能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用 【技术领域】
本发明涉及一株能在芽胞表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用。
背景技术
911事件之后的炭疽芽孢袭击事件，引起了人们对生物武器的恐慌。炭疽杆菌形成的芽孢具有存活时间长，易于传播，引起的炭疽杆菌病发病时间快和死亡率高等特点，在我国列为乙类传染病，并且是恐怖主义者首选武器之一。
炭疽杆菌毒性菌株含有两个大质粒，分别是编码毒素基的pXO1质粒(184.5kbp)，合成荚膜相关基因的pXO2质粒(95.3kbp)。强毒株需要两种质粒的存在，缺少pXO1则不产生毒素，即为弱毒菌；缺少pXO2则不形成荚膜，比野生型菌毒力低百倍，因此炭疽杆菌致病因子主要是荚膜和炭疽毒素两个方面，而能够引起机体对其产生免疫保护应答的成分岂今发现主要是炭疽毒素中的保护性抗原(PA)，另外炭疽杆菌的芽孢成分、水肿因子(EF)及致死因子(LF)均有增强免疫保护的作用。我国当前应用于疫苗的A16R株是只具有pXO1大质粒的弱毒株，但残留一定的毒性，存在一定的副作用等缺点。我们已经消除pXO1毒性质粒，建立“无毒”的炭疽杆菌芽孢突变株，并且获得专利(专利号：ZL200610007229.3)。
根据PA蛋白的晶体结构，可将其分成4个结构域：结构域1(PAD1)由1～258氨基酸残基组成，含有弗林蛋白酶(furin)的切割位点和LF及EF的结合位点；结构域2(PAD2)由259～487氨基酸残基组成，参与蛋白七聚体的形成及LF、EF进入细胞质孔道的形成；结构域3(PAD3)由488～595氨基酸残基组成，参与七聚体的形成；结构域4(PAD4)由596～735氨基酸残基组成，为细胞受体结合结构域，也就是说PAD4能与细胞表面的炭疽毒素受体结合，从而引导PA在细胞表面形成七聚体进而使得LF或EF进入细胞内。
【发明内容】
本发明的目的是提供一株能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽杆菌突变株及其应用。
本发明所提供的能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽杆菌株，是将pagAD4基因插入到炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端获得的菌株。
所述pagAD4基因具有自GeneID：2820165的5′端第596‑735位核苷酸序列；所述bclA基因具有自GeneID：62823670的5′端第1‑389位核苷酸序列。
所述能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌株还经过去除构建过程中引入的抗生素标记。
所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)为减毒活疫苗菌株，具体为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP422 CGMCC №.1569。
所述能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌株优选为炭疽芽孢杆菌AP422(Bacillus anthracis)CGMCC №.3404号。炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)CGMCC№.3404号是通过同源重组将pagAD4基因插入到炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端，并采用重组酶将引入的卡那抗性基因敲除，通过大量鉴定筛选获得的一株能在芽孢表面展示PAD4蛋白，并且无抗生素标记的炭疽芽孢杆菌株。
所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424，已于2009年11月05日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3404。
本发明还提供一种能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌株的获得方法，是将将pagAD4基因插入到炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)芽孢蛋白bclA基因未端。
所述pagAD4基因具有自GeneID：2820165的5′端第596‑735位核苷酸序列；所述bclA基因具有GeneID：62823670的5′端第1‑389位核苷酸序列；所述pagAD4基因通过同源重组的方法敲入所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)中。
上述能在芽孢表面展示PAD4蛋白的炭疽芽孢杆菌株作为炭疽杆菌活芽孢疫苗。
本发明的炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424应用基因打靶技术成功将pagAD4基因插入到炭疽杆菌芽孢蛋白bclA基因未端，并在此突变体芽孢蛋白中检测到PAD4的存在，这为将来研制新型炭疽杆菌芽孢疫苗打下基础，如灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗或基因工程疫苗。炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424菌株可用于制备减毒活疫苗，应用此减毒活疫苗免疫人和动物后可产生对PAD4和相关芽孢蛋白的免疫应答。
