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1、(10)申请公布号 CN 103361360 A (43)申请公布日 2013.10.23 CN 103361360 A *CN103361360A* (21)申请号 201210082933.0 (22)申请日 2012.03.26 C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) (71)申请人 兰州大学 地址 730000 甘肃省兰州市天水路 222 号 (72)发明人 安黎哲 韩艳 李争艳 徐世健 向云 张华 盛红梅 陈书燕 何文亮 李田 (54) 发明名称 一种高山离子芥铁转运蛋白基因 CbIRT 及其 编码产物的氨基酸序列 (57) 摘要 本发明提供。
2、了一种高山离子芥铁转运蛋白基 因 CbIRT、 它具有 SEQ ID NO ： 1 所示的碱基序列。 本发明还提供了一种高山离子芥铁转运蛋白基因 CbIRT 的编码产物 CbIRT， 它具有 SEQ ID NO ： 2 所 示的氨基酸序列。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103361360 A CN 103361360 A *CN103361360A* 1/1 页 2 1.一种高山离子芥铁转运蛋白基因。
3、CbIRT， 其特征在于 ： 其核苷酸序列如SEQ ID NO ： 1 所示。 2.一种由权利要求1所述的基因CbIRT编码的蛋白质CbIRT， 其特征在于 ： 其氨基酸序 列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 权 利 要 求 书 CN 103361360 A 2 1/3 页 3 一种高山离子芥铁转运蛋白基因CbIRT及其编码产物的氨 基酸序列 技术领域 0001 本发明涉及植物基因工程领域， 尤其涉及一种高山离子芥铁转运蛋白CbIRT基因 及其编码产物的氨基酸序列。 背景技术 0002 矿质营养对植物生长和发育具有极其重要的影响。在植物所有的必需元素中， 铁 的氧化还原特性赋予它在多种酶。
4、中起着重要的作用。虽然铁在地壳中含量很丰富， 但是土 壤中的铁几乎全部都是以氧化形式 Fe（） 存在， 因此， 植物需要采用有效机制从土壤中获 取铁。铁转运蛋白 （IRT） 是属于金属离子转运家族 -ZIP 家族的成员， 这类蛋白质拥有类似 的跨膜结构、 保守序列和识别序列。在拟南芥中， IRT1 的表达在转录水平和蛋白质水平上 均受调控。 0003 高山离子芥 （Chorispora bungeana） 是十字花科离子芥属多年生植物， 分布在高 海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、 高盐碱、 空气稀薄、 辐射 强、 劲风。高山离子芥在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓，。
5、 该地区海拔 3600 3900 m。年平均气温在 -5 -7 之间， 6 8 月平均气温为 3.6 ， 气温日差较大， 是一种伴 随反复冻融的冰冻环境。并且处于迎风坡， 流石碓中砾石保水性差， 时常造成干旱胁迫。高 山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征， 为了耐受长期低温、 高盐碱、 强紫外、 大风和生理干旱， 适应这些不利的环境条件， 势必通过表达抗性基因来维持自身的 生理代谢和生长发育， 以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。由于高山离子芥处于极端环 境 （高盐碱、 低温、 高辐射等） ， 积累了适应极端胁迫的有益突变， 所以克隆和研究高山离子 芥铁转运蛋白基因CbIRT将会。
