分离提纯Maillard反应中间体Amadori化合物的方法 【技术领域】
本发明涉及一种分离提纯美拉德Maillard反应中间体阿玛杜里Amadori化合物的方法。
背景技术
阿玛杜里Amadori化合物是由氨基酸与还原糖发生美拉德Maillard反应过程中的中间产物，还原糖的羰基与氨基之间进行加成，加成物迅速失去1分子水转变为希夫碱，再经环化形成相应的N-取代的醛，经Amadori重排转成有反应活性的1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。这种中间体大多为白色或略带黄色的固体，易溶于水，没有气味，但通过加热，很容易裂解产生具有令人愉悦的芳香气味化合物如吡嗪类、呋喃类以及吡喃类化合物等，是一种重要的烟草香味前体物。Amadori化合物除了作为香味前提物，还是一种优良的抗氧化剂，能够除活性氧自由基。
国外对Amadori化合物的研究始于50年代，70年代国外烟草公司研究比较多。M.Noguchi(1971)研究烤烟中的Maillard反应在调制的干燥阶段进行较快，调制后烟叶中Amadori化合物可占烟叶重量的2％。烤烟中含量最大的Amadori化合物是葡萄糖和脯氨酸形成的1-L-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖。日本专利(1971-9239)，用糖和氨基酸的缩合产物1-L-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖作为烟草香料，这些香料是通过某种氨基酸与糖在水或醇溶剂中，酸催化剂如丙二酸的存在下制备的，并用离子交换树脂将这种化合物分离，纯化，再应用到烟草中。日本专利(1973-3398)介绍其它一些特定的氨基酸与糖的缩合产物如1-L-丙氨酸-1-脱氧-D-果糖，这种化合物是以其相应的底物在苹果酸催化剂存在下，于130℃下加热15分钟，通过Amadori重排合成的，它与可可粉混合，作为烟草增香。James P(1977)研究在烤烟醇化过程中加入还原糖、氨基酸、Fru-Pro和酪蛋白水解液，结果显示添加这些外源性物质可以不同程度提高烤烟的醇化效果。Nicol(1982)采用半制备液相色谱分离鉴定了Leu-Fru、Hyp-Fru、Trp-Fru和Ala-Fru四种Amadori化合物，采用甲醇-水体系、氨基键合硅胶凝胶色谱柱分离。Bergter(1990)采用高效液相色谱柱后衍生测定烟草中的Amadori中间体含量，结果显示烤烟中Fru-Pro的含量最高达1.45mg/g，含量次高的是Fru-Ala，达0.83mg/g。张敦铁等(2003)研究了1-L-丙氨酸-1-脱氧-D-果糖、1-L-缬氨酸-1-脱氧-D-果糖、1-L-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖三种Amadori化合物的热降解，结果显示降解产物主要为醛类、吡嗪类、呋喃、呋喃酮、吡喃酮、吡咯等杂化化合物，这些物质是烟草中的重要致香成分。王军(2007)使用串联质谱方法定性研究卷烟中含有的多种Amadori化合物，总计在烟草中定性出八种Amadori化合物中间体。
国外Amadori化合物对卷烟感官质量影响研究也比较多，Nishi(1965)报道了从甘草根中分离四种Amadori化合物，添加到卷烟中可以改善烟气感官质量。Takahara(1971)在卷烟中添加了来源于可可粉中的Amadori化合物，结果显示可以明显改善烟气香味和吃味。雷诺烟草公司的Dickerson(1972)在烤烟中加入Amadori化合物改善烟气质量。Joyce H(1977)合成了十二种Amadori化合物，对其裂解产物进行GC/MS分析，并添加到烟草中评价其作用，其中以Fru-gly效果为好.
