一种高效提取纯化油菜脂肪酶的方法 【技术领域】
本发明涉及一种提取纯化植物脂肪酶的方法，特别是提取纯化油菜脂肪酶的方法。
背景技术
脂肪酶属于分解三脂酰甘油的水解酶类，在油水界面上，脂肪酶催化三酰基甘油的酯键水解，释放含有更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶在油脂水解和精炼、食品风味和香味的改进、医药、皮革绢纺脱脂、洗涤剂和化妆品等行业中都有广泛的应用。
脂肪酶广泛的存在于植物和微生物中(Rohit S Y，Uttam C B 2001)。植物脂肪酶由于原材料生长周期长、提取较困难等因素，其研究发展比微生物脂肪酶慢的多(吴秋明，叶兴乾，吴丹，等2004)，目前，用植物材料制备脂肪酶的研究专利未见报道。常规制备脂肪酶的方法如中尾正宏等发明的专利予公开NO.WO2007/066779中描述的方法-该方法中使用微生物，还有舒正玉(生物工程学报，2007)和胡泊(微生物通报，2007)等研究者都是从微生物中制备脂肪酶。但是植物脂肪酶的安全系数高于微生物脂肪酶，成本低廉，具有更广阔的应用价值和前景。
本发明选用我国最主要的油料作物之一的油菜为材料。当油菜种子萌发时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量(Teissere M，Borel M，Caillol B，et al 1995)。因此萌发期的油菜幼苗可以作为脂肪酶提取的植物材料。本发明参考从微生物中提取纯化脂肪酶的方法，如从黑曲霉F044中分离纯化脂肪酶所采用的“盐析→透析→阴离子交换层析”工艺路线(舒正玉，杨江科，闫云君 生物工程学报，2007)，以及从嗜冷枯草芽孢杆菌纯化低温脂肪酶所采用的“盐析疏水柱层析阴离子交换层析”工艺路线(胡泊，吴胜，杨柳等微生物通报，2007)，从比活力最高时期的油菜幼苗中提取脂肪酶并进行纯化，得到纯度较高的脂肪酶，从而建立了一种简单高效的油菜脂肪酶纯化方法。
【发明内容】
本发明为了克服微生物脂肪酶应用于食品行业安全系数较低等不足，提供一种从油菜中高效提取纯化脂肪酶的方法。实现本发明的技术如下：
(1)确定油菜最佳提取脂肪酶时间：在培养箱培养甘蓝型油菜品种宁油12号，油菜种子萌发期间只提供水不外加碳源，种子吸涨完全时第一次取样，以后每隔1天取一次样，共10次，样品幼苗用液氮研磨至粉末，然后和含有1.2％曲拉通X-100(Triston X-100)的磷酸钠缓冲液(0.025M，pH 7)以质量与体积比3∶10混合，12000rpm离心20min后取上清液，得粗酶液，分别测定粗酶液脂肪酶比活力；发现培养6天的油菜幼苗的脂肪酶比活力为1.89U/mg，其活性为最高；
(2)将提取的粗酶液边搅拌边向其中加入固体硫酸铵，使其中的硫酸铵饱和度为10％，摇匀后静置30min，然后在转速4000r/min下离心10min，弃去上清液，沉淀再用40％饱和度的硫酸铵盐析，摇匀后静置30min，然后在转速4000r/min下离心10min，弃去上清液，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，该条件下脂肪酶的回收率为93.49％，纯化倍数达到1.06；
(3)然后选用截留分子量为100000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩，脂肪酶的比活力为2.46u/mg，回收率为75.84％；
(4)采用M-Bondapak-C18离子交换柱层析纯化超滤液中脂肪酶，装柱后，用蒸馏水平衡；将上一步得到的处理液，蒸馏水稀释3倍后12000r/min离心10min后上柱，先后用氨水和含1mol/L NaCl的pH8的0.05mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，流速为5mL/min，出现2个洗脱峰；收集活性峰，透析，冷冻干燥，得到油菜脂肪酶蛋白，纯度分别为3.13u/mg和9.14u/mg，总回收率为43.94％。
本发明的优点：
1.本发明采用盐析和超滤相结合的方法，可以较为方便而高效地得到脂肪酶，进一步通过M-Bondapak-C18柱层析，即可达到和商品猪胰脂肪酶活力相近的水平。
2.本发明提供的油菜脂肪酶纯化过程中，区别于微生物脂肪酶分离纯化工艺，采用液氮研磨破碎植物细胞壁，溶解植物细胞质内脂肪酶和植物细胞膜内脂肪酶，提供了一种提取纯化植物细胞内分泌脂肪酶的方法，纯度高，回收率高，酶纯化倍数为4.83。
【附图说明】
图1不同萌发天数的油菜苗的脂肪酶比活力的变化
图2硫酸铵饱和度对脂肪酶回收率的影响
图3硫酸铵饱和度对脂肪酶纯化倍数的影响
图4M-Bondapak-C18离子交换层析洗脱曲线
【具体实施方式】
