用7-乙基-10-羟基喜树碱的多臂聚合物缀合物治疗非霍奇金氏淋巴瘤 相关申请
本申请为2007年2月9日提交的美国申请序列号11/704,607的继续申请(Continuation-in-Part)，其要求2006年2月9日提交的美国临时申请号60/772,464、2006年6月9日提交的60/804,391、2006年9月15日提交的60/844,938和2006年11月6日提交的60/864,516的优先权，每篇的内容在此引入作为参考。
【发明领域】
本发明涉及用7-乙基-10-羟基喜树碱的聚合物前药(polymeric prodrug)治疗淋巴瘤的方法。尤其是，本发明涉及用7-乙基-10-羟基喜树碱的聚乙二醇缀合物(conjugates)治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方法。
【发明背景】
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)是一类与免疫系统(如淋巴细胞)相关的癌症。NHL可能在任何与淋巴系统有关的器官(如脾、淋巴结或扁桃体)中发展。NHL可能在任何年龄发生，且通常表现为淋巴结增大、发热和体重减轻。NHL通常分为侵袭性的(快速生长)和惰性的(慢速生长)类型。NHL也分为B-细胞或T-细胞NHL。B-细胞NHL包括Burkitt’s淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，成免疫细胞大细胞淋巴瘤，母体B-成淋巴细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。T-细胞NHL包括蕈样肉芽肿病，间变性大细胞淋巴瘤和母体T-成淋巴细胞淋巴瘤。与骨髓或干细胞移植后的淋巴组织增殖性疾病有关的淋巴瘤通常为B-细胞NHL。预测和治疗依赖于疾病的阶段和类型。
经过几年，已经建议了一些治疗患有非霍奇金氏淋巴瘤的患者的方法。一些尝试包括基于CPT-11(也称为伊立替康(CPT-11，))的治疗。已经认为这些尝试的结果是不成功的。本发明提供了另一种治疗。
发明简述
在本发明的一方面中，提供了治疗患有非霍奇金氏淋巴瘤的患者的方法。该治疗包括向有此需要的患者给药有效量的式(I)化合物。
在本发明的该方面中，所用的式(I)化合物包括
其中
R1、R2、R3和R4独立地为OH或(L)m-D；
L为双功能连接基；
D为
m为0或正整数；且
n为正整数；
条件是：R1、R2、R3和R4不全是OH。
在本发明的一些优选方面中，n为约28至约341，且优选为约227。
通过下述说明和附图，本发明的优点将是明显的。
对于本发明的目的，术语″残基″应该理解为指化合物的一部分，对此其为，即7-乙基-10-羟基喜树碱、氨基酸等，其在经历与其他化合物的取代反应后仍保留。
对于本发明的目的，术语″含聚合物的残基″或″PEG残基″应该分别理解为是指聚合物或PEG的一部分，其在经历与含7-乙基-10-羟基喜树碱的化合物反应后仍保留。
对于本发明的目的，术语″烷基″应该理解为包括直链、支链、被取代(如被卤素-、烷氧基-，、硝基-取代)的C1-12烷基但优选C1-4烷基、C3-8环烷基或被取代的环烷基等。
对于本发明的目的，术语″被取代的″应该理解为包括加入一个或多个原子或用一个或多个不同的原子替换官能团或化合物中所含的一个或多个原子。
对于本发明的目的，被取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基和巯基烷基；被取代的烯基包括羧基烯基、氨基烯基、二烯基氨基、羟基烯基和巯基烯基；被取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羟基炔基和巯基炔基；被取代的环烷基包括如4-氯环己基的基团(moieties)；芳基包括如萘基的基团；被取代的芳基包括如3-溴苯基地基团；芳烷基包括如甲苯基的基团；杂烷基包括如乙基噻吩的基团；被取代的杂烷基包括如3-甲氧基-噻吩的基团；烷氧基包括如甲氧基的基团；且苯氧基包括如3-硝基苯氧基的基团。卤素应该理解为包括氟、氯、碘和溴。
对于本发明的目的，术语″有效量″和“足量”应该指实现所需效果或治疗效果的量，该效果是本领域技术人员能够理解的。
【附图说明】
图1图示说明了制备实施例1-2中所述的四臂聚乙二醇酸的反应流程。
图2图示说明了制备实施例3-7中所述的4臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的反应流程。
图3表示实施例10中所述的4臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的体外代谢。
图4表示实施例12中所述的4臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)的稳定性。
图5表示实施例12中所述的pH对于4臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)稳定性的影响。
图6表示实施例13中所述的4臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基-喜树碱)的药物代谢动力学特性。
发明详述
本发明涉及治疗淋巴瘤的方法。在本发明的一方面中，提供了治疗患有非霍奇金氏淋巴瘤的患者的方法。该方法包括向有此需要的患者给药有效量的式(I)化合物。在一个所用的实施方案中，式(I)化合物具有下述结构：
其中
R1、R2、R3和R4独立地为OH或(L)m-D；
L为双功能连接基；
D为
m为0或正整数，优选为约1至约10，且更优选为1；且
n为正整数，优选为约28至约341，更优选为约114至约227，且最优选为约227；
条件是：R1、R2、R3和R4不全是OH。
在一些优选方面，所述治疗包括给药具有式(II)的化合物：
给药量的范围为约0.3mg/m2体表面/剂至约90mg/m2体表面/剂。更优选地，给药量的范围为约0.9mg/m2至约30mg/m2。对于本发明的目的，剂量应该理解为是指7-乙基-10-羟基喜树碱的量，而不是给药的聚合物缀合物的量。
在另一方面，本发明包括式(I)化合物在制备用于有此需要的哺乳动物中治疗非霍奇金氏淋巴瘤的药物中的用途。
A.多臂聚合物
本文所述的化合物的聚合物部分包括多臂PEG’s。多臂PEG’s描述于NOF Corp.Drug Delivery System catalog，Ver.8，2006年4月中，其内容在此引入作为参考。一种尤其优选的多臂PEG具有下述结构：
其中n为正整数。
在本发明的一个优选实施方案中，聚合物的聚合度(n)为约28至约341，以提供具有总分子量为约5,000Da至约60,000Da的聚合物，且优选为约114至约227，以提供具有总分子量为约20,000Da至约40,000Da的聚合物。在本发明一个尤其优选的实施方案中，n为约227。
