一种活性重组酰胺化酶及其对多肽的酰胺化修饰应用 本发明涉及酰胺化酶的基因工程活性表达和对多肽的C端酰胺化加工。
大量具有药用价值的激素、神经肽、毒肽等C末端均为酰胺化修饰，这对其生物活性和稳定性都是十分重要的。例如降钙素，若以非酰胺化的Pro残基替代天然的酰胺化Pro，则其生物活性要下降3,000倍。此翻译后加工过程由酰胺化酶—甘氨肽酰化单氧酶(Peptidylglycineα-Amidating Monooxygenase，PAM，EC1.14.17.3)催化完成(Bradbury A.F.，et al.，1982，Nature，298：686)。酰胺化酶广泛地存在于两栖类到人的组织中，且有较高的同源性。但基因工程常用的大肠杆菌等原核生物和已建立的昆虫细胞系中，却缺乏该酶活性，表达产物没有翻译后的酰胺化加工。
因而酰胺化酶的开发研究就显得十分必要。PAM可以从含量及活性高的组织中分离纯化，例如血清、人甲状腺、蛙皮、大鼠髓样甲状腺瘤组织及细胞株、猪心房、猪垂体等，这方面国际上已有不少专利报道。但从天然组织中提取酰胺化酶的方法，受到材料来源的限制，纯化工艺繁琐，另外纯化产物往往带有组织中的蛋白酶的污染，在对多肽的修饰过程中，造成对底物、酰胺化产物以及酶本身地降解，从而影响其进一步的开发应用。用基因工程方法生产酰胺化酶，是另一条途径。
PAM cDNA已从多种种属中被克隆，并在多种哺乳动物细胞中得到活性表达(Eipper B.A.，et al.，1991，J.Biol.Chem.，266：7827；Kato I.，et al.，1990，Biochem.Biophy.Res.Commun.，172：197；Mains R.E.，et al.，1991，Mol.Endocrinol.，5：187)，但仅限于基础研究。在大肠杆菌中也还未见有活性表达的报道，复性也极为困难。杆状病毒表达载体是近年来发展起来的新型表达载体系统，利用该系统可在昆虫细胞和虫体中高效表达外源基因，产量可远高于哺乳动物细胞，而且有较完善的翻译后加工体系，如二硫键配对、糖基化等，因此在基因工程药物生产中较细菌、酵母、哺乳动物细胞等体系更具潜在的优势(Karl M.，et al.，1994，Insect Cell Biotechnology，CRC press)。
PAM是在多肽生物合成中被发现的第一个双功能酶，有两个催化结构域—氧化酶(PHM)和裂解酶(PAL)，生理pH条件下，顺序催化酰胺化的两步反应：末端为Gly的肽前体首先由PHM氧化为肽酰羟化甘氨酸中间体，然后经PAL裂解为酰胺化产物和乙醛酸。但研究中发现，碱性条件下不需PAL的作用，中间体可自发转化为产物(Eipper B.A.，et al.，1991，J.Biol.Chem.，266：7827)。因而在酰胺化反应中，PHM比PAL更为重要。既然单单PHM已可满足酰胺化加工的要求，而且一般来说，单表达PHM比表达PAM全酶，更容易且产率高，因此PHM的活性表达在酰胺化酶的基因工程生产中更有意义。
为此，本发明的目的是将克隆的带有信号肽和前导肽的大鼠的PHM催化结构域编码序列，重组入昆虫杆状病毒转移表达载体中，在昆虫细胞sf21中实现活性表达，表达的产物可直接用于甘氨肽的酰胺化修饰。
本发明提供了一种克隆的带有信号肽和前导肽的大鼠的PHM催化结构域编码基因。通过噬菌体原位杂交和PCR方法，从大鼠的脑cDNA库中筛选到PAM的三个基因片段(图1中片段P为筛库的探针，a，b和c为所筛选到的PAM基因片段)，经DNA全序列分析，片段a为502bp，编码rPAM N端信号肽、前导肽及部分成熟蛋白部分；片段b为422bp，编码rPAM的氧化酶结构域PHM的部分序列；片段c为2388bp，包括编码部分氧化酶结构域PHM、全部裂解酶PAL结构域、跨膜区序列、C端胞质区的序列及一部分3′端非翻译序列。上述三个基因片段部分重叠，跨越rPAM的全酶编码序列，但它们无合适的限制性酶切位点进行重组。通过设计适宜引物，将片段c中PHM的编码序列用PCR扩增出，并与片段a和b通过PCR重组，获得完整的PHM编码序列(图2，图3)；