试验试剂：曲拉通X-100(Triston X-100)购自Amresco公司。对硝基苯基月桂酸酯(ρ-nitrophenol laurate，ρ-NPL)购自Sigma-Aldrich公司。牛血清蛋白(BSA)购自北京拜尔迪公司。异丙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠为分析纯，氨水为化学纯。超滤管购自MILLIPORE公司。层析柱2.0cm*50cm购自上海琪特分析仪器有限公司。
实施例：油菜脂肪酶的纯化
1.脂肪酶比活力的测定方法采用中华人民共和国行业标准(中华人民共和国轻工业部，1993)。
1)脂肪酶活力的测定
1mL的反应体系中含有50mmol/L的磷酸钠缓冲液，0.6％的曲拉通X-100(Triston X-100)溶液，100μmol/L的对硝基苯酚月桂酸酯(ρ-NPL)底物溶液和酶溶液(0mg/mL～2.5mg/mL)。底物溶于10mL异丙醇中，缓缓加入100mL 50mmol/L，pH7.0的Triston X-100磷酸钠缓冲液配成反应液。每900μL反应液加入100μL酶液，在25℃保温15min后，12000rpm离心30s中止反应。在实验条件下，每分钟生成1μmoL对硝基苯酚为一个活力单位，对硝基苯酚的测定采用分光光度法。
2)总蛋白的测定
考马斯亮蓝染色法进行测定，以BSA为标准蛋白。
3)比活力地测定
比活力是1mg蛋白质中脂肪酶的活力单位数。
4)回收率的测定
将脂肪酶的回收率定义为处理液中脂肪酶的活力与提取液中脂肪酶的活力的比值。脂肪酶的回收率H计算公式如下：
H(％)＝C1V1/C2C2
C1-提取液中脂肪酶的活力，U；
V1-提取液的总体积，mL；
C2-脂肪酶纯化得到的处理液中脂肪酶的活力，U；
V2-脂肪酶纯化得到的处理液的总体积，mL；
5)纯化倍数的测定
将脂肪酶的纯化倍数定义为处理液中脂肪酶的比活力与提取液中脂肪酶的比活力的比值。
2.粗酶液的制备
实验原料宁油12号油菜品系由江苏省农业科学院提供。在培养箱里培养宁油12号油菜种子，培养6天取样，样品保存于-70℃冰箱。
取-70℃冰箱保存的样品，在液氮中研磨，得到的粉末以3∶10(W/V)的比例与含有1.2％曲拉通X-100(Triston X-100)的磷酸钠缓冲液(0.025M，pH 7)混合，震荡后12000rpm离心20min，上清液即为粗酶液，其脂肪酶比活力为1.89U/mg
3.盐析
使其中的硫酸铵饱和度分别达到10％～80％，摇匀后静置30min，然后在转速4000r/min下离心10min，弃去上清液，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液。盐析试验结果如图2、3所示，硫酸铵饱和度为10％时，只出现少量的蛋白沉淀。当饱和度为20％时，有比较明显的蛋白质沉淀，此时脂肪酶的纯化倍数最大。当饱和度继续增加，纯化倍数降低很多。当饱和度为40％时，脂肪酶的回收率达到了最高。当溶液的饱和度超过60％时，由于溶液密度较大，脂肪酶沉淀物悬浮于上清液的表面，不容易被分离。综合考虑，先用10％饱和度的硫酸铵盐析，除去杂蛋白，然后采用饱和度为40％的硫酸铵进行盐析。采用这种方法对脂肪酶进行初步纯化，按照实施例1的方法测定脂肪酶比活力，发现脂肪酶的回收率为93.49％，纯化倍数达到1.06。
4.超滤
采用的超滤管是MILLIPORE公司的，截留分子量为10000Da。
取上一步得到的处理液放入超滤管中，于4℃下4000g离心8min，离心后在超滤管内补满蒸馏水再离心，重复3次。用BaCl2溶液检测透过液中无白色沉淀时即为超滤终点。然后把超滤管倒置在离心机里，于4℃下4000g离心20min，再向管中加1mL的蒸馏水振荡溶解超滤产物。
按照实施例1的方法测定脂肪酶比活力，发现截留分子量为10000Da的超滤膜纯化脂肪酶的回收率为94.62％。
5.M-Bondapak-C18离子交换层析
M-Bondapak-C18按产品说明书要求进行处理。装柱(2.0cm*50cm柱)后，用蒸馏水平衡。将上一步得到的处理液，蒸馏水稀释3倍后12000r/min离心10min后上柱，先后用氨水和含1mol/L NaCl的pH80.05mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，流速为5mL/min，峰收集，洗脱体积为400mL；收集活性峰，透析，冷冻干燥备用。
由图4可知，分离得到二个活性峰，分别为氨水和含1mol/L NaCl的pH8 0.05mol/L磷酸钠缓冲液洗脱得到的洗脱峰。收集活性峰，测定各峰的总蛋白、总活性，然后计算比活力、纯化倍数、回收率。最后得到的脂肪酶分离纯化的结果如表1所示。发现层析峰2的纯化效果远远高于层析峰1。按照实施例1的方法测定脂肪酶比活力，发现层析峰2的最后回收率达到了34.13％，纯化倍数约为5倍。