一种去除制备中性氨基酸的反应体系中的丙氨酸的方法.pdf

本发明提供了一种去除制备中性氨基酸的反应体系中的丙氨酸的方法，其中制备中性氨基酸的反应体系为采用转氨酶法或发酵法制备中性氨基酸的反应体系。本发明提供的方法为向上述反应体系中加入丙氨酸消旋酶和能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂，从而特异性地去除上述反应体系中的丙氨酸。使用本发明提供的方法，可特异性地去除转化液或发酵液中的丙氨酸，从而简化了中性目标氨基酸的分离纯化和精制工艺。

权利要求书
1.  一种去除制备中性氨基酸的反应体系中的丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括向所述反应体系中加入丙氨酸消旋酶和能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂，通过两者的共同催化去除所述反应体系中的丙氨酸。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性氨基酸包括L-2-氨基丁酸，L-叔亮氨酸，L-正缬氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸，D-色氨酸，D-亮氨酸，L-异亮氨酸，D-缬氨酸和D-叔亮氨酸。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙氨酸消旋酶是具有高氨基酸特异性的丙氨酸消旋酶，选自：来源于枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌或嗜热脂肪芽胞杆菌的丙氨酸消旋酶。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂为具有光学特异性、可以作用于L-丙氨酸或者D-丙氨酸的酶，这些酶选自：氨基酸氧化酶、氨基酸酰化酶、和氨基酸氨基转氨酶。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系的目标产物是L-氨基酸，所述能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂选自：D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸酰化酶、D-氨基酸转氨酶、以及对D-氨基酸有特异性的酯化酶。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶选自：猪肾来源的D-氨基酸氧化酶(pkDAAO)，三角酵母来源的D-氨基酸氧化酶(TvDAAO)，以及红酵母来源的D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)。

7.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸转氨酶选自：来源于枯草芽孢杆菌的D-氨基酸转氨酶，来源于球形芽孢杆菌的D-氨基酸转氨酶，以及来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的D-氨基酸转氨酶。

8.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系的目标产物是D-氨基酸，所述能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂选自：L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸酰化酶、L-氨基酸氨基转移酶、以及对L-氨基酸有特异性的酯化酶。

9.  如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述L-氨基酸氧化酶选自：来源于混浊红球菌的L-氨基酸氧化酶，来源于产粘变形菌L-氨基酸氧化酶，以及来源于蛇类的L-氨基酸氧化酶。