本发明还提供了含PHM基因的昆虫杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2及可用于在昆虫细胞sf21或sf9中分泌表达活性型PHM的重组病毒BacPHM(由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，1997年3月5日，保藏编号为CGMCC0295)。将拼接获得的完整的PHM编码序列(含信号肽和前导肽)，通过酶切位点EcoRI和BamHI，插入昆虫杆状病毒转移表达载体pBacPAK8(CLONTECH公司产品，产品目录号为6145-1)，构建成表达质粒pBacPHM2(图4)；pBacPHM2与修饰的苜蓿尺蠖核多角体病毒BacPAK6线性化DNA共转染秋粘虫细胞sf21，通过同源重组得到在核多角体蛋白基因启动子(polyhedrin promoter)控制下的PHM基因的重组病毒BacPHM。
本发明还提供了BacPHM感染sf21细胞后的活性表达产物—单功能酰胺化酶PHM。用BacPHM感染sf21细胞，无血清培养上清在72h后检测到酰胺化酶最高活力(图5)；分泌至培养基中的酶活力远高于胞内(图7)；经聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和PAM的特异性抗体的蛋白质印迹(western blot)分析，表达产物分子量约为41kD(图6，C和S分别为感染BacPHM的～105个sf21细胞胞内及～10μl培养基上清中的蛋白，C0和S0分别为感染BacPAK6的sf21细胞胞内及培养基上清中的蛋白。)；分泌至培养基中的产量约为1μg/ml培养基。重组PHM可对C末端为Gly的多肽进行酰胺化修饰。以α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly三肽为底物，其酰胺化反应最适pH约为5.0(图8)。
本发明还利用重组的PHM对甘氨肽进行酰胺化修饰。以α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly和D-Tyr-Val-Gly为例，在微酸性及中性pH条件下，PHM可将它们分别转为α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly(OH)和D-Tyr-Val-Gly(OH)中间产物；而反应体系中加入0.1M NaOH时，所生成的中间产物可在1分钟内完全转为酰胺化产物；底物和产物可通过HPLC进行分离。
综上，本发明优点如下：利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达酰胺化酶，产量可远高于哺乳动物细胞，还能建立悬浮培养体系，利于该酶的产业化生产；同时在昆虫细胞中引入了酰胺化酶活性，利于昆虫细胞中表达产物的翻译后酰胺化修饰；单表达PHM比表达PAM全酶，其转录、翻译效率要高，表达产物要稳定，不涉及全酶中两个结构域在折叠中的相互影响，而且已经可满足酰胺化加工的要求；克隆表达的PHM带有信号肽和前导肽，有效引导了表达产物的外泌，利于产物的纯化和稳定性，避免胞内蛋白酶的降解，也为重组病毒的筛选提供了方便，只需检测细胞分泌至无血清培养基中的酰胺化酶活性，即可挑出阳性病毒。昆虫细胞中表达的活性PHM在基础理论研究和医药开发应用方面均具有重要的意义。
附图说明：
图1.大鼠PAM蛋白和cDNA的结构以及所筛选的PAM基因片段a，b，c相对全基因的位置和核苷酸序列。
图2.PHM的DNA拼接战略。
图3.PHM的DNA核苷酸及相应编码的氨基酸序列。
图4.昆虫细胞的PHM的转移表达质粒的构建。
图5.重组病毒BacPHM感染sf21细胞的表达时相。
图6.被重组病毒BacPHM感染的sf21细胞表达产物的western blot分析。
图7.重组病毒BacPHM感染的sf21细胞胞内及培养基上清中的酰胺化酶活力比较。
图8.昆虫细胞表达的PHM的酶活力和反应pH值的关系。
图9.重组PHM与两种甘氨肽反应后的HPLC分析。a，标准D-Tyr-Val-Gly和D-Tyr-Val-NH2 HPLC分析；b，D-Tyr-Val-Gly与失活的PHM反应后HPLC分析；c，D-Tyr-Val-Gly与活性PHM反应后HPLC分析；d，标准α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly和α-N-acetyl-Tyr-Val-NH2 HPLC分析；e，α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly与失活的PHM反应后HPLC分析；f，α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly与活性PHM反应后HPLC分析。