目前，合成Amadori化合物的方法主要是“回流”法，通常是通过氨基酸与葡萄糖直接在无水甲醇中回流数小时，由于副反应比较多，要得到纯度较高Amadori化合物，则必须经过提纯。在已有的Amadori化合物分离提纯技术中，主要有阳离子交换树脂分离、纤维素柱分离、硅胶柱分离等，但这三种方法也只应用于实验室小量制备，无法进行工业化生产。在这些方法中以阳离子交换树脂分离提纯应用最为广泛，提纯的纯度也较高，但是阳离子树脂洗脱较慢，操作繁琐耗时，离子交换树脂成本也较高。
【发明内容】
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种工艺流程简单、成本低、提纯纯度高、可进行的工业化生产的分离提纯Maillard反应中间体Amadori化合物的方法。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明分离提纯Maillard反应中间体Amadori化合物的方法的特点是以还原糖和氨基酸为原料，加入催化剂，在醇溶液中进行回流反应，反应液经真空减压浓缩得干料，再向干料中加水进行溶解得反应混合物水溶液；对于所述反应混合物水溶液采用纳滤膜或超滤膜和纳滤膜组合分离除去反应混合物水溶液中的反应底物和大分子物质，截留目标Amadori化合物，再经重结晶后干燥得Amadori化合物固体粉末。
本发明方法的特点也在于：
所述还原糖为葡萄糖、果糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、鼠李唐、甘露糖中任一种或其任意组合。
所述氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰、色氨酸、赖氨酸、胱氨酸、精氨酸胺及所述氨基酸的盐的任一种或其任意组合。
所述催化剂为丙二酸和丁二酸中的任一种或其组合。
所述醇溶液为无水甲醇溶液，各物料按重量份的用量为：还原糖为10-15份、氨基酸为5-10份、催化剂为0.1-1份、无水甲醇为75-85份；所述在醇溶液中回流反应的回流反应温度为70-100℃、回流反应时间为3-8小时；所述反应液真空减压浓缩过程中的真空度为-0.02～-0.09Mpa，甲醇体系浓缩温度为45-60℃。
所述醇溶液为无无水乙醇溶液，各物料按重量份的用量为：还原糖为2-10份、氨基酸为2-5份、催化剂为0.1-0.5份、无水乙醇为85-95份，所述在醇溶液中回流反应的回流反应温度为85-120℃、回流反应时间为5-10小时；所述反应液真空减压浓缩过程中的真空度为-0.02～-0.09Mpa，乙醇体系浓缩温度为50-60℃。
所述纳滤膜的截留分子量为200-1000，所述纳滤膜截留分子量与Amadori化合物分子量的差值不小于50，纳滤工作压力为20-30bar，膜通量1L/m2.h-1-20L/m2.h-1，操作温度为5-40℃。
所述超滤膜截留分子量为1000-50000之间，超滤工作压力为1-20bar，膜通量10L/m2.h-1-80L/m2.h-1，操作温度为5-40℃。
所述纳滤和超滤膜其材质为纤维素酯类、聚砜、聚醚砜、聚酰胺、芳香聚酰胺、聚酰亚胺、聚砜酰胺、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、陶瓷膜或玻璃膜；所述超滤或纳滤膜为卷式膜、中空纤维膜、管式膜或板式膜.
在向干料中加水进行溶解时，使用软水，电阻率为5-18.2MΩ·cm，溶解后首先通过精滤器过滤，以除去混合物中可能的颗粒，防止因损伤超滤膜或超滤膜而降低了膜组件的使用寿命；然后由高压泵将水解溶液压入透过纳滤膜或超滤纳滤组合膜，除去混合物中反应底物还原糖与氨基酸和大分子物质，没有透过膜组件的截留料液经管道送回到原料储罐，然后再进行膜分离，以此进行循环过滤。随着分离的进行，透过膜的料液越来越多，原料储罐中的截留液体积越来越小，颜色变深，粘度变大，当达到原料储罐的二分之一到五分之一时，此时可以用蠕动泵向原料储罐加入去离子水，流量与膜过滤液流出量相当。通过离子色谱仪监测滤出液中的还原糖、氨基酸和Amadori化合物的含量的变化，直至基本检测不到还原糖和氨基酸为止，即可停止稀释。该截留液体可直接用作香料，也可经过减压蒸馏和重结晶后得白色Amadori化合物纯品，可用作香料，食品添加剂或医药原料。