【附图说明】
图1为重组载体酶切鉴定1％琼脂糖电泳图；图中，泳道M：DNA Marker；泳道1：pT‑pagAD4用Pst I和Sac II双酶切的结果；泳道2：pT‑pagAD4用Pst I和Sac II双酶切的结果；泳道3：pT‑da用EcoR I和Xho I双酶切的结果；泳道4：pT‑lpka用Sac II和EcoR I双酶切的结果。
图2为pagAD4基因敲入所采用的方法示意图。
图3为pagAD4基因敲入阳性转化子重组菌PCR鉴定结果。
图4为kana基因成功去除重组转化子PCR鉴定结果。
图5为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424芽孢蛋白电泳图
图6为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424芽孢蛋白免疫印迹图
图7为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424芽孢蛋白免疫效果实验
【具体实施方式】
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、一株能在芽孢表面展示PAD4蛋白(编码基因为pagAD4)的炭疽杆菌突变株的获得
1、打靶载体的构建
提取炭疽杆菌A16R(炭疽芽孢杆菌A16R株无菌培养滤液的蛋白质组学分析董梅，庄汉澜，王希良军事医学科学院院刊2009年2月第33卷第1期，由中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所保存)内质粒pXO1，以质粒pXO1(此质粒为炭疽杆菌A16R株菌内质粒)为模板通过PCR反应获得pagAD4基因，引物为PA4F(5’AACTGCAGTTTCATTATGATAGA 3’(序列表中序列1))和PA4R(5’TCCCCGCGGTTATCCTATCTCAT 3’(序列表中序列2))，PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后扩增30个循环：94℃30s，60℃30s，72℃1min，最后72℃延伸10min，纯化PCR片段并连入pEASY‑T1载体(全式金生物技术公司)，得到重组质粒pT1‑pagAD4，并对其进行酶切鉴定和测序分析表明载体构建正确。其酶切鉴定结果见图1的泳道3，结果表明，重组质粒pT1‑pagAD4含有该420bp的pagAD4基因，且经测序鉴定没有发生突变。
上游打靶片段和下游打靶片段以炭疽杆菌AP422(保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC №.1569；专利号为ZL200610007229.3，授权公告号为CN 100362094C)基因组为模板进行PCR反应，上游打靶片段引物为ARMBclAF(5’CCGGATCCACTAGGACTTCCAGCAGGAC 3’(序列表中序列3))和ARMBclAR(5’CGCTGCAGACCTGGAGCAACTTTTTCAATAATAATG 3’(序列表中序列4))，下游打靶片段引物为DAFF(5’GACGAATTCACTTAGCAGTAAAACTGATATC 3’(序列表中序列5))和DAFR(5’TCGAGCTCTTTCCTTGACTACAGTTTCC 3′(序列表中序列17))。PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后扩增30个循环：94℃30s，60℃30s，72℃1min，最后72℃延伸10min，纯化PCR片段并分别连入pEASY‑T1载体(全式金生物技术公司)得到含有上游打靶片段的重组质粒pT1‑ua和含有下游打靶片段的重组质粒pT1‑da，并对其进行酶切鉴定和测序分析。含有上游打靶片段的重组质粒pT1‑ua和含有下游打靶片段的重组质粒pT1‑da的酶切鉴定结果分别如图1中泳道2和泳道4所示，结果表明pT1‑ua含有1218bp的上游打靶片段，pT1‑da中含有851bp的下游打靶片段，且经测序鉴定没有发生突变。
以质粒pBE2(枯草杆菌一大肠杆菌多功能穿梭载体的构建，郭兴华、熊占、周民、贾士芳、许怡，生物工程学报(70)：224～229，1991，由中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所保存)为模板进行PCR反应获得LoxP‑kana基因片段(携带重组酶识别位点LoxP的卡那抗性基因片段)，引物为lpkaF(5’TCCCCGCGGATAACTTCGTATAGCAT
ACATTATACGAAGTTATGTCGACAATTAGACTATGATCCAA 3’(序列表中序列6))和lpkaR(5’GCCGAATTCGTATGACAAGGTGAGATCTATAA
CTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGACTCAAAATGGTATGCGT 3’(序列表中序列7))，PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后扩增30个循环：94℃30s，60℃30s，72℃1min，最后72℃延伸10min，纯化PCR片段并连入pEASY‑T1载体(全式金生物技术公司)得到重组质粒pT1‑lpka，并对其进行酶切鉴定和测序分析表明载体构建正确，pT1‑lpka中含有1400bp的LoxP‑kana基因片段，且经测序鉴定没有发生突变。其中，酶切鉴定结果见图1的泳道1。