6、扩大铁转运蛋白基因资源， 从而为利用高山离子芥的相关基 因构建转基因植物提供了物质基础。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种高山离子芥铁转运蛋白基因CbIRT。鉴于铁转运蛋白的 研究对提高植物的生长、 发育和抗逆性有重要的意义， 该基因的获得和研究将会扩大铁转 运蛋白基因资源， 从而为利用高山离子芥的相关基因构建转基因植物提供了物质基础。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种高山离子芥铁转运蛋白 CbIRT。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明采用如下技术方案 ： 本发明通过 RACE 法扩增了 5 和 3 非翻译区及目的片段。所述铁转运蛋白基因CbIRT 具有SEQ ID 。
7、NO:1所示的核苷酸序列， 其中， 列表中的SEQ ID NO ： 1由1290个碱基组成， 包 含一个 1035 个碱基的开放阅读框 （ORF） ， 起始密码子 A 前面有 49 个碱基长的 5 非翻译区， 编码区后面有 206 个碱基包含 poly（A） 的 3 非翻译区。该基因编码蛋白包括 344 个氨基 酸， 氨基酸为 36.68 kDa， 等电点为 6.43， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0007 通过高山离子芥铁转运蛋白与其他植物铁转运蛋白序列的多重比对和分析发现 说 明 书 CN 103361360 A 3 2/3 页 4 高山离子芥的CbIRT与其他植物。
8、的 IRT 在蛋白水平上有较高的相似性 （60%-89%）（如图 1） 。 0008 本发明对不同铁浓度和温度诱导CbIRT基因进行了鉴定。结果显示 （图 3） ， 在 100 M Fe、 200 M Fe 和 500 M Fe 浓度下CbIRT的表达呈现相同的而变化趋势， 随着时间表 达量都在逐渐增高， 到 36 h 时， 前两个 Fe 浓度下CbIRT的表达量分别达到对照水平的 2.2 和 1.8 倍。在 500 M Fe 浓度下 IRT 的表达量呈现递减的趋势， 36h 内表达量都低于对照水 平。实验结果表明， 在一定浓度铁离子环境中，CbIRT会发生诱导表达， 说明CbIRT与高山 离。
9、子芥的铁离子耐受有关， 可能在植株抵御不利的高铁环境过程中起到重要的作用。 附图说明 0009 图 1 高山离子芥铁转运蛋白基因CbIRT氨基酸序列同源性比对。 0010 图 2 高山离子芥铁转运蛋白基因CbIRT进化关系分析 图 3 高山离子芥铁转运蛋白基因在不同浓度铁离子处理下表达差异 具体实施方式 0011 在本发明的下述实施例中， 所用的实验材料为高山离子芥 （Chrisporabungeana) ( 西部植物种质资源库数据平台） 。 0012 实施例 1 高山离子铁转运蛋白基因CbIRT序列的克隆方法 采用 Trizol 法得到了高质量、 符合作为反转录模板要求的高山离子芥总 RNA。
10、。根据 GeneBank 中公布的植物铁转运蛋白基因的序列设计兼并引物扩增 CDS 的保守区 （B=T+G+C ； Y =T +C ； D =A +T+G ； N = A+ C+G +T ； R =A +G） ， 得到 487 bp 的目的片段。根据第一次克 隆片段的测序结果和序列比对结果， 以拟南芥的铁转运蛋白基因为模板设计了 P3 和 P4 引 物。 以P3和FED131为引物进行扩增得到一条明显的440 bp的目的条带。 另一端以FEU204 和 P4 引物扩增得到 544 bp 的目的条带。将三次 PCR 产物测序结果进行拼接， 得到完整的 CDS 序列。所述铁转运蛋白基因CbIRT具。
11、有 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列， 其中， 列表中 的 SEQ ID NO ： 1 由 1290 个碱基组成， 包含一个 1035 个碱基的开放阅读框 （ORF） ， 起始密码 子 A 前面有 49 个碱基长的 5 非翻译区， 编码区后面有 206 个碱基包含 poly（A） 的 3 非 翻译区。该基因编码蛋白包括 344 个氨基酸， 氨基酸为 36.68 kDa， 等电点为 6.43， 其氨基 酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0013 CDS 的保守区扩增引物 ： P1 ： 5-CCBGAYTCDTTYGANATGTT-3 P2 ： 5-CCCATBCCTTCRAA。