对于反应转化率较高地Amadori化合物，如Fru-Pro、Fru-val、Fru-Met等，可以只使用纳滤膜，除去反应底物还原糖和氨基酸。
对于反应转化率较低的Amadori化合物，如Fru-Phe、Fru-Ser、Fru-Ala、Fru-Gly等，首先使用超滤膜出去反应副产物大分子物质，再使用纳滤膜除反应底物。
重结晶其所采用的溶剂体系可以为水-丙酮体系、水-乙酸乙酯体系、水-异丙醇体系、水-乙醇体系或甲醇-乙醇体系。
阿玛杜里Amadori化合物是由单一的还原糖与单一的氨基酸反应而来，主要包括1-甘氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Gly)、1-丝氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Ser)、1-苏氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Thr)、1-缬氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Val)、1-异亮氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Ile)、1-亮氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Leu)、1-酪氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Tyr)、1-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Phe)、1-组氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-His)、1-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Pro)、1-天冬氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Asp)、1-天冬酰胺-1-脱氧-D-果糖(Fru-Asn)、1-谷氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Glu)、1-谷氨酰胺-1-脱氧-D-果糖(Fru-Gln)1-色氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Trp)、1-赖氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Lys)、1-胱氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Cys)、1-精氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Arg)以及其它还原糖Amadori中间体。
本发明与离子交换树脂等层析技术相比有益效果体现在：
1、本发明工艺流程简单，操作方便简单，提纯时间较短，成品纯度较高，易于进行工业化生产。采用层析法需要大量水进行洗脱，处理完后也需要将大量的水蒸馏浓缩，成本较高。而采用本发明超滤纳滤方法只需将反应混合物通过纳滤或超滤膜，后期多次少量补加软水，能够节约动力能耗，降低制备成本。
2、本发明方法可以实现Amadori化合物工业化生产，而且过滤膜能够重复使用，又大大降低了工业生产的成本，是一种具有良好应用前景的Amadori化合物提纯方法。
【附图说明】
图1为本发明工艺流程图。
图中标号：1反应釜；21为一级供料泵；22为二级供料泵，23为三级供料泵、3真空浓缩灌；4精滤器；5料液罐；6高压泵；7滤膜组件.
【具体实施方式】
本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。
实施例1：
参见图1，纳滤法制备Amadori化合物1-缬氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Val)