B.双功能连接基
在本发明的一些优选方面，双功能连接基包括氨基酸。所述氨基酸选自任何已知的天然L-氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸和/或它们的组合等。在另一方面，L可以为肽残基。该肽的大小范围为约2至约10个氨基酸残基。
天然氨基酸的衍生物和类似物，以及多种已知的非天然氨基酸(D或L)，疏水的或非疏水的，也可以用于本发明的范围。简单举例为，氨基酸类似物和衍生物包括：
2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、
2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、γ-氨基丁酸(piperidinic acid)、6-氨基己酸、
2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、
2-氨基庚二酸、2，4-氨基丁酸、锁链素、2，2-二氨基庚二酸、
2，3-二氨基丙酸、n-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、3-羟基脯氨酸、
4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸或肌氨酸、
N-甲基-异亮氨酸、6-N-甲基-赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸以及其他许多物质，它们列于63Fed.Reg.，29620，29622中，在此引入作为参考。一些优选的L基团包括甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸或肌氨酸。更优选地，本发明化合物包括甘氨酸作为连接基团(L)。
在本发明的另一方面中，连接7-乙基-10-羟基喜树碱和聚合物的L选自：
-[C(＝O)]v(CR22R23)t-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t-O-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t-NR26-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tO-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tNR26-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tO-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tNR26-，
-[C(＝O)]v(CR22R23O)t-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23O)t-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23O)t-，
-[C(＝O)]v(CR22R23O)t(CR24R25)y-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23O)t(CR24R25)y-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24R25)y-，
-[C(＝O)]v(CR22R23O)t(CR24R25)yO-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t(CR24R25O)y-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23O)t(CR24R25)yO-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t(CR24R25O)y-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23O)t(CR24R25)yO-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25O)y-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tS-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tO-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)tNR26-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)tNR26-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)tNR26-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)y-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)y-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)y-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)yO-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)y-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)yNR26-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)yO-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)y-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R29O)yNR26-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)yO-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)y-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)yNR26-，
其中：