图10.D-Tyr-Val-Gly(A)和α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly(B)经重组酰胺化酶修饰后的产物的质谱分析。
本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1.大鼠PHM cDNA基因片段的筛选和克隆
从大鼠脑cDNA库(Stratagene公司产品，#936515)中，通过噬菌斑原位杂交和PCR方法，筛选和克隆PAM cDNA基因片段。PAM探针DNA(图1中片段P)，按随机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)推荐方法进行同位素标记。噬菌斑原位杂交方法按cDNA库说明书推荐方法。经两轮杂交筛选，获得两个阳性杂交克隆。经全序列测定，它们在全基因中的位置如图1片段c和片段b。b，c尚未覆盖PHM全编码序列。为获得片段b前面的编码序列，设计合成一对引物：
引物1： 5′CTGCGAATTCATGGCCGGACG 3′
引物1′：5′GCTTCCAGTTTCTCCTCCAAC 3′
其中5′端引物1带有限制性内切酶EcoRI识别位点和编码PAM N端信号肽的若干密码子，用PCR方法扩增基因片段。加2μlλcDNA库于20μl重蒸水中，置70℃水浴保温5min，然后放入冰中冷却。加入10μl10×PCR缓冲液，8μl2.5mmol/L dNTP，3μl50mmol/L MgCl2，两种引物各100pmol，Taq DNA聚合酶2.5单位，使终体积为100μl，在DNA Thermal Cycle480扩增仪上进行PCR循环。94℃变性、55℃复性、72℃延伸各1分钟，35个循环后，在72℃下延伸15min，最后保温在4℃。用PCR方法从原库中扩增获得～502bp片段(图1片段a)，序列分析证明其编码大鼠PAM信号肽、前导肽和PHM结构域N端部分序列。
自片段a、b、c可拼接获得带有信号肽的rPHM的全部编码序列。因没有合适的酶切位点进行重组，进而设计合成引物，并采用新一代PCR重组技术，将片段进行拼接。PCR重组拼接战略如图2。引物1如上所述。引物2为5′CATGGAAAGGATCCTGCTCTAAT AC3′，其中相应增加的3个碱基CCT编码Pro，使在rPHM和rPAL编码区的衔接处构建了一BamH1切点。用M13反向引物和正向引物，从含片段b的pBluescript SK+质粒中扩增获得～640bp片段F1；F1与片段a有部分重叠序列，经变性、退火，作一步延伸反应。再用引物1和M13正向引物，扩增出约1000bp的片段a和b的拼接产物F2。同样，以M13反向引物和引物2，从克隆片段c中，经PCR扩增出～480bp的片段F3。F2经EcoRI单酶切后的3′端与F3有90bp的重叠。将两者一起变性，退火后，作一步延伸反应。再加入引物1、引物2，PCR扩增获得～1160bp的片段F4。F4经全序列分析，证明为完整的大鼠preproPHM编码基因(图3)。
实施例2.重组PHM在昆虫杆状病毒(Baculovirus)系统中的表达
a.昆虫杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2的构建基因片段F4包含大鼠PAM信号肽、前导肽和PHM编码区序列，通过EcoRI和BamHI酶切位点，插入昆虫杆状病毒转移表达载体pBacPAK8，使大鼠PHM基因处于核多角体蛋白启动子(ph promoter)控制之下，构建成杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2(图4)。
b.表达大鼠PHM基因的重组病毒BacPHM的获得
