一种橄榄叶提取物的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种橄榄叶提取物的制备方法，尤其涉及一种橄榄苦苷含量大于90％的橄榄叶提取物的制备方法，属于植物有效成分提取分离技术领域。
背景技术
橄榄(Olea europare Linn)属木樨科(oleaceae)，英文名称为olive，又名洋橄榄、齐墩果、阿列布，是以“高产、优质、高效”为特征的世界名贵常绿木本油料和果用树种，橄榄的栽培品种有500种之多，广泛种植的约140种。橄榄生长能力旺盛，耐旱、喜光，主要分布在欧洲地中海沿岸国家和美国加州地区，50年代少量传入我国，在福建、两广、台湾、四川、陕西、云南等省区广泛种植。长期以来，主要利用其鲜果加工成为素有“植物油皇后”之称的橄榄油。现代生物技术分析表明橄榄叶中含有大量的生物活性物质，其抗氧化活性成分较橄榄果更为突出，尤其是裂环烯醚萜类(橄榄苦苷为主要成分)主要存在于欧洲油橄榄叶中。
橄榄苦苷具有强力抗菌、抗病毒活性和极强的抗氧化能力，同时具有降血压，降血糖和抗癌等作用，为苯酚类裂环烯醚萜苷，易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯，几乎不溶于氯仿、石油醚、乙醚、苯、四氯化碳，用极性溶剂处理为白色无定形粉末，在乙酸乙酯中可形成小结晶，熔点87～89℃，分子式C25H32O13，分子量540.51，结构式如下：
针对从橄榄叶中提取分离橄榄苦苷的文献报道很多，但产品的纯度和得率都很低，目前还没有一种高效、快捷、低成本、适于工业化大生产的从橄榄叶中提取分离橄榄苦苷的方法。橄榄苦苷易氧化，对温度和光线较敏感，吸湿性很强，而且不易结晶，所以高纯度的橄榄苦苷不易制备得到，尤其是得率高、适合生产的橄榄苦苷的制备更是很难。处理过程越繁琐，橄榄苦苷纯度有所提高但得率却很低，同时也提高了成本，不适用于大生产。中国专利200410023233公开了一种橄榄叶提取物提取方法，该方法采用水漂洗、二氧化氯消毒、醇提取、浓缩干燥，制备的提取物有效成分低于35％，不仅没有明确的有效成分，而且含量低，其药用受到限制。中国专利200710118209.8公开了一种橄榄叶提取物制备方法，采用醇提取后膜分离技术纯化，橄榄苦苷含量达40％以上，但其成本较高，且不适用于大生产。中国专利200710107642.1公开了一种橄榄叶提取物生产工艺，将橄榄叶低温避光干燥乙醇或甲醇采用回流、浸渍、渗漉、超声提取，真空干燥再经膜分离和离子交换分离纯化，得到橄榄苦苷、总酚及黄酮三种有效成分，但所得橄榄苦苷含量仅2～6％，且离子交换原料没有交代，提取物物质残留不明。国外也有专利报道橄榄叶提取物的制备方法，美国专利US98101563用80％甲醇热提取橄榄叶，真空浓缩、粗提取物喷雾干燥，制备橄榄叶提取物，橄榄苦苷含量低于40％。王成章等报道了一种引种阿斯油橄榄叶中橄榄苦苷提取分离及结构鉴定的方法(林产化学与工业，2009年6月)，利用60％乙醇提取，然后用石油醚，乙酸乙酯萃取，再经硅胶柱层析分离，最后用HPLC半制备色谱制得95％的橄榄苦苷单体，其目标是得到橄榄苦苷单体，没有考虑得率和成本以及有害物质残留，工艺繁琐。在醇提后直接萃取，工作量大，萃取效率低，浓缩液过滤较困难，硅胶柱层析分离成本较高，且使用了氯仿甲醇体系，氯仿的毒性很大，在人体内是不可分解的积累性毒性残留，产品的适用范围受到了很大的限制，其采用的制备型液相色谱是分析型HPLC色谱，可得到mg级产品，适用于研究但不适合于生产，从整个工艺看虽制备出了橄榄苦苷单体，但工艺繁琐成本较高，产品得率较低，工艺的利用价值受到了很大的限制。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种工艺流程简单、高效、快捷、低成本、适于工业化大生产的从橄榄叶中提取分离橄榄苦苷的方法。
本发明所采用的技术方案如下：
一种橄榄叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)、提取：用极性溶剂对橄榄叶进行提取，橄榄叶质量与极性溶剂体积的比例为1∶(10～30)(W/V)，提取的过程中加入溶剂体积1％质量的碳酸钙(W/V)，提取温度为50℃～80℃，提取时间为5～10h；
(2)、絮凝沉淀：将提取液浓缩至比重1.01～1.10，用水稀释1～2倍，加入待沉溶液体积1～3％的絮凝剂，搅拌，静置3～5h，离心分离，得橄榄苦苷为主产品的褐色澄清溶液；