R21-R29独立地选自氢、氨基、被取代的氨基、叠氮基、羧基、氰基、卤素、羟基、硝基、甲硅烷基醚(silyl ether)、磺酰基、巯基、C1-6烷基巯基、芳基巯基、被取代的芳基巯基、被取代的C1-6烷硫基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6被取代的烷基、C2-6被取代的烯基、C2-6被取代的炔基、C3-8被取代的环烷基、芳基、被取代的芳基、杂芳基、被取代的杂芳基、C1-6杂烷基、被取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6被取代的烷酰基、被取代的芳基羰基、C2-6被取代的烷酰基氧基、被取代的芳氧基羰基、C2-6被取代的烷酰基氧基和被取代的芳基羰基氧基；
(t)、(t’)和(y)独立地选自0或正整数，优选为约1至约10；且
(v)为0或1。
在一些优选实施方案中，L可以包括：
-[C(＝O)]v(CH2)t-，
-[C(＝O)]v(CH2)t-O-，
-[C(＝O)]v(CH2)t-NR26-，
-[C(＝O)]vO(CH2)t-，
-[C(＝O)]vO(CH2)tO-，
-[C(＝O)]vO(CH2)tNH-，
-[C(＝O)]vNH(CH2)t-，
-[C(＝O)]vNH(CH2)tO-，
-[C(＝O)]vNH(CH2)tNH-，
-[C(＝O)]v(CH2O)t-，
-[C(＝O)]vO(CH2O)t-，
-[C(＝O)]vNH(CH2O)t-，
-[C(＝O)]v(CH2O)t(CH2)y-，
-[C(＝O)]vO(CH2O)tH2)y-，
-[C(＝O)]vNH(CH2O)t(CH25)y-，
-[C(＝O)]v(CH2O)t(CH2)yO-，
-[C(＝O)]v(CH2)t(CH2O)y-，
-[C(＝O)]vO(CH2O)t(CH2)yO-，
-[C(＝O)]vO(CH2)t(CH2O)y-，
-[C(＝O)]vNH(CH2O)t(CH2)yO-，
-[C(＝O)]vNH(CR22R23)t(CH2O)y-，
-[C(＝O)]v(CH2)tO-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]v(CH2)tNH-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]v(CH2)tS-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]vO(CH2)tO-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]vO(CH2)tNH-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]vO(CH2)tS-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]vNH(CR22R23)tO-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]vNH(CH2)tNH-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]vNH(CH2)tS-(CH2)t’-，
-[C(＝O)]v(CH2CH2O)tNR26-，
-[C(＝O)]v(CH2CH2O)t-，
-[C(＝O)]vO(CH2CH2O)tNH-，
-[C(＝O)]vO(CH2CH2O)t-，
-[C(＝O)]vNH(CH2CH2O)tNH-，
-[C(＝O)]vNH(CH2CH2O)t-，
-[C(＝O)]v(CH2CH2O)t(CH2)y-，
-[C(＝O)]vO(CH2CH2O)t(CH2)y-，
-[C(＝O)]vNH(CH2CH2O)t(CH2)y-，
-[C(＝O)]v(CH2CH2O)t(CH2)yO-，
-[C(＝O)]v(CH2)t(CH2CH2O)y-，
-[C(＝O)]v(CH2)t(CH2CH2O)yNH-，
-[C(＝O)]vO(CH2CH2O)t(CH2)yO-，
-[C(＝O)]vO(CH2)t(CH2CH2O)y-，
-[C(＝O)]vO(CH2)t(CH2CH2O)yNH-，
-[C(＝O)]vNH(CH2CH2O)t(CH2)yO-，
-[C(＝O)]vNH(CH2)t(CH2CH2O)y-，
-[C(＝O)]vNH(CH2)t(CH2CH2O)yNH-，
其中(t)、(t’)和(y)独立地选自0或正整数，优选为约1至约10；且
(v)为0或1。
在本发明的另一个优选方面，所述化合物包括1至10个单元的双功能连接基。更优选地，包括1个单元的双功能连接基，因此m为1。
其它连接基见于Greenwald等人(Bioorganic&Medicinal Chemistry，1998，6：551-562)的表1中，其内容在此引入作为参考。
C.前药的合成
通常，本发明在治疗中使用的前药通过下述反应制备：一或多个当量的活化多臂(multi-arm)聚合物，每个活性部位与例如一或多个当量的7-乙基-10-羟基喜树碱-氨基酸缀合物反应，反应条件为足以有效引起氨基与聚合物的羧酸反应并形成连接。
更具体的，本方法可以包括：
1)提供一当量包含可用的20-羟基的7-乙基-10-羟基喜树碱和一当量或更多的包含可用的羧酸基的双官能连接基；
2)在惰性溶剂例如DCM(或DMF、氯仿、甲苯或其混合物)中在偶联剂例如1，(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)，(或1，3-二异丙基碳二亚胺)(DIPC)，任何适宜的二烷基碳二亚胺，Mukaiyama试剂(例如2-卤-1-烷基吡啶鎓卤化物)或丙烷磷酸环酐(PPACA等)和适宜的碱例如DMAP存在下使两种反应物反应形成7-乙基-10-羟基喜树碱-双官能连接基中间体；和
3)每个活性部位用一当量或更多当量所得的具有氨基中间体(例如实施例6中所用的2当量)与一当量活化的聚合物(如PEG酸)反应，所述反应在惰性溶剂例如DCM(或DMF、氯仿、甲苯或其混合物)中在偶联剂例如1，(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺(EDC)，PPAC(或1，3-二异丙基碳二亚胺)(DIPC)，任何适宜的二烷基碳二亚胺，Mukaiyama试剂(例如2-卤-1-烷基吡啶鎓卤化物)或丙烷磷酸环酐(PPACA)等和适宜的碱例如DMAP存在下进行，所述试剂可以从Sigma Chemical购得或使用已知技术在0℃到22℃的温度间合成。
在一个优选方面，7-乙基-10-羟基喜树碱的10-羟基在步骤1)之前被保护。
