一种通过添加关键生长因子以提高丁二酸产量的方法 【技术领域】
本发明具体涉及一种通过添加关键生长因子以提高丁二酸产量的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
在丁二酸的生物法制备中，适合生产丁二酸的微生物主要为真菌和细菌，但是由于真菌发酵分离和纯化困难且产量较低，因此更多的丁二酸发酵研究集中在细菌上，特别是瘤胃微生物。瘤胃微生物属于化能异样型微生物，其营养要求复杂，除了需要可发酵性碳水化合物和氮源外，还必须提供某些无机盐和微量元素以作为其生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。酵母膏、蛋白胨等物质正是因为其富含多种维生素、氨基酸以及微量元素而被广泛用于微生物的发酵中，但在诸多生长因子中，往往只有一种或少数几种关键的因子对菌体的生长以及丁二酸的合成起着决定性作用。
一方面，《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》，2005，71(11)：6651～6656中报道，对于菌株琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC55618)，谷氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸这三种氨基酸对于菌体的生长代谢影响显著，但是并没有考虑到其他生长因子对于菌体生长产酸的影响，所以其结论与分析具有片面性。若能综合考虑氨基酸、维生素以及金属微量元素对菌体的影响，便能更加全面地对关键生长因子的影响进行分析。
另一方面，在利用廉价氮源进行发酵制备丁二酸的报道中，其氮源替代效果并不理想，原因很有可能因为所选的廉价氮源中影响菌体生长代谢的关键生长因子其种类和含量不能满足菌体的需求。若能通过向廉价氮源中补充相应的关键生长因子，以解除或减弱廉价氮源用于发酵制备丁二酸受到的限制，便可以提高丁二酸产量以及氮源的利用率，更好地实现氮源的替换。
【发明内容】
本发明的技术目的是考察关键生长因子对丁二酸发酵的影响，并通过向氮源中补充相应的关键生长因子，以降低昂贵氮源的用量，解除或减弱廉价氮源用于发酵制备丁二酸受到的限制，便可以提高丁二酸产量以及氮源的利用率，更好地实现氮源的替换。
为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为：
一种通过添加关键生长因子以提高丁二酸产量的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)确定产丁二酸微生物对应的关键生长因子；
(2)向微生物发酵培养基的氮源中补充相应的关键因子中的一种或其组合，再发酵产丁二酸。
其中，步骤(1)的具体方法为：
将多种供试氨基酸配成缺少其中某一种的其他氨基酸混合液，供试维生素、金属盐分别配成各自所含种类完全的混合液，灭菌后一一添加至只含有磷酸缓冲盐的培养基中，考察缺少对应的这一种氨基酸后对于微生物菌体发酵的影响，筛选出影响显著的关键氨基酸，并用同样的方法筛选出影响显著的关键维生素与金属盐，即确定出该微生物的关键生长因子。
本发明所述的关键生长因子为通过实验所得到的显著影响菌体生长代谢的一种或多种氨基酸、维生素、金属微量元素等。
本发明所述的丁二酸产生菌包括现有技术中任何厌氧发酵产丁二酸的微生物菌种。
本发明所述的各种氨基酸、维生素灭菌方法包括高压灭菌、过滤除菌等实验室常规灭菌方法。
本发明所述的步骤(2)中氮源包括昂贵氮源或廉价氮源：
本发明所述的昂贵氮源包括酵母抽提物、蛋白胨等价格昂贵，营养物质丰富的可以作为氮源用于丁二酸发酵制备的物质；
本发明所述的廉价氮源包括酵母废弃细胞的水解液、豆粕水解液、糖蜜等价格低廉的可以作为有机或无机氮源用于丁二酸发酵制备的物质。
本发明地有益效果在于：
