非放射性细胞增殖测定试剂及其配制方法 本发明涉及一种用于细胞增殖测定的组合物。
细胞增殖测定在组织细胞培养研究中必不可少。近来年更广泛用于细胞生物学中各种多肽生长因子、调节因子、抑制因子以及细胞毒素等生物活性的测定中，细胞增殖测定方法在应用中不断改进。
近年来国内、外有关实验室广泛采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应法测定细胞增殖，该方法由Mosmann等于1983年创立。主要原理是活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶能催化淡黄色的四甲基偶氮唑盐，使之还原为蓝黑色的甲，其形成量与细胞数及细胞功能状态呈正相关。通过酶联仪在一定波长段比色分析，即可反映细胞增殖情况。该方法的特点是既简便快速，又准确敏感，不接触同位素，而实验结果又与同位素掺入法有良好相关性。所以，MTT检测方法一经创立，便迅速得到科研工作者的认可与推广。目前，国内实验室采用MTT检测法，多为临时自配MTT染液及反应终止液。由此带来明显的缺陷：一、造成物力人力浪费。自配的MTT染液，有效期一般仅为2周，这对众多科研及检测单位来说，难以做到物尽其用，每次实验不得不重新配制；二、造成实验误差。MTT检测法的关键在于MTT反应终止液的配制。现有技术配制的MTT反应终止液的缺陷主要表现在蓝黑色甲结晶溶解不彻底，蛋白质絮状沉淀较多，所获OD值偏低。另外，终止反应呈色不稳定，其OD值在数小时内就会逐渐下降，不利于重复测定。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种MTT染液及其配制方法，能够提高其有效使用期，避免人力物力的浪费。
本发明的另一个目的是提供一种MTT法反应终止液及其配制方法，提高反应终止液地溶解效果以及呈色反应的稳定性和可靠性。
本发明的目的由以下措施来实现：
MTT染液及其配制方法；将MTT溶解于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲生理盐水中，MTT含量为2～8mgMTT/ml缓冲生理盐水加温至37℃，并振荡，用微孔滤膜过滤除菌，避光保存在-20℃以下。
反应终止液及其配制方法；反应终止液由十二烷基硫酸钠、二甲基甲酰胺、双蒸水组成，其重量比为0.34～0.46∶0.7～1.3∶1。将上述三种组分混合均匀，用冰乙酸调节pH为4.3～5.3，加温至37℃，并反复振荡，使十二烷基硫酸钠完全溶解，离心，除去杂质，常温下保存。
实施例
1、MTT染液的配制：
(1)配制0.01M磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲生理盐水，pH7.4；
(2)按5mgMTT/ml上述缓冲生理盐水配制MTT溶液；
(3)加温至37℃，并振荡，使MTT完全溶解；
(4)用0.22μm滤膜双层过滤除菌，于-20℃以下避光保存。
2、反应终止液的配制：
(1)按十二烷基硫酸钠∶二甲基甲酰胺∶双蒸水(重量比)＝0.4∶1∶1混合均匀；
(2)用冰乙酸调节上述溶液的pH为4.8；
(3)加温至37℃，并反复振荡，使十二烷基硫酸钠完全溶解；
(4)以3000rn离心，除去杂质，于常温下保存。
为证明本发明所述的MTT染液和反应终止液的使用效果，做以下对比试验一、材料
1、贴壁生长的Smiss 3T3细胞株，中国军事医学科学院基础所提供。
2、不同贮存期的现有技术试剂和本发明试剂。
3、3H-TdR，中国原子能科学研究院产品，订购后一年内使用。
4、仪器：西德Heraeus公司B5060型二氧化碳培养箱。国产DG-3022型酶联仪。二、方法
1、传代培养生长良好的L929细胞，0.25％Trypsin-0.02％EDTA消化、洗涤二次，计数，再以10％MBS的DMEN培液将细胞稀释成不同浓度，加入96孔平底培养板(美国Corning公司产品)，100μl/孔，同一稀释度设三个复孔。
2、将细胞置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养12小时，见细胞贴壁，形态良好。加入MTT染液15μl/孔，继续培养4小时后加入反应终止液，100μl/。孔微型振荡器上振荡10分钟，密封后置37℃饱和湿环境下待测。
3、酶联仪测定OD值，检测波长570nm，参考波长630nm，并在终止液加入后12、24、36及72小时多次监测，观察其OD值稳定性。三、结果
见图一。从图一可见，本发明试剂贮放8个月后使用仍然有效可靠，质量不变，且比同类试剂敏感准确。而现有技术生产的同类试剂置放8个月后质量明显下降，不能反映实际的细胞数量。
本发明所述的MTT染液经过彻底溶解和严格的过滤后，既可排除细菌等微生物的存在和生长，又可排除各种杂质的干扰。采取这些措施后，不但保证了MTT染液的有效期，而且也避免了在测试时对酶联仪的干扰，给使用者提供了极大的便利。
试验证明，反应终止液含有任何微小的杂质颗粒均会明显干扰酶联仪所示的OD值。本发明采用醋酸调节终止液的pH为4.8，可避免蛋白质絮状沉淀的出现；同时以3000rpn离心，即可最大限度地排除各种杂质，从而显著提高反应终止液呈色反应的稳定性和可靠性。
图1是：不同MTT染液和反应终止液测试结果的比较。