用于7-乙基-10-羟基喜树碱的10-羟基的芳香保护基是优选的，因为其7-乙基-10-羟基喜树碱中间体具有更好的溶解度并可以有效力和有效地纯化为高纯度形式。例如，包含甲硅烷基(silyl)的保护基例如叔丁基二苯基氯硅烷基(TBDPSCl)、叔丁基二甲基氯硅烷基(TBDMSCl)和三甲基氯硅烷基(TMSCl)可用于保护7-乙基-10-羟基喜树碱的10-羟基。
活性聚合物，即包含1-4末端羧酸基的聚合物可通过例如使用本领域技术人员已知的标准技术将NOF Sunbright类型或其它具有末端OH基的支链聚合物转化为相应的羧酸衍生物而制备。参见实施例1-2以及共同转让的(commonly assigned)美国专利5,605,976，在此引入作为参考。
第一和第二偶联剂可以是相同或不同的。
优选的双官能连接基的例子包括甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、肌氨酸等。或者可以使用其它合成而不用过多的实验。
根据本发明，给药的化合物包括：
尤其优选的治疗包括给药具有下述结构的化合物：
其中聚合物的所有四臂均通过甘氨酸与7-乙基-10-羟基喜树碱轭合，且聚合物部分具有的分子量为约40,000道尔顿。
D.组合物/制剂
包含本发明聚合物缀合物的药物组合物可以通过本领域已知方法制备，例如使用多种已知的混合、溶解、制粒、研磨、乳化、胶囊化、加入(entrapping)或冻干方法。组合物可与一种或多种包含赋形剂和辅料的生理可接受载体一起制剂，所述载体有助于将活性化合物加工成可用于医药的制剂。适宜的制剂取决于所选的给药途径。本发明的许多方面中优选胃肠外途径。
对于注射，非限制性地包括静脉内、肌内和皮下注射，本发明化合物可以在水性溶液中配制，优选在生理相容的缓冲液例如生理盐水缓冲液或极性溶剂，包括但不限于吡咯烷酮或二甲亚砜中配制。
本文所述的化合物还可配制为用于胃肠外给药，例如通过大量推注或连续输液。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中。有用的组合物包括但不限于在油性或水性溶媒中的悬浮剂、溶液或乳剂，还可包括添加剂(adjuncts)例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。用于胃肠外给药的的药物组合物包括水溶形式的水性溶液，该水溶形式例如但非限制的为活性化合物的盐(优选)。另外，活性化合物的悬浮液可以在亲脂性溶媒中制备。适宜的亲脂性溶媒包括脂肪油例如芝麻油、合成脂肪酸酯例如油酸乙酯和三酸甘油酯，或材料例如脂质体。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠盐、山梨糖醇或者右旋糖酐。任选的，悬浮液还可包含适宜的稳定剂和/或增加化合物溶解度的试剂以制备高浓度溶液。或者，活性成分可以是粉末形式以在使用前与适宜的溶媒，例如无菌、无热原的水配制。
对于口服给药，化合物可通过将活性物质与本领域已知的药学可接受的载体组合配制。这些载体能使本发明化合物配制为片剂、丸剂、锭剂(lozenges)、糖衣丸(dragees)、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、糊剂、浆液、溶液、悬浮剂、浓溶液和用于稀释在患者饮用水中的悬浮剂、用于稀释在患者食物中的预混合剂等，用于患者口服摄取。用于口服的药物制剂可以使用固体赋形剂、可选地研磨所得混合物，和将混合物制粒，随后如果需要加入其它适宜辅料得到片剂或糖衣芯而制备。特别的，有用的赋形剂是，填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制品例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉和马铃薯淀粉及其他原料例如明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、羧基-甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，还可加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者海藻酸。还可使用盐，例如海藻酸钠盐。
对于吸入给药，本发明化合物可以使用加压包装或喷雾器和适宜的推进剂，以气雾剂喷雾形式方便地递送。
化合物还可以使用例如常规栓剂基质例如可可脂或其它甘油酯，配制为直肠组合物例如栓剂或灌肠剂。
除了前述制剂，化合物还可制剂为储库制品(depot preparation)。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或肌肉注射给药。对于这一给药途径，本发明的化合物可以与适宜的聚合的或疏水材料(例如在乳剂中与药理学上可接受的油)、与离子交换树脂配制或作为微溶衍生物如非限制性的微溶盐。
还可使用其它的递送体系例如脂质体和乳剂。
另外，化合物可使用持续释放(sustained-release)系统，例如包含治疗剂的固体疏水聚合物的半渗透基质。已经制备出多种持续释放材料，且为本领域技术人员所熟知。持续释放的胶囊可以根据其化学性质，持续数周至超过100天释放化合物。根据特定化合物的化学性质和生物稳定性，还可采用其它的稳定策略。
E.剂量
治疗有效量指有效预防、减轻或改善易被7-乙基-10-羟基喜树碱影响的病症的化合物的量.治疗有效量的确定是本领域技术人员所具有的能力，尤其是在本文所公开内容的基础上.
对于本发明的方法使用的任何化合物，治疗有效量可以由体外试验开始推定。随后可以配制供动物模型使用的剂量以实现包括有效剂量的循环浓度范围。这样的信息随后可用于更加精确地确定用于患者的剂量。
本文描述的化合物的毒性和治疗效力可以使用本领域熟知的方法通过在细胞培养或实验动物中的标准药学方法来测定。当然剂量也可以根据剂型和给药途径而变化。医师根据患者的情况可选择具体的制剂、给药途径和剂量。
然而通常，用于全身递送的本发明化合物的优选剂量范围是大约1到大约100mg/kg/周且优选大约2到大约60mg/kg/周。
在一个优选方案中，本发明的治疗包括以下述量给药本文所述的化合物：约0.3mg/m2体表面/剂(dose)至约90mg/m2体表面/剂。更优选地，本文所述的化合物的量的范围为约0.9mg/m2体表面/剂至约30mg/m2体表面/剂。
治疗方案可以基于每天给药一次单剂量给药或分成多剂量给药，其可以作为多周治疗方案的一部分。精确的剂量将依赖于病况的阶段和严重程度，肿瘤对聚合物前药组合物的敏感性，和所治疗的患者的个体特征，这是本领域技术人员理解的。
还应理解所述治疗将给药1天或多天直到达到所需的临床结果。
在一些优选方面，所述治疗方案包括给药量范围为每周约1mg/m2体表面/剂至约16mg/m2体表面/剂，持续3周，然后1周不治疗，且重复约3个周期。每3周的给药量的范围为约1.25mg/m2体表面/剂至约45mg/m2体表面/剂。
