＜CO2＜8％ 24＜t＜28
7.0 0％＜CO2＜5％ 28＜t＜30
6.9 30＜t＜32控制回路(2)
通风量与CO2之间的关系(用人工调节阀门)
通风量(米3/小时) CO2含量 定时(小时)
700 CO2＝0 t＝0
1100 CO2＞4％ t＜8
1500 4％＜CO2＜12％ t＜8
1800 CO2≥12％ t＜8
1600 9％≤CO2＜12％ t＞24
1500 5％＜CO2＜19％ t＞24
1300 2％CO2＜5％ t＞24控制回路(3)
本批发酵未加生物素，因为离线分析的菌体浊度6小时
已经达到净增＞0.6kg/l。同时CO2限幅达到12％，说明
菌体数和发育情况良好，不用再加生物素。控制回路(4)
流加糖控制 残糖含量 CO2含量
24.4％糖液 5.5吨 S≤3.6％ 5％＜CO2＜8
％
(计量罐输出量) 4吨 S≤2.6％ 5％＜CO2＜8
％
3吨 S≤1.6％ 5％＜CO2＜8
％发酵结果：产酸率9.21％，转化率58％，发酵周期32小时。控制节律如图5(下)所示，状态分析结果如图6(下)所示。实例2比实例1的周期长了2个小时，产酸率和转化率相应点都低一些，说明该菌株的代谢控制周期小一些较合适。3.比较例： 工业谷氨酸，150吨(未采用节律控制方法的150吨搅拌罐)的装备 情况如图7所示 微生物菌 SF119短杆菌 发酵罐 150M3搅拌罐
成分 浓度培养基配方 淀粉水解糖 16.07％ 1.1～1.2％
硫酸镁 0.06～0.07％
玉米浆 0.43％
糖 蜜 0.04％
氯化钾 0.1％控制条件 温度 三级 35℃～37℃～39℃
罐压 0.7MPa
风量设定 三级提风700→1100→1500→1800
三级降风→1600→1500→1300
pH设定 7.4→7.3→7.2→7.1→7.0
搅拌速度 150转/分
停止发酵条件 残糖＜0.6％
发酵周期 30小时
流加糖量 3.53％培养方法：主发酵罐内培养基经消毒(140℃)40分钟，冷却后从
种子罐接入SF119菌液开始培养，图4所示为150M3发酵
罐上装备的发酵代谢节律控制装置，其中在线检测量为温
度、pH、CO2，离线检测信号为菌体浓度、残糖浓度和
谷氨酸浓度。回路(1)
根据pH值，用人工调液氨+气氨
pH 定时(小时)
7.3 0＜t＜6
7.2 6＜t＜16
7.1 16＜t＜24
7.0 24＜t＜28
6.9 28＜t＜32回路(2)
通风量与CO2之间的关系(用人工调节阀门)
通风量(米3/小时) CO2含量 定时(小时)
700 CO2＝0 t＝0
1100 CO2＞4％ t＜8
1500 4％＜CO2＜12％ t＜8
1800 CO2≥12％ t＜8
1600 9％≤CO2＜12％ t＞24
1500 5％＜CO2＜19％ t＞24
1300 2％CO2＜5％ t＞24回路(3) 本批发酵未流加生物素。
回路(4)
流加糖控制 残糖含量 CO2含量
24.4％糖液 5.5吨 S≤3.6％ 5％＜CO2＜8％
(计量罐输出量)3.4吨 S≤2.6％ 5％＜CO2＜8％
2～3吨 S≤1.6％ 5％＜CO2＜8％
本例所有各种条件与例1.例2.相仿，所不同的是没有进行代谢振荡节律
控制，而是根据CO2的变化趋势调节生物素、流加糖和流加液氨的速率
控制pH在适当值，其在线控制的图形如8所示。发酵结果如图9所示。
产酸率8.6％，转化率57％，周期32小时。经济效益：采用微生物代谢节律控制进行发酵过程可以获得以下效益：1.提高单位体积发酵罐的发酵强度0.1～0.2；2.使产酸率相对提高5～10％，转化率相对提高5％；3.可缩短发酵周期，节约原材料和节约电、水、能量折合为平均每批次降低 成本8％以上。