12、CATTTGRTG-3 Race 引物 ： P3 ： 5-ATGGCTTCAAATTCAGCACTTCTCA-3 FED131 ： 5-GGCTCGTGGCCATAGAATCGATGAAT-3 FEU204 ： 5-ATGGCCCCGCGAATGATGTGACGTT-3 P4 ： 5-TTAAGCCCAT1 rrGGCGATAATCGACAT-3 通过高山离子芥铁转运蛋白与其他植物铁转运蛋白序列的多重比对和分析发现高山 离子芥的CbIRT与其他植物的IRT在蛋白水平上有较高的相似性 （60%-89%） （图 1） 。从 说 明 书 CN 103361360 A 4 3/3 页 5 比对结果看，。
13、 有三大块区域相似性极高， 分别是这类蛋白的跨膜结构域， 保守序列和识别序 列。 其中黑色背景表示相同的氨基酸， 不同的氨基酸用白色背景表示。 红色区域表示有75% 以上的保守性， 绿色区域代表 50% 以上的保守性。相同的氨基酸序列和保守的结构域表明 得到了编码相应的铁转运蛋白的 cDNA 克隆。 0014 通过将从高山离子芥中得到的全长 1290 bp 的CbIRT序列用 DNAMAN 软件与目前 在 NCBI 上仅公布的八个物种 （分别是拟南芥， 豌豆， 番茄， 遏蓝菜， 小金海棠， 水稻， 烟草和 黄瓜） 的IRT序列构建系统进化树分析表明，CbIRT包含一个 1035 bp 的开放阅。
14、读框 （ORF） ， 起始密码子 A 前面有 49 bp 长的 5 非翻译区， 编码区后面有 206 bp 包含 poly（A） 的 3 非翻译区， 编码 344 个氨基酸的蛋白。 0015 通过用 http:/www.cbs.dtu.dk 站点的 TMHMM Serverv.2.0 服务器分析蛋白的 跨膜结构， 推测CbIRT蛋白为一种膜蛋白， 有8个跨膜结构域， 这和拟南芥的结构很相似。 系 统树分析表明 （如图 2） ， 高山离子芥CbIRT， 拟南芥 AtIRT1 和遏蓝菜TcIRT-G的遗传距离最 短形成一族， 与二者的亲缘关系最近， 分别具有87.4%和86.5%的同源性。 与拟南。
15、芥AtIRT2 同源性稍差， 为 72.1%。与水稻 OsIRT1 亲缘关系最差， 为 54.5%， 从图 2 也可以看出与水稻 的分歧年代最久远， 这也暗示二者在功能上可能存在较大的差异， 水稻属于单子叶植物， 在 转运铁的机制上和高山离子芥必然有较大差异。高山离子芥与其他物种的 IRT 序列在进化 上来自共同的祖先， 也表明了植物中铁运转蛋白拥有共同的进化起源。 0016 实施例 2 高山离子芥铁转运蛋白基因CbIRT功能初步鉴定 采用不同铁离子浓度 （100 M， 200 M 和 500 M） 处理高山离子芥。分别测定 12 h， 24 h， 36 h 不同处理下的高山离子芥中CbIRT。
16、基因的表达量。测定结果显示 （图 3） ， 在 Fe 浓度 为 100 M 和 200 M 处理下，CbIRT的表达呈现相同的而变化趋势， 随着时间表达量都在逐 渐增高， 到 36 h 时， 前两个 Fe 浓度下CbIRT的表达量分别达到对照水平的 2.2 和 1.8 倍。 在 500 M Fe 浓度下CbIRT的表达量呈现递减的趋势， 36 h 内表达量都低于对照水平。实 验结果表明， 在一定浓度铁离子环境中，CbIRT会发生诱导表达， 说明CbIRT与高山离子芥 的铁离子耐受有关， 可能在植株抵御不利的高铁环境过程中起到重要的作用。 说 明 书 CN 103361360 A 5 1/3 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 103361360 A 6 2/3 页 7 0003 序 列 表 CN 103361360 A 7 3/3 页 8 序 列 表 CN 103361360 A 8 1/2 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103361360 A 9 2/2 页 10 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103361360 A 10 。