或者，所给药的化合物可以基于体重。因此，该量的范围为约0.1mg/kg体重/剂至约30mg/kg体重/剂，优选为约0.3mg/kg至约10mg/kg。具体剂量如给药10mg/kg，q2d x 5给药方案(多剂量)或30mg/kg，单剂量给药方案。
在本发明所有给药聚合物缀合物的方面中，所述剂量基于7-乙基-10-羟基喜树碱的量，而不是所给药的聚合物缀合物的量。
本发明的其它方面包括将本文所述的化合物与其它抗癌治疗组合，实现协同作用或其它益处。
F.非霍奇金氏淋巴瘤的治疗
本发明提供了治疗淋巴瘤的方法。在一个优选方面，本发明提供了治疗患有非霍奇金氏淋巴瘤的患者的方法。对于本发明的目的，“治疗”或“治愈”应该理解为指抑制、减轻、缓解和预防肿瘤生长、肿瘤负荷和转移，肿瘤消退，或预防治疗完成后的患者中肿瘤的复发和/或新生瘤生长。
被治疗的非霍奇金氏淋巴瘤可以包括攻击性的(aggressive)(快速生长)和惰性的(indolent)(慢速生长)类型。或者，非霍奇金氏淋巴瘤可包括B-细胞或T-细胞NHL。B-细胞NHL的非限制性实例包括Burkitt’s淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)，滤泡淋巴瘤(follicularlymphoma)，成免疫细胞大细胞淋巴瘤(immunoblastic large cell lymphoma)，母体B-成淋巴细胞淋巴瘤(precursor B-lymphoblastic lymphoma)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukima)(CLL)/小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)(SLL)(chronic lymphocytic leukima)、结节外边缘区域B-细胞淋巴瘤-粘液-相关的淋巴组织(extranodal marginal zone B-cell lymphoma-mucosa-associatedlymphoid tissue)(MALT)淋巴瘤、结节边缘区域B-细胞淋巴瘤(nodalmarginal zone B-cell lymphoma)、脾边缘区域B-细胞淋巴瘤(splenic marginalzone B-cell lymphoma)、原发性纵隔B-细胞淋巴瘤(primary mediastinal B-celllymphoma)、淋巴质浆细胞淋巴瘤(lymphoplasmocytic lymphoma)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤(primarycentral nervous system(CNS)lymphoma)。T-细胞NHL包括蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)，间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)、血管免疫母细胞T-细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-cell lymphoma)、结节外自然杀伤/T-细胞淋巴瘤(extranodal natural killer/T-cell lymphoma)、肠病型T-细胞淋巴瘤(enteropathy type T-cell lymphoma)、皮下脂膜炎样T-细胞淋巴瘤(subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma)和母体T-成淋巴细胞淋巴瘤(precursor T-lymphoblastic lymphoma)。其它非霍奇金氏淋巴瘤也在本发明的范围内，且对于本领域技术人员来说是明显的。
在其它方面，所述治疗包括与骨髓或干细胞移植后的淋巴组织增殖性疾病相关的淋巴瘤，如B-cell NHL。
实施例
提供下述实施例用于进一步理解本发明，但不是为了以任何方式限制本发明的有效范围。实施例中所引的带下划线和黑体的数字对应于图1-2中所示的的数字。
一般方法所有反应均在干燥氮气或氩气氛下进行。使用商业试剂而没有进一步的纯化。所有PEG化合物使用前在真空下干燥或从甲苯中共沸蒸馏。除非另有说明，13C NMR图谱在75.46MHz使用Varian300NMR光谱仪，且使用氘代氯仿和甲醇作为溶剂得到。化学位移(δ)从四甲基硅烷(TMS)低场以百万分之一(ppm)为单位报道。
HPLC方法反应混合物，以及中间体和终产物的纯度通过BeckmanCoulter SystemHPLC仪监测。使用300SB C8反相柱(150x4.6mm)或Phenomenex300A C18反相柱(150x4.6mm)用多波长UV检测器，使用10-90％乙腈在0.05％三氟乙酸(TFA)中的梯度，流速为1mL/分钟)。
实施例1.40k4臂-PEG-tBu酯(化合物2)：
40k4臂-PEG-OH(12.5g，1当量)与220mL甲苯共沸移除35mL甲苯/水。将溶液冷却至30℃，并加入1.0M叔丁醇钾的叔丁醇(3.75mL，3当量x4＝12当量)溶液。混合物于30℃搅拌30分钟，然后加入溴乙酸叔丁酯(0.975g，4当量x 4＝16当量)。反应于30℃保持1小时，然后冷却至25℃。将150mL的乙醚(ether)缓慢加入至沉淀的产物中。将所得混悬液冷却至17℃，并于17℃保持半小时。过滤粗产物，且湿滤饼用乙醚洗涤2次(2x 125mL)。将分离的湿滤饼溶于50ml的DCM中，且产物用350ml乙醚沉淀，并过滤。湿滤饼用乙醚洗涤2次(2x 125mL)。产物在真空下于40℃干燥(产率＝98％，12.25g)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ27.71，68.48-70.71(PEG)，80.94，168.97.
实施例2.40k4臂-PEG酸(化合物3)：
将40k4臂-PEG-tBu酯(化合物2，12g)溶于120mL的DCM中，然后加入60mL的TFA。混合物于室温搅拌3小时，然后真空下于35℃移除溶剂。所得油状残余物溶于37.5mL的DCM中。粗产物用375mL乙醚沉淀。湿滤饼溶于30mL的0.5％NaHCO3中.产物用DCM萃取2次(2x150ml).合并的有机层经2.5g的MgSO4干燥。真空下于室温移除溶剂。所得残余物溶于37.5mL的DCM中，且产物用300mL乙醚沉淀，并过滤。湿滤饼用乙醚洗涤2次(2x 125ml)。产物在真空下于40℃干燥(产率＝90％，10.75g)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ67.93-71.6(PEG)，170.83.