利用本发明的方法，从诸多营养成分中筛选出关键的生长因子，向不同种类氮源中补充相应的关键生长因子后与以相同总氮含量的酵母粉为氮源的培养基在完全相同的发酵条件下进行丁二酸的发酵制备，证明关键生长因子确实影响着发酵效果，且向少量昂贵氮源或廉价氮源中补充相应的关键因子后能够提高丁二酸的产量，却减少了昂贵氮源的用量，降低了成本，并解除或减弱了廉价氮源用于发酵制备丁二酸受到的限制，提高了廉价氮源用于发酵制备丁二酸的利用率，能够替代一部分酵母粉、蛋白胨等昂贵的氮源。
【具体实施方式】
以下实施例对本发明做了详细说明，但对本发明的应用并无限制。
实施例1
本发明所述的考察关键因子对丁二酸生产的影响可以使用现有技术中任何厌氧发酵产丁二酸的微生物菌种。本实施例所采用的产丁二酸的微生物菌种为：产琥珀酸放线杆菌NJ113(Actinobacillus succinogenes NJ113)，该菌已申请专利并获得授权，专利授权公告号为CN100537744C。
首先需在合成培养基上考察了各种氨基酸、维生素、金属微量元素对菌体生长代谢影响的显著性。具体操作如下：
①配制氨基酸混合液，在供试的18种氨基酸中，分别去除其中的一种氨基酸，配成适当浓度的不含这种氨基酸的其他17种氨基酸混合液以及含有这18种氨基酸的混合液各100mL，0.22μm无菌滤头过滤除菌后备用，各种氨基酸在培养基中的含量见表1。
表1培养基中氨基酸浓度
②配制维生素混合液，在供试的10种维生素中，按照①中的方法配成适当浓度的只含相应9种维生素的混合液及含有这10种维生素的混合液各100mL，0.22μm无菌滤头过滤除菌后备用，各种维生素在培养基中的含量见表2。
表2培养基中维生素浓度
③配制金属微量元素混合液，在供试的14种金属盐中，按照①中的方法配成适当浓度的只含相应13种金属盐的混合液及含有这14种金属盐的混合液各100mL，121℃灭菌15min后备用，各种金属盐在培养基中的含量见表3。
表3培养基中金属盐浓度
在100mL血清瓶中，加入Na2HPO415g/L和KH2PO44g/L，加水13.1mL，121℃灭菌15min后，向其中添加步骤①的不含某种氨基酸的相应备用混合液4mL，添加0.5mL含有全部维生素和1mL含有全部金属盐的相应备用混合液，已灭菌的500g/L葡萄糖溶液0.4mL，经过无菌水洗涤的Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC 1716)种子液1mL，使接种后总体积达到20mL，葡萄糖浓度为10g/L。
用同样的方法配制如同②和③所述的缺少某一种维生素或某一种金属盐的发酵培养基。
将上述培养基在下述条件下进行发酵实验：
摇床转速200rpm，37℃发酵培养18h后检测发酵液中丁二酸含量。结果发现当培养基中缺少谷氨酸、亮氨酸、VB12、对氨基苯甲酸时，菌体生长情况较差，葡萄糖有大量剩余，丁二酸产量很低，结果如表4所示。
丁二酸产量的检测方法为：
HPLC系统高效液相色谱仪：WatersHPLC2010工作站；色谱柱Prevail organic acidcolumn 250mm×4.6mm；紫外检测波长215nm；流速1mL/min，进量20μL，流动相25mmol/L KH2PO4，pH 2.5；柱温：室温。重蒸水配制不同浓度的有机酸(丁二酸(Fluka)、乙酸(Sigma)、甲酸(Fluka)、乳酸(Fluka))标准溶液，根据峰面积与有机酸标准溶液的浓度关系制作标准曲线。发酵样品经离心稀释后根据峰面积计算各有机酸含量。
表4缺少生长因子的发酵效果
在确定关键生长因子后，考察其对于发酵制备丁二酸的影响，具体方法如下：
将以上四种关键因子配成混合液100mL，使其加入到培养基后的浓度如表1、表2中所示，过滤除菌后备用。向3L发酵罐中添加1600mL水，Na2HPO415g/L和KH2PO44g/L，121℃灭菌15min后加入500g/L葡萄糖200mL，无菌水洗涤后的Actinobacillussuccinogenes NJ113(CGMCC 1716)种子液100mL，备用的生长因子混合液100mL。