(3)、萃取：将离心清液依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相减压浓缩至干，得浸膏；
(4)、液相制备：将乙酸乙酯萃取层浓缩浸膏，用蒸馏水或者5％～30％甲醇水溶液溶解，0.45μm有机膜滤过，滤液用制备型高效液相色谱柱进行制备，分离柱直径8cm，C18填料，粒度10um，？0.932～0.950(20？)g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速140～200mL/min，示差折光检测器在线检测，收集橄榄苦苷制备液；
(5)、干燥：将制备液于40℃～50℃减压回收溶剂，真空冷冻干燥或喷雾干燥，得橄榄苦苷纯度90％以上的提取物。
步骤(1)中所述极性溶剂为乙醇和水的混合物，优选质量分数为60％～95％的乙醇。
步骤(2)中所述絮凝剂为101果汁澄清剂、壳聚糖澄清剂或明矾中的任意一种。
橄榄苦苷易氧化，对温度和光线较敏感，吸湿性很强，而且不易结晶，所以高纯度的橄榄苦苷不易制备得到，尤其是得率高、适合生产的橄榄苦苷的制备更是很难。本发明人经反复试验，根据相似相溶原理，采用极性溶剂提取橄榄苦苷，以有效地提取橄榄苦苷，提取时加入碳酸钙，以抑制橄榄苦苷的分解，提高橄榄苦苷的得率，为获得高纯度高收率的橄榄叶提取物打下基础；将提取液浓缩后用絮凝剂进行沉淀，不仅能够除去高分子蛋白、胶质、叶绿素、高分子单宁等杂质，提高橄榄苦苷的纯度，而且有利于后续萃取工艺的进行，提高萃取的效率；经过上述步骤的组合，富集有效部位并除去提取物中的大量杂质，获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液，不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约生产成本；在大量试验的基础上，发明热确定了如上所述的各色谱条件，使样品溶液中各物质的出峰时间、峰形、分离效果等最佳化，有利于橄榄苦苷得到充分有效的分离；制备所得单体再经重结晶处理后可获得橄榄苦苷含量为90％以上的橄榄叶提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果：1、本发明采用极性溶剂能最有效的提取橄榄苦苷，且碳酸钙的加入抑制了橄榄苦苷的分解，提高了橄榄苦苷地得率，获得高纯度高收率的橄榄叶提取物。橄榄苦苷浸出率超过90％，而且设备投资少，运行成本低，可以满足工业化生产，提取的橄榄苦苷含量达5％，收率达40％。
2、采用絮凝剂进行沉淀，不仅能除去高分子蛋白、胶质、叶绿素、高分子单宁等杂质，提高橄榄苦苷的纯度，而且节约成本，清洁环保，适合于大生产。
3、采用制备型高效液相色谱柱对橄榄苦苷进行分离，示差折光检测器在线检测，针对性收集橄榄苦苷，目标明确，有效地提高了橄榄苦苷的纯度，获得高纯度橄榄苦苷的提取物，快速、直接，省时有效。
4、本发明整体工艺高效，环保，收率高，产量大，重现性好，容易收集样品，适合工业化生产。
【附图说明】
图1为本发明的工艺流程图。
图2为橄榄叶提取液高效液相图。
图3为絮凝剂沉淀后上清液高效液相图。
图4为乙酸乙酯萃取高效液相图。
图5为本发明橄榄苦苷三针连续进样的高效液相制备色谱图。
图6-8分别为本发明实施例1-3中橄榄苦苷单体(含量＞90％)的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
实施例1
本实施例的从橄榄叶中提取橄榄苦苷的方法，包括以下步骤：
(1)、提取：将鲜叶橄榄叶于常压烘箱65℃过夜，称取干燥橄榄叶200g，剪碎，加入60％乙醇3L和4g碳酸钙，于70℃回流提取3次，每次2h，合并三次的提取液。
(2)、絮凝沉淀：将提取液浓缩至比重1.01～1.10，用水稀释1.5倍，加入待沉溶液体积1％的明矾固体，搅拌30min，静置3～5h，离心分离，得橄榄苦苷为主产品的褐色澄清溶液；
(3)、萃取：向离心所得上清液中加入沸程为60℃～90℃的石油醚1L，充分振摇萃取，静置分层，分液；石油醚相回收石油醚，残渣弃去；水相用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯相减压浓缩至干，得浸膏10g。