实施例3.TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物5)：
向7-乙基-10-羟基喜树碱(化合物4，2.0g，5.10mmol，1当量)在100mL无水DCM中的混悬液中加入Et3N(4.3mL，30.58mmol，6当量)和TBDPSCl(7.8mL，30.58mmol，6当量)。将反应混合物加热回流过夜，然后用0.2N的HCl溶液(2x 50mL)、饱和NaHCO3溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤。有机层经MgSO4干燥，过滤，并真空蒸发。残余物溶于无水DCM中，并通过加入己烷进行沉淀。重复用DCM/己烷进行沉淀以除去过量TBDPSCl。过滤固体，并真空干燥得到2.09g产物。(65％产率)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.90(3H，t，J＝7.6Hz)，1.01(3H，t，J＝7.3Hz)，1.17(9H，s)，1.83-1.92(2H，m)，2.64(2H，q，6.9Hz)，3.89(1H，s，OH)，5.11(2H，s)，5.27(1H，d，J＝16.1Hz)，5.72(1H，d，J＝16.4Hz)，7.07(2H，d，J＝2.63Hz)，7.36-7.49(7H，m)，7.58(1H，s)，7.75-7.79(4H，m)，8.05(1H，d，J＝9.4Hz).13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ7.82，13.28，19.52，22.86，26.48，31.52，49.23，66.25，72.69，97.25，110.09，117.57，125.67，126.57，127.65，127.81，130.02，131.69，131.97，135.26，143.51，145.05，147.12，149.55，149.92，154.73，157.43，173.72.
实施例4.TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Gly-Boc(化合物6)：
向0℃的TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物5，3.78g，5.99mmol，1当量)和Boc-Gly-OH(1.57g，8.99mmol，1.5当量)在100mL无水DCM中的溶液中加入EDC(1.72g，8.99mmol，1.5当量)和DMAP(329mg，2.69mmol，0.45当量)。反应混合物于0℃搅拌，直到HPLC表明起始物料完全消失(约1小时45分钟)。有机层用0.5％NaHCO3溶液(2x 50mL)、水(1x 50mL)、0.1N的HCl溶液(2x 50mL)和盐水(1x 50mL)洗涤；并经MgSO4干燥。过滤并真空蒸发后，得到4.94g粗产物(定量产率)。粗固体没有进一步纯化即用于下一步反应。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.89(3H，t，J＝7.6Hz)，0.96(3H，t，J＝7.5Hz)，1.18(9H，s)，1.40(9H，s)，2.07-2.29(3H，m)，2.64(2H，q，7.5Hz)，4.01-4.22(2H，m)，5.00(1H，br s)，5.01(2H，s)，5.37(1H，d，J＝17.0Hz)，5.66(1H，d，J＝17.0Hz)，7.08(1H，d，J＝2.34Hz)，7.16(1H，s)，7.37-7.50(7H，m)，7.77(4H，d，J＝7.6Hz)，8.05(1H，d，J＝9.4Hz).13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ7.52，13.30，19.50，22.86，26.45，28.21，31.64，42.28，49.14，67.00，76.65，79.96，95.31，110.13，118.98，125.75，126.45，127.68，127.81，130.03，131.54，131.92，135.25，143.65，144.91，145.19，147.08，149.27，154.75，155.14，157.10，166.98，169.17.
实施例5.TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Gly·HCl(化合物7)：
向TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Gly-Boc(化合物6，1g，1.27mmol)在5mL无水二噁烷中的溶液中加入5mL的4M的HCl在二噁烷中的溶液。反应混合物于室温搅拌直到HPLC表明起始物料完全消失(1小时)。将反应混合物加入至50mL乙醚中，并过滤所得固体。将固体溶于50mL的DCM中，并用盐水(通过加入饱和NaHCO3溶液将pH调节至2.5)洗涤。有机层经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。残余物溶于5mL的DCM，并通过加入50mL乙醚沉淀。过滤得到770mg(84％产率)终产物。1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ0.84(3H，t，J＝7.6Hz)，1.05(3H，t，J＝7.3Hz)，1.16(9H，s)，2.15-2.30(3H，m)，2.59(2H，q，7.6Hz)，4.16(1H，d，J＝17.9Hz)，4.26(1H，d，J＝17.9Hz)，5.13(2H，s)，5.46(1H，d，J＝17.0Hz)，5.60(1H，d，J＝17.0Hz)，7.11(1H，d，J＝2.34Hz)，7.30(1H，s)，7.40-7.51(6H，m)，7.56(1H，dd，J＝2.34，9.4Hz)，7.77(4H，dd，J＝7.6，1.6Hz)，7.98(1H，d，J＝9.1Hz).13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ8.09，13.72，20.26，23.61，26.94，31.83，41.01，50.71，67.62，79.51，97.03，111.65，119.69，127.13，128.97，128.99，129.11，131.43，131.96，133.00，133.03，136.51，145.62，145.81，147.24，148.29，150.58，156.27，158.68，167.81，168.34.
实施例6.40k4臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-TBDPS(化合物8)：
向40k4臂-PEGCOOH(化合物3，1.4g，0.036mmol，1当量)在14mL无水DCM中的溶液中加入TBDPS-(10)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(20)-Gly·HCl(化合物7，207mg，0.29mmol，2.0当量，每个活性位点)、DMAP(175mg，1.44mmol，10当量)和PPAC(0.85mL的50％EtOAc溶液，1.44mmol，10当量)。反应混合物于室温搅拌过夜，然后真空蒸发。所得残余物溶于DCM中，且产物用乙醚沉淀并过滤。残余物用DMF/IPA重结晶得到产物(1.25g)。13CNMR(75.4MHz，CDCl3)：δ7.45，13.20，19.39，22.73，26.42，31.67，40.21，49.01，66.83，95.16，110.02，118.83，125.58，126.40，127.53，127.73，129.96，131.49，131.76，131.82，135.12，143.51，144.78，145.13，146.95，149.21，154.61，156.92，166.70，168.46，170.30.