用Pst I和Sac II双酶切pT1‑pagAD4回收pagAD4片段(具有自GENBANK号为GeneID：2820165的5′端第596‑735位核苷酸序列)，将pagAD4片段插入到pT1‑ua的Pst I和Sac II酶识别位点之间，得到重组载体，将其进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明正确的重组质粒命名为pT1‑pagAD4ua。用BamH I和Sac II双酶切pT1‑pagAD4ua，回收pagAD44ua上游臂片段，将该片段插入到pT1‑lpka的BamH I和Sac II酶切位点之间，得到重组载体，将重组载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pT1‑pagAD4ualpka。
用EcoR I和Xho I对pT1‑pagAD4ualpka和pT1‑da进行双酶切，回收pT1‑pagAD4ualpka载体片段和da片段，T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体，将重组载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pT1‑pagAD4ualpkada。
用BamH I和Xho I双酶切质粒pT1‑pagAD4ualpkada和pMAD，回收pMAD载体片段和打靶片段pagAD4ualpkada(3874bp)，得到重组载体，将重组载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为pMAD‑pagAD4ualpkada，将pMAD‑pagAD4ualpkada电转化E.coli SCS110(购自Stratagene公司)，提取质粒得到非甲基化的质粒pMAD‑pagAD4ualpkada，用于转化B.anthracis。
2、Cre重组酶表达质粒构建
以枯草杆菌№168(ATCC No.23857)为模板，利用引物amyrF和amyrR扩增得到淀粉酶启动子AmyR1，并在两端分别引入BamH I和Hind III位点。将扩增回收的片段用BamH I和Hind III酶双酶切处理后与经同样的内切酶双酶切的质粒pHY304连接后转化E.coli Top10，得到的重组质粒，酶切和测序鉴定，将鉴定正确的质粒命名为pHY‑AmyR。然后以质粒pBS185(购自GibcoBRL公司)为模板，以creF和creR为引物，扩增Cre重组酶基因，通过引物序列在两端分别引入Hind III和Xho I位点。将PCR扩增得到的Cre重组酶基因片段用Hind III和Xho I双酶切后与经过同样双酶切的质粒pHY‑AmyR连接转化E.coli Top10，得到的重组质粒，酶切和测序鉴定，将鉴定正确质粒再转化E.coli SCS110，最终得到可用于转化炭疽杆菌的去甲化的质粒pHY‑Cre。上述引物序列为：amyrF：GCGGATCCGACGACAGGGGGATTC(序列表中序列8)，amyrR：CCCAAGCTTTCTTGACTCCTTAT(序列表中序列9)；creF：CCCAAGCTTATGTCCAATTTACTG(序列表中序列10)，creR：CCGCTCGAGCTAATCGCCATCTTCC(序列表中序列11)。
3、pagAD4基因敲入
pagAD4基因敲入所采用的策略如图2所示。具体方法如下所述：
从‑70℃保存的减毒活疫苗株B.anthracis AP422(CGMC №.1569号)菌种中划线分离单菌落，接种于5mL LB培养基中，37℃过夜培养.将过夜培养物按1％的比例接种到100mL新的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养.当OD600值达到0.5‑0.6时(约2小时)，从摇床中取出，制备感受态细胞。
每40μL感受态细胞加3μL(约0.9μg)质粒pMAD‑pagAD4ualpkada，混合后于0.1cm电击杯中冰浴5分钟，然后用Bio‑Rad电转仪进行电转化，条件为：1.8kV、200Ω和25μF。电击完毕后立即加入1mL冰冷的BH培养基(3.7％Brain‑Heart培养基购自BD公司)，30度孵育2.5小时。分别200μL涂布于含卡那酶素(25μg/mL)的LB平板上，30℃培养24小时。
挑取单菌落，接种到含卡那酶素(25μg/mL)5mL LB培养基中，30℃培养12小时，并取10μL培养物继续接种含卡那酶素(25μg/mL)5mL LB培养基中，连续传5代后，取5μL培养物梯度稀释，取10‑2、10‑3和10‑4稀释液各100μL涂布于含卡那酶素(25μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。由于质粒pMAD上含有β‑半乳糖苷酶基因，因此在X‑gal存在的情况下，能够显蓝色，所以如果质粒与基因组没有发生重组，那么菌落就是蓝色的，只有菌落为白色的菌才有可能是发生了同源重组。因此按照上述操作后，随机挑取白色单菌落，用进行PCR鉴定。取10个37℃培养生长出的单菌落，接种到含卡那酶素(25μg/mL)的LB培养基中，37℃培养过夜。取过夜培养物5μL进行全菌PCR鉴定，用BclA基因上游同源臂外侧100bp处的引物GP1(5’AACGGGCTATTGTCTTCTCCTCATC 3’(序列表中序列12))和引物PA4R(5’TCCCCGCGGTTATCCTATCTCAT 3’(序列表中序列13))，下游同源臂外侧100bp左右的的引物GP2(5’ATCATCGATTTGAGTCATAGGAGT 3’(序列表中序列14))和引物KP1(5’AACAGAGGAAGCAGAGTTCAGCC 3’(序列表中序列15))两对引物对重组转化子进行PCR鉴定。