说明书一种去除制备中性氨基酸的反应体系中的丙氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种去除制备中性氨基酸的反应体系中的丙氨酸的方法。
背景技术
中性氨基酸包括非天然手性α-氨基酸，L-缬氨酸，L-异亮氨酸以及L-亮氨酸等。其中，非天然手性α-氨基酸主要包括L-2-氨基丁酸、L-叔亮氨酸、L-正缬氨酸等L-氨基酸以及D-色氨酸、D-亮氨酸、D-缬氨酸、D-叔亮氨酸等D-氨基酸。其中，非天然手性α-氨基酸除了具有天然氨基酸的大部分功能外，还具有非天然氨基酸所不具备的优良性能，在药物合成(医药和农药)、食品、化妆品等方面具有广泛的用途，特别是在药物合成方面具有广泛的市场前景，成为近年来发展最快的手性药物中间体。而L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸都是必需氨基酸，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中占有特别重要的地位，因此具有重要用途，现主要用于配制复合氨基酸制剂，特别是应用于高支链氨基酸输液及口服液。
制备非天然L-氨基酸和D-氨基酸的方法有转氨酶法等，制备L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的方法有发酵法等。但是在转氨酶法和发酵法制备上述中性氨基酸时，随着上述中性氨基酸的产生，都会伴随着丙氨酸的产生，特别是在工业生产时，丙氨酸相对于目标氨基酸含量比较高，这对L-2-氨基丁酸、L-叔亮氨酸、L-缬氨酸、L-正缬氨酸、D-色氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-叔亮氨酸等中性氨基酸的分离纯化和精制带来较大困难。
但由于中性氨基酸和丙氨酸理化性质相似，因此，采用常规层析和简单的结晶方法难以去除其中的D-丙氨酸或者L-丙氨酸，而多步重结晶又影响纯化和精制的收率，增加成本。因此，一种低成本的去除丙氨酸的方法亟待开发。
发明内容
本发明的目的就在于，针对现有转氨酶法或发酵法制备的中性氨基酸的反应体系中丙氨酸难以去除，或者去除的同时降低目标氨基酸的得率的问题，提供一种去除制备中性氨基酸的反应体系中的丙氨酸的方法，可以特异性的去除体系中的丙氨酸，而对于目标氨基酸的得率影响非常小，从而可以减少后续纯化步骤，降低纯化成本。
本发明的去除制备中性氨基酸的反应体系中的丙氨酸的方法，包括向所述反应体系中加入丙氨酸消旋酶和能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂，通过两者的共同催化去除所述反应体系中的丙氨酸。
根据本发明，能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂包括：氨基酸氧化酶、氨基酸酰化酶、氨基酸氨基转移酶，氨基酸酯酶。
根据本发明，使用的丙氨酸消旋酶包括来源于枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌或嗜热脂肪芽胞杆菌的丙氨酸消旋酶。
根据本发明，使用的能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂为具有光学特异性、可以作用于L-丙氨酸或者D-丙氨酸的酶，这些酶选自：氨基酸氧化酶、氨基酸酰化酶、和氨基酸氨基转氨酶。
根据本发明的一个优选实施例，当反应体系的目标产物是L-氨基酸时，使用的能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂选自：D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸酰化酶、D-氨基酸转氨酶、以及对D-氨基酸有特异性的酯化酶。
根据本发明的一个优选实施例，使用的D-氨基酸氧化酶选自：猪肾来源的D-氨基酸氧化酶(pkDAAO)，三角酵母来源的D-氨基酸氧化酶(TvDAAO)，以及红酵母来源的D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)。
根据本发明的一个优选实施例，使用的D-氨基酸转氨酶选自：来源于枯草芽孢杆菌的D-氨基酸转氨酶，来源于球形芽孢杆菌的D-氨基酸转氨酶，以及来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的D-氨基酸转氨酶。
根据本发明的一个优选实施例，当反应体系的目标产物是D-氨基酸时，使用的能专一性催化单一手性氨基酸发生进一步反应的催化剂选自：L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸酰化酶、L-氨基酸氨基转移酶、以及对L-氨基酸有特异性的酯化酶。
根据本发明的一个优选实施例，使用的L-氨基酸氧化酶选自：来源于混浊红球菌的L-氨基酸氧化酶，来源于产粘变形菌L-氨基酸氧化酶，以及来源于蛇类的L-氨基酸氧化酶。
使用本发明提供的方法，可特异性地去除制备中性氨基酸的转化液或发酵液中的丙氨酸，而对于目标氨基酸的消旋化影响很小，因而可以在确保目标氨基酸不被消旋的情况下，简化目标氨基酸的分离纯化和精制工艺，从而增加得率。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明的下述实施例中，氨基酸的分析检测方法参照参考文献(“反相液相色谱法测定乌桕叶中氨基酸含量”，江西农业学报：2007，19(3)，99-101，魏京广，霍光华等)中的方法进行。
在本发明的下述实施例中，氨基酸的光学活性分析参照参考文献(“高效液相色谱与化学计量学方法联用测定多种氨基酸对映体”，曲阜师范大学学报：2005.7，31(3)，86-89，刘广军)中的方法进行。
在本发明的下述实施例中，针对的目标溶液体系为采用常规的转氨酶法或发酵法制备中性氨基酸的反应体系，具体制备方法可参考Engineering of A Novel Biochemical Pathway for the Biosynthesis of L-2-aminobutyric Acid in Escherichia coli K12，Fotheringham，I.G.，Pantaleone，D.P.and Taylor，P.P et.al.(1997)Chim.Oggi 15，33-37；Transaminase biotrans-formation process，Fotheringham，I.G.(2001)US Patent 6197558；和Preparation of d-amino acids by direct fermentative means，Fotheringham，I.G.，Taylor，P.P.and Ton，J.L(1998)US Patent 5728555；L-缬氨酸的发酵工艺研究，生物技术通讯：2006，17(3)，381-383，徐庆阳刘树海陈宁等文献。
在本发明的下述实施例中，使用的丙氨酸消旋酶为来源于枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌或嗜热脂肪芽胞杆菌的丙氨酸消旋酶，具体制备方法可参考Preparation of d-amino acids by direct fermentative means，Fotheringham，I.G.，Taylor，P.P.and Ton，J.L.(1998)US Patent 5728555；Expression of alr gene from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in Escherichia coli and molecular characterization of the recombinant alanine racemase.Oikawa，T.，A.Tauch，et al.(2006).Journal of Biotechnology 125(4)：503-512；Isolation of an Alanine Racemase Gene from Bacillus subtilis and its Use for Plasmid Maintenance in B.subtilis.Ferrari，E.，D.J.Henner，et al.(1985).Bio/Technology 3(11)：1003-1007.；Cloning of alanine racemase genes from Pseudomonas fluorescens strains and oligomerization states of gene products expressed in Escherichia coli.Ju，J.，K.Yokoigawa，et al.(2005).Journal of Bioscience and Bioengineering 100(4)：409-417和/或Thermostable alanine racemase from Bacillus stearothermophilus：molecular cloning of the gene，enzyme purification，and characterization.Inagaki，K.，K.Tanizawa，et al.(1986).Biochemistry 25(11)：3268-3274.等。
在本发明的下述实施例中，使用的D-氨基酸氧化酶为猪肾来源的D-氨基酸氧化酶(pkDAAO)，三角酵母来源的D-氨基酸氧化酶(TvDAAO)或红酵母来源的D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)，具体制备方法可以参考Genetic and physiological data implicating the new human gene G72 and the gene for d-amino acid oxidase in schizophrenia.Chumakov，I.，M.Blumenfeld，et al.(2002).Proceedings of the National Academy of Sciences 99(21)：13675-13680；Kinetic mechanism of D-amino acid oxidases from Rhodotorula gracilis and Trigonopsis variabilis.Pollegioni，L.，B.Langkau，et al.(1993).Journal of Biological Chemistry268(19)：13850-13857和/或中国发明专利CN01132380.9等。
在本发明的下述实施例中，使用的L-氨基酸氧化酶为来源于混浊红球菌的L-氨基酸氧化酶，来源于产粘变形菌L-氨基酸氧化酶，以及来源于蛇类的L-氨基酸氧化酶，其中，来源于响尾蛇的L-氨基酸氧化酶购自Sigma-Aldrich公司，来源于混浊红球菌的L-氨基酸氧化酶和来源于产粘变形菌L-氨基酸氧化酶可以参考Preparation of d-amino acids by direct fermentative means，Fotheringham，I.G.，Taylor，P.P.and Ton，J.L.(1998)US Patent 5728555和/或Purification and characterization of an l-amino acid deaminase used to prepare unnatural amino acids.Pantaleone，D.P.，A.M.Geller，et al.(2001).Journal of Molecular Catalysis.B，Enzymatic 11(4-6)：795-803.等提供的方法获得。
实施例1-3、去除L-2-氨基丁酸溶液中的L-丙氨酸
在25℃，pH通过酸碱控制为8.0的条件下，向500ml含有L-2-氨基丁酸30g/L和L-丙氨酸5g/L的溶液中加入丙氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶，然后以表1所示的条件进行转化反应，并分别检测反应液中的L-2-氨基丁酸和丙氨酸的含量，检测结果如表2所示，实施例1-3中使用的丙氨酸消旋酶分别为来源于枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶；使用的D-氨基酸氧化酶分别为来源于红酵母、三角酵母和三角酵母的D-氨基酸氧化酶，其中，实施例3中的D-氨基酸氧化酶为购自湖南福来格生物技术有限公司的固定化三角酵母D-氨基酸氧化酶；实施例2-3中加入的过氧化氢酶购自枣庄市杰诺生物酶有限公司。
表1、转化条件
  实施  例  丙氨酸消旋酶  酶活  D-氨基酸氧  化酶酶活  氧气获得方式  搅拌速度  1  3000U/L  3000U/L  0.1V/VM的速度通入氧气  200rpm  2  4000U/L  2000U/L  5000U/L过氧化氢酶，0.5ml/min  加入20％过氧化氢溶液  200rpm  3  3000U/L  2000U/L  5000U/L过氧化氢酶，0.5ml/min  加入20％过氧化氢溶液  200rpm
表2、检测结果