将上述培养基和常规产丁二酸培养基，即《食品与发酵工业》，2007，33(6)：1～5中所述的发酵培养基在下述相同发酵条件下进行发酵实验，发酵条件如下：
灭菌结束后接入5％的Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC 1716)种子液，搅拌转速300rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm，用Na2CO3控制发酵液的pH为6.8，发酵培养48h后，检测丁二酸浓度，见表5。
表5不同培养基发酵生产丁二酸的结果
实施例2
本实施例采用与实施例1完全相同的菌种、发酵条件和实验方法，向廉价氮源啤酒废酵母水解液中添加关键因子谷氨酸，具体方法如下：
本实施例中所使用的测量啤酒废酵母水解液中总氮含量的方法为凯式定氮法。
向3L发酵罐中加入啤酒废酵母水解液900mL(总氮浓度为2.4g/L)，加入Na2HPO415g/L和KH2PO44g/L，加水500mL，121℃灭菌15min，加入已灭菌的浓度为500g/L葡萄糖400mL，种子液100mL，过滤除菌的17.4g/L谷氨酸溶液100mL。此时培养基中谷氨酸浓度为表1所示，总氮含量为1.1g/L，相当于常规培养基对应的10g/L酵母粉的总氮含量，葡萄糖浓度为100g/L。
将上述培养基和常规产丁二酸培养基(同实施例1)、以啤酒废酵母水解液为唯一氮源的培养基(即本实施例培养基不添加谷氨酸)在下述相同发酵条件下进行发酵实验：
灭菌结束后接入5％的Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC 1716)种子液，搅拌转速300rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm，用Na2CO3控制发酵液的pH为6.8，发酵培养48h后，检测发酵液中丁二酸含量。
产丁二酸培养基的常规配方和本实施例配方，以及发酵结果的区别如表6所示：
表6不同培养基发酵生产丁二酸的结果
实施例3
本实施例针对菌株Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)，首先确定该菌株的关键生长因子，方法同实施例1。
结果表明当培养基中缺少谷氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、生物素时，发酵效果差，葡萄糖有剩余，丁二酸产量相对较低，结果如表7所示。
表7缺少生长因子的发酵效果
在确定关键生长因子后，向廉价氮源豆粕水解液中分别添加关键氨基酸和关键维生素，具体方法如下：
本实施例中所使用的测量豆粕水解液中总氮含量的方法同实施例2。
向3L发酵罐中加入豆粕水解液796mL(总氮浓度为2.8g/L)，加入Na2HPO415g/L和KH2PO44g/L，加水304mL，121℃灭菌15min，加入已灭菌的浓度为500g/L葡萄糖400mL，Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)种子液100mL，过滤除菌的以上三种关键氨基酸的混合液400mL或生物素溶液400mL。此时培养基中外源添加的四种生长因子的浓度如表1、表2所示，总氮含量为1.1g/L，相当于常规培养基对应的10g/L酵母粉的总氮含量，葡萄糖浓度为100g/L。
将上述培养基和常规产丁二酸培养基(同实施例1)、以豆粕水解液为唯一氮源的培养基(即本实施例培养基不添加四种生长因子)在与实施例2相同的发酵条件下进行发酵实验：
产丁二酸培养基的常规配方和本实施例配方，以及发酵结果的区别如表8所示：
表8不同培养基发酵生产丁二酸的结果
实施例4
本实施例采用与实施例3完全相同的菌种，减少酵母粉用量后添加关键因子生物素，具体方法如下：