昆虫杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2和修饰的苜蓿尺蠖核多角体病毒BacPAK6的Bau36AI酶解线性化DNA，在脂质体介导下共转染sf21细胞。共转染上清再感染sf21细胞并进行空斑筛选。重组病毒的筛选采用的是酶活测定方法。挑取的空斑病毒扩增后，感染96孔板细胞，并换无血清昆虫细胞培养基SF-900II培养，三天后吸取培养基进行酰胺化测活。以125I标记的α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly三肽为底物，检测酰胺化酶活力。碘标采用IODO-GEN法。40μl酶活测定反应体系中，含有25μM底物，1～2μg胞内蛋白样品或10μl培养基，120mM Na(MES)pH6.0，1μM CuSO4，1mM抗坏血酸，N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-Ethylmaleimide，NEMI)0.5mM和0.25mg/ml过氧化氢酶。样品均以双份在37℃保温4h。反应结束，加入10μl 1N NaOH，0.05％三甲胺饱和的乙酸乙酯抽提。在碱性条件下用乙酸乙酯抽提，酰胺化产物α-N-acetyl-Tyr-Val-NH2疏水性极强，进入有机相，而未反应底物则溶于水相中。吸取上层有机相，测γ计数，计算产物的生成量。表达活性高的病毒再进行一轮空斑筛选，最终获得表达PHM高活力的阳性单克隆重组病毒BacPHM。
c.大鼠PHM在秋粘虫细胞sf21中的表达
首先确定PHM的表达时相。将纯化的重组病毒BacPHM，感染sf21细胞，并换无血清培养基SF-900II培养，于每天取少量感染上清，检测培养基中酰胺化酶活性，在感染24h后，即可检测到培养基中明显的酰胺化酶活。在第三天，培养基中的酶活达到最高，随后又下降(图5)。分别对胞内及培养基中表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。病毒感染细胞3天后，收集培养基，加入等体积Laemili上样缓冲液，制备胞外蛋白样品；贴壁细胞悬浮于20mM Na(TES)，pH7.5/10mM甘露醇/1％TritonX-100溶液中，液氮中冻融，离心后上清制备细胞胞内蛋白样品。Western-blot分析结果表明(图6)，细胞胞内及培养基上清中均有明显与PHM抗血清反应的条带，显示的分子量约为41kD，表达产物的N端已去掉信号肽。
分别测定胞内及培养基上清中表达产物的酰胺化活性，测活方法同前。酶液与125I-Ac-Tyr-Val-Gly底物保温4h后，加入NaOH，使反应中间产物转化为酰胺化产物，乙酸乙酯抽提相的γ计数显示(图7)，胞内及培养基中表达的PHM均有明显的酰胺化活力，且分泌于培养基中的酶活远高于胞内，而对照组感染BacPAK6(不含PHM基因的病毒)的细胞，胞内及培养基上清中均未检测到酰胺化酶活性。
实施例3.重组表达的酰胺化酶对甘氨肽进行酰胺化加工修饰及其产物的检测
浓缩10倍的含PHM的无血清培养基10μl分别与8nmolα-N-acetyl-Tyr-Val-Gly或D-Tyr-Val-Gly保温4h后，加入NaOH至终浓度0.2M，1min内反应中间产物可完全转为酰胺化产物。15,000rpm离心10min，反应液全部上HPLC柱(KONTRON高压二元梯度HPLC系统-DAD型，柱为RP18 Spheri-5，ABI，4.6×100mm)。HPLC A液为1mM NH4HCO3，pH9.0，B液为乙腈，280nm检测。乙腈在8min内由0％连续洗脱至50％。以加热失活(100℃，15min)的PHM反应产物作为对照。
HPLC结果表明(图9)，表达的PHM对两种甘氨肽均能酰胺化，未观察到加工中中间产物的积累。收集产物峰，进一步用ESI质谱分析(图10)。理论推算α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly和D-Tyr-Val-Gly的分子量分别为380和338，而N-acetyl-Tyr-Val-NH2和D-Tyr-Val-NH2的分子量分别为322和281。质谱分析结果显示，D-Tyr-Val-Gly(图10A)和N-acetyl-Tyr-Val-Gly(图10B)经酰胺化酶修饰产物子量均与理论推算相符(*号所示)。