(4)、液相制备：将乙酸乙酯萃取层浓缩浸膏，用蒸馏水溶解，0.45μm有机膜滤过，滤液用制备型高效液相色谱柱进行制备，分离柱直径8cm，C18填料，粒度10um，ρ＝0.932(20℃)g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速140mL/min，进样量140mL，示差折光检测器在线检测，收集橄榄苦苷制备液，浓缩；
(5)、干燥：将制备液于45℃减压回收甲醇，水溶液用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯相减压浓缩至干，50℃与五氧化二磷共存真空干燥至恒重，得产品3.5g，得率1.8％。
产品用反相高效液相色谱柱分离(RP-HPLC)，分析液相检测，橄榄苦苷纯度92％。色谱柱填料为C18，粒度5um，流动相为含0.5％磷酸的25％乙腈水溶液(体积百分比浓度)，检测波长为230nm；流速1mL/min。
实施例2
本实施例的从橄榄叶中提取橄榄苦苷的方法，包括以下步骤：
(1)、提取：将鲜叶橄榄叶阴干，称取干燥橄榄叶500g，剪碎，加入75％乙醇5L和6g碳酸钙，于70℃回流提取3次，每次2h，合并三次的提取液。
(2)、絮凝沉淀：将提取液浓缩至比重1.01～1.10，用水稀释1倍，加入待沉溶液体积3％的101果汁澄清剂溶液(配置成5％水溶液)，搅拌，静置3h，离心分离，得橄榄苦苷为主产品的褐色澄清溶液；
(3)、萃取：向离心所得上清液中加入沸程为60℃～90℃的石油醚2L，充分振摇萃取，静置分层，分液；石油醚相回收石油醚，残渣弃去；水相用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯相减压浓缩至干，得浸膏62g。
(4)、液相制备：将乙酸乙酯萃取层浓缩浸膏，用含0.2％乙酸的甲醇水溶液溶解，0.45μm有机膜滤过，滤液用制备型高效液相色谱柱进行制备，分离柱直径8cm，C18填料，粒度10um，ρ＝0.942(20℃)g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速140mL/min，进样量100mL，示差折光检测器在线检测，收集橄榄苦苷液，浓缩；
(5)、干燥：将制备液于40℃减压回收甲醇，水溶液用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯相减压浓缩至浸膏，少量蒸馏水溶解后置于冰箱冷冻后用冷冻干燥机冷冻干燥，得淡黄色粉末6.8g，得率1.4％。
产品用反相高效液相色谱柱分离(RP-HPLC)，分析液相检测，其纯度为95％。色谱柱填料为C18，粒度5um，流动相为含0.5％磷酸的25％乙腈水溶液(体积百分比浓度)，检测波长为230nm；流速1mL/min。
实施例3
取橄榄鲜叶5kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃鼓风3-20hr，测含水率低于5.0％，橄榄苦苷含量1.89％。取1000g干燥叶，破碎成小块，加10L95％乙醇水溶液，70℃热提取，时间2小时，过滤，第二次提取加8L95％乙醇溶液，时间2小时，过滤，第三次加6L95％乙醇溶液，提取1小时，合并滤液。50℃下浓缩至比重1.10，加水稀释1倍，加入待沉溶剂体积1％的壳聚糖(用1％醋酸配成1％的溶液)，搅拌30min，静置4h，离心，除去沉淀物，得橘黄色澄清溶液。
澄清溶液先用石油醚(沸程60～90℃)萃取1次，石油醚相回收石油醚，残渣弃去；水相用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯相减压浓缩至干，得浸膏50g，然后浸膏用30％甲醇水溶解，用孔径0.45有机膜过滤，滤液进行制备，利用制备型高效液相色谱柱，分离柱直径8cm，C18填料，粒度10um，ρ＝0.950(20℃)g/mL的甲醇水溶液作为流动相，流速140mL/min，进样量100mL，示差折光检测器在线检测，针对性收集橄榄苦苷的制备溶液，浓缩。浓缩水溶液用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯相减压浓缩至浸膏，再进行喷雾干燥，温度105℃，得橄榄苦苷含量98％的橄榄叶提取物，类白色粉末，收率0.8％。
产品用反相高效液相色谱柱分离(RP-HPLC)，分析液相检测，其纯度均大于90％。色谱柱填料为C18，粒度5um，流动相为含0.5％磷酸的25％乙腈水溶液(体积百分比浓度)，检测波长为230nm；流速1mL/min。