实施例7.40k 4臂-PEG-Gly(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物9)：
向化合物40k 4臂-PEG-Gly-(20)-(7-乙基-10-羟基喜树碱)-(10)-TBDPS(化合物8，1.25g)中加入TBAF(122mg，0.46mmol，4当量)在THF和0.05M的HCl溶液(12.5mL)的1∶1混合物中的溶液。反应混合物于室温搅拌4小时，然后用DCM萃取2次。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发。残余物溶于7mL的DMF中，并用37mL的IPA沉淀。过滤固体，并用IPA洗涤。重复用DMF/IPA的进行沉淀。最后将残余物溶于2.5mL的DCM中，并通过加入25mL乙醚进行沉淀。过滤固体，并于40℃在真空中干燥过夜(860mg)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ7.48，13.52，22.91，31.67，40.22，49.12，66.95，94.82，105.03，118.68，122.54，126.37，128.20，131.36，142.92，144.20，144.98，147.25，148.29，156.44，156.98，166.82，168.49，170.39。该NMR数据表示没有PEG-COOH的信号，表明所有的COOH均已经反应。通过荧光监测测定时，发现负载为3.9，这与7-乙基-10-羟基喜树碱在聚合物的4个支链上均完全负载一致。以大得多的规模重复该实验得到一致的结果。
生物学数据
实施例8.毒性数据
使用裸小鼠研究轭合四臂PEG的7-乙基-10-羟基喜树碱的最大耐受剂量(MTD)。监测小鼠14天的死亡率和疾病信号，且当体重减少＞治疗前的体重的20％时处死。
表1表示化合物9(单剂量和多剂量给药)的最大耐受剂量。对小鼠隔天给药多剂量给药的每个剂量，持续10天，然后再观察4天，因此总共14天。
表1.在裸小鼠中的MTD数据
单剂量给药时，发现4臂-PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物9)的MTD为30mg/kg，当多剂量给药(q2d x 5)时为10mg/kg。
实施例9.在非霍奇金氏淋巴瘤细胞中的细胞毒性
细胞毒性表示每种化合物的体外抗肿瘤能力。使用MTS实验检测PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)(化合物9)和CPT-11的体外细胞毒性。于37℃将细胞用药物孵育72小时。孵育后，加入MTS染料，并于490nm检测形成的有色产物(甲)。
化合物9和CPT-11的IC50值表示化合物9与CPT-11相比，具有高得多的对被测NHL细胞的体外抑制。在Raji和Daudi Burkitt’s淋巴瘤细胞中化合物9的IC 50为2至20nM，且比CPT-11有效约30至50倍。
实施例10.体外代谢
在大鼠肝细胞中观察PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)缀合物(化合物9)的体外代谢。于pH 7.5，37℃将化合物9与大鼠肝细胞孵育2小时。如图3所示，7-乙基-10-羟基-喜树碱和7-乙基-10-羟基喜树碱-葡糖苷酸(7-乙基-10-羟基-喜树碱-G)为确认的主要代谢产物，这与已知的7-乙基-10-羟基喜树碱的体内代谢途径一致。
实施例11.PEG缀合物的性质
表2表示PEG-(7-乙基-10-羟基喜树碱)缀合物在盐水溶液中的溶解度。化合物9表现出高达相当于4mg/mL的7-乙基-10-羟基喜树碱的良好溶解性。在人血浆中，7-乙基-10-羟基喜树碱从PEG缀合物中稳定释放22至52分钟的倍增时间(doubling time)，且如下述实施例12所述释放表现出pH和浓度依赖。
表2.PEG-7-乙基-10-羟基喜树碱缀合物的性质
a7-乙基-10-羟基喜树碱在盐水中不溶
bPEG缀合物半衰期
c7-乙基-10-羟基喜树碱从缀合物中的形成速率
室温下PEG-Gly-7-乙基-10-羟基喜树碱缀合物在盐水中和其它水性介质中表现出良好的稳定性，持续时间高达24小时。
实施例12.浓度和pH对稳定性的影响
使用基于UV的HPLC方法监测大鼠和人血浆中的水稳定性和水解性质。室温下将4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)缀合物(化合物9)与每个样品孵育5分钟。
PEG-7-乙基-10-羟基喜树碱缀合物在缓冲液中的稳定性是pH依赖性的。图4表示4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)在多种样品中的稳定性。图5表示7-乙基-10-羟基喜树碱从PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)中的释放速率随pH升高而增加。
实施例13.药物代谢动力学
向无肿瘤的Balb/C小鼠单次(single)注射20mg/kg的4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)缀合物。在多个时间点处死小鼠，并通过HPLC分析血浆中完整的缀合物和释放的7-乙基-10-羟基-喜树碱。使用非代谢区分析(non-compartmental analysis)(WinNonlin)完成药物代谢动力学分析。详见表3。
表3.药物代谢动力学数据
参数 化合物9 从化合物9中释放 的7-乙基-10-羟基 -喜树碱AUC(h＊μg/mL) 124,000 98.3 终末t1/2(hr) 19.3 14.2 Cmax(μg/mL) 20.500 13.2 CL(mL/hr/kg) 5.3 202 Vss(mL/kg) 131 3094
如图6中所示，7-乙基-10-羟基喜树碱的聚乙二醇化产生更长周期的半衰期和对于天然药物7-乙基-10-羟基喜树碱的高暴露(exposure).观察到4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)缀合物的肝肠循环.PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)在小鼠中的药物代谢动力学特性是双相性的，在起始2小时期间表现出快速血浆分布相，在随后18-22小时表现出对于缀合物的终末消除半衰期，伴随地在18-26小时表现出对于7-乙基-10-羟基喜树碱的终末消除半衰期.