根据表2的结果，在实施例1-4中都有效地去除了溶液体系中的丙氨酸，并维持了目标氨基酸(L-2-氨基丁酸)的高得率，即特异性的去除了溶液体系中的丙氨酸。
实施例4-5、去除L-叔亮氨酸溶液、L-缬氨酸溶液中的丙氨酸
分别向100ml含有L-叔亮氨酸30g/L和L-丙氨酸6g/L的溶液、500ml含有L-缬氨酸30g/L和L-丙氨酸4g/L的溶液中加入丙氨酸消旋酶、氨基酸氧化酶和5000U/L的过氧化氢酶，然后以0.5ml/min的速度加入含量为20％的过氧化氢溶液，温度控制在25℃，pH维持为8.0，200rpm搅拌速度的条件下进行转化反应，然后分别于反应后的4小时和6小时，检测反应液中的目标氨基酸和丙氨酸的含量，检测结果如表3所示，其中，实施例4-5中使用的丙氨酸消旋酶为3000U/L来源于枯草芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶；使用的氨基酸氧化酶分别为2000U/L来源于红酵母的D-氨基酸氧化酶、2000U/L来源于三角酵母的D-氨基酸氧化酶。
表3、检测结果

根据表3的结果，在实施例4-5中都基本去除了转化反应体系中的丙氨酸，并维持了目标氨基酸的高得率，即特异性的去除了溶液体系中的丙氨酸。
虽然，在上述提供的实施例1-5中使用的目标氨基酸为L-2-氨基丁酸、L-叔亮氨酸、L-缬氨酸，但对于本领域的技术人员而言，其他的中性氨基酸，如L-正缬氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸和D-叔亮氨酸等，本发明提供的去除丙氨酸方法具有通用性，因此，也属于本发明的保护范畴。
根据上述结果，多数丙氨酸消旋酶具有严格的底物特异性，只对L-丙氨酸和D-丙氨酸具有消旋作用，从而避免了目标氨基酸的氧化，因而与氨基酸氧化酶共同作用，可特异性的去除转化液或发酵液中的丙氨酸。因此，使用本发明提供的方法，可特异性地去除制备中性氨基酸的转化液或发酵液中的丙氨酸，而不影响目标氨基酸的得率。由于经转化反应处理后的溶液中丙氨酸的含量非常低，因而可以大大简化在转氨酶法和发酵法中制备的中性目标氨基酸的分离纯化和精制工艺。