在50L反应釜1中加入无水葡萄糖20mol、缬氨酸25mol、30L无水甲醇，加热搅拌溶解，设定反应釜1的回流温度为75℃，回流时间为5小时；反应完成后由一级供料泵21泵入真空浓缩灌3中，以50℃和-0.03Mpa的真空度进行真空浓缩得干料，向干料中加入10L软水进行溶解，得到反应混合物水溶液，通过二级供料泵22将反应混合物水溶液泵入精滤器4，经精滤器4过滤，以除去反应混合物水溶液中可能存在的颗粒，防止损伤纳滤膜或超滤膜，精滤器4的出料通过三级供料泵23泵入料液罐5，料液罐5中的料液再通过高压泵6压入透过滤膜组件7，本实施例中采用截留分子量为200的纳滤膜，以除去料液中的剩余反应底物葡萄糖和缬氨酸，得到含有1-缬氨酸-1-脱氧-D-果糖的膜截留液。没有透过滤膜组件的截留料液经管道送回到料液罐5，然后再进行膜分离，以此进行循环过滤。随着分离的进行，透过滤膜的料液越来越多，料液罐5中的截留液体积越来越小，颜色变深，粘度变大，当达到料液罐5的三分之一时，此时用蠕动泵向料液罐5加入软水，流量与膜过滤液流出量相当。通过离子色谱仪监测滤出液中的葡萄糖、缬氨酸含量的变化，当加水量至500L时，则几乎检测不到还原糖与氨基酸，停止稀释，纳滤完毕。纳滤设备操作温度不超过40℃，操作压力为20-30bar，控制膜通量为10L/m2.h-1-20L/m2.h-1之间。将该料液转移至减压浓缩装置进行加压浓缩(真空度为-0.03Mpa，温度65℃)，再将粗产品用水-异丙醇重结晶后得到1-缬氨酸-1-脱氧-D-果糖纯品(纯度95％)，得率80％。该晶体可作香料、食品添加剂或医药原料等。
实施例2
参见图1，超滤纳滤组合法制备Amadori化合物1-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Phe)
在50L反应釜1中加入无水葡萄糖20mol、苯丙氨酸22mol、丙二酸3mol、30L无水甲醇，加热搅拌溶解，设定反应釜1回流温度为75℃，回流时间为4小时.反应完成后由一级供料泵21泵入真空浓缩灌3中，以50℃真空浓缩(真空度为-0.03Mpa)至干，加入10L软水溶解，得到反应混合物水溶液，通过二级供料泵21泵入精滤器4，经精滤器4过滤后，精滤器4的出料通过三级供料泵23泵入料液罐5，料液罐5中的料液再通过高压泵6压入透过滤膜组件7，本实施例中采用截留分子量为2000的超滤膜，除去反应液中的高分子物质，随着分离的进行，透过膜的料液越来越多，料液罐5中的截留液体积越来越小，颜色变深，粘度变大，当达到料液罐5的三分之一时，此时用蠕动泵向料液罐5加入软水，流量与膜过滤液流出量相当.通过离子色谱仪监测滤出液中的还原糖、氨基酸含量的变化，当加水量至300L时，则几乎检测不到还原糖与氨基酸和1-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖，停止稀释，超滤完毕.再以实施例1中的纳滤方法除去反应液中的剩余反应底物葡萄糖和苯丙氨酸，通过离子色谱仪监测滤出液中的葡萄糖和苯丙氨酸的变化，当加水量至400L时，则几乎检测不到葡萄糖与苯丙氨酸，停止稀释，超滤完毕.超滤滤设备操作温度不超过40℃，操作压力为5-10bar，控制膜通量为30L/m2.h-1-50L/m2.h-1之间。将该料液转移至减压浓缩装置进行加压浓缩(真空度为-0.03Mpa，温度65℃)，再将粗产品用水-异丙醇重结晶后得到1-苯丙氨酸-1-脱氧-D-果糖纯品(纯度94％)，得率20％。该晶体可作香料、食品添加剂或医药原料等。
实施例3
参见图1，纳滤法制备Amadori化合物1-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Pro)
在50L反应釜1中加入无水葡萄糖10mol、脯氨酸15mol、30L无水乙醇，加热搅拌溶解，设定反应釜1回流温度为75℃，回流时间为7小时。反应完成后由一级供料泵21泵入真空浓缩灌3中，以50℃真空浓缩(真空度为-0.03Mpa)至干，加入5L软水溶解，得到反应混合物水溶液，通过二级供料泵21将反应混合物水溶液泵入精滤器4，经精滤器4过滤后，精滤器4的出料通过三级供料泵23泵入料液罐5，料液罐5中的料液再通过高压泵6压入透过滤膜组件7，本实施例中采用截留分子量为200的纳滤膜，除去反应液中的剩余反应底物葡萄糖和脯氨酸，得到含有1-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖的膜截留液。