向3L发酵罐中加入水1400mL，Na2HPO415g/L，KH2PO44g/L和酵母粉6g/L或10g/L，121℃灭菌15min，加入已灭菌的浓度为500g/L葡萄糖400mL，种子液100mL，过滤除菌的0.2g/L生物素溶液100mL。此时培养基中外源添加的生长因子浓度如表2所示，总氮含量为0.6g/L或1.1g/L，葡萄糖浓度为100g/L。
将上述培养基和常规产丁二酸培养基(同实施例1)在下述相同发酵条件下进行发酵实验：灭菌结束后接入5％的Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)种子液，搅拌转速300rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.25vvm，用Na2CO3控制发酵液的pH为6.8，发酵培养48h后，检测发酵液中丁二酸含量。
产丁二酸培养基的常规配方和本实施例配方，以及发酵的结果如表9所示：
表9不同培养基发酵生产丁二酸的结果
实施例5
本实施例针对菌株Anaerobiospirillum succiniciproducens(ATCC 53488)，首先确定该菌株的关键生长因子，方法同实施例1。
结果表明当培养基中缺少亮氨酸、生物素和MgSO4·7H2O时，发酵效果差，葡萄糖有剩余，丁二酸产量相对较低，结果如表10所示。
表10缺少生长因子的发酵效果
在确定关键生长因子后，减少原培养基中蛋白胨和酵母膏用量后添加关键因子亮氨酸或生物素，具体方法如下：
向3L发酵罐中加入水1400mL，Na2HPO415g/L，KH2PO44g/L和蛋白胨6g/L，酵母膏2g/L，121℃灭菌15min，加入已灭菌的浓度为500g/L葡萄糖400mL，种子液100mL，均过滤除菌的10.6g/L亮氨酸溶液100mL或0.2g/L的生物素溶液100mL。此时培养基中外源添加的生长因子浓度如表1、表2所示，总氮含量为1.9g/L，葡萄糖浓度为100g/L。
将上述培养基和常规产丁二酸培养基，即《Applied Biochemistry and Biotechnology》，1996，57(58)：633～638中所述的发酵培养基，在下述相同发酵条件下进行发酵实验：灭菌结束后接入5％的Anaerobiospirillum succiniciproducens(ATCC 53488)种子液，搅拌转速200rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.05vvm，用Na2CO3控制发酵液的pH为6.7，发酵培养48h后，检测发酵液中丁二酸含量。
产丁二酸培养基的常规配方和本实施例配方，以及发酵结果的区别如表11所示：
表11不同培养基发酵生产丁二酸的结果
实施例6
本实施例采用与实施例5完全相同的菌种，以糖蜜作为碳氮源并补充相应生长因子进行丁二酸的发酵，具体方法如下：
本实施例中所使用的测量糖蜜中总氮含量的方法同实施例2。
向3L发酵罐中加入水1400mL，Na2HPO415g/L，KH2PO44g/L，121℃灭菌15min，加入已灭菌的总氮浓度为1.5g/L的糖蜜稀释液400mL，种子液100mL，过滤除菌的浓度为10.6g/L的亮氨酸溶液100mL。此时培养基中外源添加的生长因子浓度如表1所示，总氮浓度为0.3g/L，总糖浓度为65g/L。
将上述培养基和以糖蜜为碳氮源的产丁二酸培养基，即本实施例培养基中不添加生长因子的发酵培养基，在下述相同发酵条件下进行发酵实验：灭菌结束后接入5％的Anaerobiospirillum succiniciproducens(ATCC 53488)种子液，搅拌转速200rpm，37℃发酵培养，CO2通气量为0.05vvm，用Na2CO3控制发酵液的pH为6.7，发酵培养48h后，检测发酵液中丁二酸含量。
以糖蜜为碳氮源产丁二酸培养基和本实施例培养基，以及发酵结果的区别如表12所示：
表12不同培养基发酵生产丁二酸的结果