而且，在大鼠中研究了4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基-喜树碱)的药物代谢动力学特性。在大鼠中，使用的剂量水平为3、10和30mg/kg(相应于7-乙基-10-羟基喜树碱)。在大鼠中的药物代谢动力学特性与在小鼠中的一致。
在大鼠中，4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)表现出从循环中双相清除，在大鼠中消除半衰期为12-18小时。从4臂PEG-Gly-7-乙基-10-羟基喜树碱缀合物中释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的表观消除半衰期为21-22小时。在大鼠中，最大血浆浓度(Cmax)和曲线下面积(AUC)以剂量依赖的方式增加。在小鼠或大鼠中从4臂PEG-Gly缀合物中释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的表观半衰期明显比报道的从CPT-11中释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的表观半衰期更长，且从4臂PEG-Gly-(7-乙基-10-羟基喜树碱)中释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的暴露明显比报道的从CPT-11中释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的暴露更高。在大鼠中，母体化合物的清除率为0.35mL/hr/kg。估算的母体化合物的稳态分布体积(Vss)为5.49mL/kg。在大鼠中，释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的清除率为131mL/hr/kg。在大鼠中，估算的释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的Vss为2384mL/kg。在小鼠和大鼠中观察到释放的7-乙基-10-羟基喜树碱的肝肠循环。
实施例14.体内数据-在Raji人Burkitt’s淋巴瘤异种移植的小鼠模型中的效果
在Raji Burkitt’s淋巴瘤异种移植的小鼠中，检测实施例7的化合物9的抗肿瘤效果。通过静脉注射2.5x 106人Burkitt’s淋巴瘤细胞(Raji)，在SCIDCB 17小鼠中建立散布的异种移植肿瘤。然后将小鼠随机分到各个检测组(每组10只小鼠)。在使用化合物9治疗组中，在第1天以单剂量静脉注射30mg/kg体重的化合物9。在用CPT-11治疗的小鼠中，注射60mg/kg体重的CPT-11。注射细胞1天后开始治疗。
在多剂量给药方案中，静脉注射10mg/kg化合物9和40mg/kg的CPT-11，每组q2d x 5。对照组使用盐水。
在所有情况中，给药的化合物9的量均是基于7-乙基-10-羟基喜树碱的量，而不是给药的聚合物缀合物的量。
每天监测动物的任何疾病信号、一般行为的变化和存活。也监测体重。处死表现出开放性坏死损伤的带有肿瘤的小鼠。也人性化的处死体重减轻超过20％的小鼠。对于所有的治疗组，监测小鼠的肿瘤生长和存活。研究后，所有小鼠通过吸入CO2安乐死。治愈率的结果和延长寿命(ILS)的结果见于表4。
表4.治疗效果
结果表明，在单剂量治疗中用化合物9治疗的小鼠具有50％的治愈率。在多剂量治疗中，用化合物9治疗的小鼠表现出90％的治愈率。在单剂量或多剂量治疗中均没有小鼠用CPT-11治愈。对于实施例的目的，“治愈”应理解为治疗完成后总共观察100天没有观察到任何肿瘤信号。
该结果表明本文所述的化合物具有治疗患有非霍奇金氏淋巴瘤(如Burkitt’s淋巴瘤)的患者的用途。该结果也表示本文所述的化合物能够替代基于CPT-11的治疗。
实施例15.体内数据-在Daudi人Burkitt’s淋巴瘤异种移植的小鼠模型中的效果
还在Daudi Burkitt’s淋巴瘤异种移植的小鼠中检测化合物9的抗肿瘤效果。通过静脉注射2.5x 106人Burkitt’s淋巴瘤细胞(Daudi)，在SCID CB17小鼠中建立散布的异种移植肿瘤。然后将小鼠随机分到各个检测组(每组10只小鼠)。注射肿瘤细胞后1天开始早期处理治疗(early treatment)。注射肿瘤细胞后7天开始晚期治疗(delayed treatment)。
在用化合物9的治疗组中，在第1天(早期治疗)或第7天(晚期治疗)以单剂量静脉注射30mg/kg体重的化合物9。在用CPT-11治疗的小鼠中，注射60mg/kg体重的CPT-11。对照组小鼠给药盐水。
每天监测动物的任何疾病信号、一般行为的变化和存活。还监测体重。处死表现出开放性坏死损伤的带有肿瘤的小鼠。也人性化的处死体重减轻超过20％的小鼠。对于所有的治疗组，监测小鼠的肿瘤生长和存活。研究后，所有小鼠通过吸入CO2安乐死。治愈率的结果和延长寿命(ILS)的结果见于表5。
表5.治疗效果
在单剂量早期治疗组中，用化合物9治疗的小鼠具有100％治愈率。在晚期单剂量治疗中，用化合物9治疗的小鼠也表现出90％治愈率。用CPT-11治疗的小鼠没有治愈。该结果表明本文所述的化合物具有在非霍奇金氏淋巴瘤的各种阶段治疗患有非霍奇金氏淋巴瘤的患者的用途。