同时以正常B.anthracis AP422菌株做对照。引物GP1和引物PA4R扩增得到1858bp的片段，引物GP2和引物KP1扩增得到1588bp时，则筛选得到阳性重组转化子。部分菌落PCR鉴定的结果如图3所示，结果表明筛选得到1株阳性重组转化子，阳性重组转化子两对鉴定引物均能成功扩增出相应的DNA片段，对扩增DNA的片段进行序列分析表明pagAD4成功的插入bclA基因的未端，这对BclA蛋白未端表达PAD4蛋白具有重要意义，将该菌株命名为AP424K，AP424K在42℃条件下，重组菌株在LB液体培养基连续传代3代，使得重组质粒pT1‑pagAD4ualpka丢失，从而彻底去除可能的红霉素抗性。图3中，M：DNA Marker；1：GP1和PA4R扩增的PCR片段；2：GP2和KP1扩增的PCR片段。
4、重组菌kana基因的去除
将质粒pHY‑Cre转化步骤3获得的传代后的菌株AP424K，方法同样采用电转化，条件同按步骤3中所述方法，电击完毕后按照步骤3所述的方法立即加入1mL冰冷的BH培养基，30度孵育2.5小时。取50μL涂布于含红霉素(5μg/mL)的LB平板上，30℃过夜培养，取单菌落在含红霉素(5μg/mL)的LB液体培养基中30℃传两代后，在37℃无抗生素存在的条件下(LB培养基)连续传三代，然后取菌液稀释涂无抗生素的LB平板，在此平板上的单个菌落标记数字记号，取每个单菌落分别接种含有无抗生素、卡那霉素和红霉素的LB液体培养基中，得到在卡那霉素和红霉素的LB液体培养基不长的菌株，将其命名为炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424。
所述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424，已于2009年11月05日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC №.3404。
用带卡那霉素抗性重组菌AP424K和AP424两株菌的基因组作为模板，以引物PA4F(5’AACTGCAGTTTCATTATGATAGA 3’(序列表中序列16))和DAFR(5’TCGAGCTCTTTCCTTGACTACAGTTTCC 3’(序列表中序列17))进行PCR鉴定，结果见图4。从图中我们可以看出，重组菌AP424基因组用上述引物扩出的片段大小约1.3kb，AP424K基因组用上述引物扩出的片段大小约2.7kb，而AP424未能扩增出PCR片段，这与理论值相当。扩增得到的片段连接到T载体后测序，结果显示卡那霉素基因已经完全缺失，相应位点处只剩下一个LoxP位点，这就在基因水平上证实了卡那霉素基因成功去除。图4中M：DNA Marker；1：AP424；2：AP424K。
实施例2、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424的芽孢蛋白分析
将炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424接种于100mL LB液体培养基中，37℃连续培养5天，并涂菌染色观察芽孢形成情况。
取所有培养液，17000g离心5分钟，弃上清，再用等体积无菌水洗涤一次，最后用100μL芽孢蛋白裂解液(0.1M DTT，0.5％(质量百分含量)SDS，0.1M NaCl，pH10.0)重悬菌体，37℃孵育2小时30分钟，17000g离心10分钟，弃上清，沉淀用100μL PBS溶解得到重组菌芽孢蛋白，用10％凝胶进行SDS‑PAGE电泳分析。
在SDS‑PAGE分析的基础上，进行免疫印迹分析。将AP422(芽孢蛋白获得方法同上述炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424)和重组菌芽孢蛋白用10％凝胶进行SDS‑PAGE电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜膜用5％脱脂奶粉室温封闭2小时；再与抗PAD4蛋白(pagAD4基因编码的蛋白)的抗血清(购自SANTA公司，1∶1000稀释)37℃共孵育2小时；用PBST洗涤3次，每次5分钟，再与HRP标记的羊抗兔IgG抗体(该抗体购自中杉公司，1∶5000稀释)共孵育1小时，最后将膜用PBST洗干净后用HRP显色试剂盒(购自天根公司)进行显色。
对于基因水平鉴定正确的pagAD4基因插入突变株菌株用10％凝胶进行SDS‑PAGE电泳分析，结果如图5所示。以抗PAD4蛋白的兔抗血清做为一抗进行对重组菌炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424进行免疫印迹分析证明PAD4蛋白得到了表达，结果见图6。图5和图6中，M：蛋白Marker；1：AP422；2：AP424。
实施例3、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)AP424的芽孢免疫效果验证
以AP424芽孢免疫Balb/c小鼠，每只小鼠蹊部注射约109个芽孢，一共免疫三次，两次免疫时间间隔两周，第三次免疫两周后取血清进行ELISA反应检测，结果图7，结果表明血清滴度可以达到1600倍(p＜0.01)。图7中ck为免疫AP422芽孢免疫的Balb/c小鼠。