没有透过滤膜组件的截留料液经管道送回到料液罐5，然后再进行膜分离，以此进行循环过滤。随着分离的进行，透过膜的料液越来越多，料液罐5中的截留液体积越来越小，颜色变深，粘度变大，当达到原料罐的三分之一时，此时用蠕动泵向料液罐5加入去离子水，流量与膜过滤液流出量相当。通过离子色谱仪监测滤出液中的葡萄糖、脯氨酸含量的变化，当加水量至100L时，则几乎检测不到还原糖与氨基酸，停止稀释，纳滤完毕。纳滤设备操作温度不超过40℃，操作压力为20-30bar，控制膜通量为10L/m2.h-1-20L/m2.h-1之间。将该料液转移至减压浓缩装置进行加压浓缩(真空度为-0.03Mpa，温度65℃)，再将粗产品用甲醇-乙醇重结晶后得到1-脯氨酸-1-脱氧-D-果糖纯品(纯度96％)，得率68％。该晶体可作香料、食品添加剂或医药原料等。
实施例4
参见图1，超滤纳滤组合法制备Amadori化合物1-苏氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Thr)
在50L反应釜1中加入无水葡萄糖15mol、苏氨酸20mol、丙二酸3mol、30L无水甲醇，加热搅拌溶解，设定反应釜1回流温度为75℃，回流时间为3小时。反应完成后由一级供料泵21泵入真空浓缩灌3中，以50℃真空浓缩(真空度为-0.03Mpa)至干，加入15L软水溶解，得到反应混合物水溶液，通过二级供料泵21泵入精滤器4，经精滤器4过滤后，精滤器4的出料通过三级供料泵23泵入料液罐5，料液罐5中的料液再通过高压泵6压入透过滤膜组件7，本实施例中采用截留分子量为2000的超滤膜，除去反应液中的高分子物质，随着分离的进行，透过膜的料液越来越多，料液罐5中的截留液体积越来越小，颜色变深，粘度变大，当达到料液罐5的三分之一时，此时用蠕动泵向料液罐5加入软水，流量与膜过滤液流出量相当。通过离子色谱仪监测滤出液中的还原糖、氨基酸含量的变化，当加水量至300L时，则几乎检测不到还原糖与氨基酸和1-苏氨酸-1-脱氧-D-果糖，停止稀释，超滤完毕。再以实施例1中的纳滤方法除去反应液中的剩余反应底物葡萄糖和苏氨酸，通过离子色谱仪监测滤出液中的葡萄糖和苏氨酸的变化，当加水量至400L时，则几乎检测不到葡萄糖与苏氨酸，停止稀释，超滤完毕。超滤滤设备操作温度不超过40℃，操作压力为5-10bar，控制膜通量为30L/m2.h-1-50L/m2.h-1之间.将该料液转移至减压浓缩装置进行加压浓缩(真空度为-0.03Mpa，温度65℃)，再将粗产品用水-丙酮重结晶后得到1-苏氨酸-1-脱氧-D-果糖纯品(纯度92％)，得率25％.该晶体可作香料、食品添加剂或医药原料等.
实施例5
参见图1，纳滤法制备Amadori化合物1-蛋氨酸-1-脱氧-D-果糖(Fru-Met)
在50L反应釜1中加入无水葡萄糖20mol、蛋氨酸20mol、30L无水甲醇，加热搅拌溶解，设定反应釜1的回流温度为75℃，回流时间为6小时；反应完成后由一级供料泵21泵入真空浓缩灌3中，以50℃和-0.03Mpa的真空度进行真空浓缩得干料，向干料中加入10L软水进行溶解，得到反应混合物水溶液，通过二级供料泵21将反应混合物水溶液泵入精滤器4，经精滤器4过滤，以除去反应混合物水溶液中可能存在的颗粒，防止损伤纳滤膜或超滤膜，精滤器4的出料通过三级供料泵23泵入料液罐5，料液罐5中的料液再通过高压泵6压入透过滤膜组件7，本实施例中采用截留分子量为200的纳滤膜，以除去料液中的剩余反应底物葡萄糖和蛋氨酸，得到含有1-蛋氨酸-1-脱氧-D-果糖的膜截留液。没有透过滤膜组件的截留料液经管道送回到料液罐5，然后再进行膜分离，以此进行循环过滤。随着分离的进行，透过滤膜的料液越来越多，料液罐5中的截留液体积越来越小，颜色变深，粘度变大，当达到料液罐5的三分之一时，此时用蠕动泵向料液罐5加入软水，流量与膜过滤液流出量相当。通过离子色谱仪监测滤出液中的葡萄糖、蛋氨酸含量的变化，当加水量至500L时，则几乎检测不到还原糖与氨基酸，停止稀释，纳滤完毕。纳滤设备操作温度不超过40℃，操作压力为20-30bar，控制膜通量为10L/m2.h-1-20L/m2.h-1之间。将该料液转移至减压浓缩装置进行加压浓缩(真空度为-0.03Mpa，温度65℃)，再将粗产品用水-乙酸乙酯重结晶后得到1-蛋氨酸-1-脱氧-D-果糖纯品(纯度95％)，得率75％。该晶体可作香料、食品添加剂或医药原料等。