感染性丙型肝炎病毒高生产HCV突变体及其应用.pdf

本发明的目的在于提供：在细胞培养系统中显示出病毒高生产能力的HCV株。本发明提供核酸，该核酸编码包含1个以上的氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白，当以序列表的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为基准时，上述前体多聚蛋白中至少第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。

权利要求书
1.   核酸，该核酸包含编码含有1个以上的氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的序列，其中，以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，上述前体多聚蛋白中至少第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。

2.   权利要求1所述的核酸，其中，该核酸包含丙型肝炎病毒JFH1株的基因组的5'非翻译区和3'非翻译区。

3.   权利要求1或2所述的核酸，其中，上述前体多聚蛋白为选自以下(a)～(f)的前体多聚蛋白：
(a) 前体多聚蛋白，其中，以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第297位的酪氨酸被取代成组氨酸、第330位的丙氨酸被取代成苏氨酸、第395位的丝氨酸被取代成脯氨酸、第417位的天冬酰胺被取代成丝氨酸、第483位的天冬氨酸被取代成甘氨酸、第501位的丙氨酸被取代成苏氨酸、第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸、第931位的谷氨酰胺被取代成精氨酸、而且第961位的丝氨酸被取代成丙氨酸；
(b) 前体多聚蛋白，其中，以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、而且第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；
(c) 前体多聚蛋白，其中，以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、而且第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；
(d) 前体多聚蛋白，其中，以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、而且第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；
(e) 前体多聚蛋白，其中，以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、而且第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；
(f) 前体多聚蛋白，其中，以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，只有第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。

4.   权利要求2所述的核酸，其中，该核酸包含序列表的SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。

5.   权利要求1～3中任一项所述的核酸，其中，编码报道蛋白的核酸被插入编码上述前体多聚蛋白的NS5A蛋白的区内。

6.   权利要求5所述的核酸，其中，上述报道蛋白被整合到以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时位于第2394位～第2397位的氨基酸序列中并以融合蛋白的形式翻译。

7.   权利要求6所述的核酸，其中，该核酸由序列表的SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列组成。

8.   丙型肝炎病毒颗粒，其中，该丙型肝炎病毒颗粒包含权利要求1～4中任一项所述的核酸。

9.   培养细胞，该培养细胞生产权利要求8所述的丙型肝炎病毒颗粒。

10.   丙型肝炎病毒疫苗，该丙型肝炎病毒疫苗是将权利要求8所述的丙型肝炎病毒颗粒灭活而得到的。

说明书感染性丙型肝炎病毒高生产HCV突变体及其应用
技术领域
本发明涉及感染性丙型肝炎病毒高生产HCV突变体、其基因组核酸和导入有其基因组核酸的细胞。本发明还涉及生产感染性HCV颗粒的方法、抗HCV药物的筛选方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus；HCV)于1989年由Choo等人发现并确定为非甲非乙型肝炎的病因病毒(非专利文献1)。在感染HCV形成慢性肝炎后，HCV仍持续感染向肝硬化、甚至肝癌转变。据报道，全球有约1亿7千万人的HCV感染者，日本就存在约200万人的HCV感染者。HCV的主要感染途径为血液感染。自从可以进行输血用血液的筛选后，新的感染者锐减，但仍然存在许多病毒携带者(virus carrier)。
目前，慢性丙型肝炎的治疗方法主要是给予PEG化干扰素、或者将PEG化干扰素与抗病毒药利巴韦林结合使用。迄今为止，人们将HCV分为6个基因型，在日本主要是基因型1b和2a的HCV感染病例。特别是基因型1b的HCV，其现实状况是：通过给予干扰素和利巴韦林并不能将病毒从体内完全去除、治疗效果并不充分(非专利文献2和3)。因此，人们希望开发以预防丙型肝炎发病或消除HCV病毒为目的的、新的抗病毒药或疫苗。
病毒疫苗的种类有：使用病毒蛋白作为抗原的成分疫苗、使用病毒颗粒作为抗原的疫苗、以及使用编码病毒蛋白的基因作为抗原的DNA疫苗。以病毒颗粒作为抗原的疫苗有：减毒活疫苗和灭活疫苗。制造以病毒颗粒作为抗原的疫苗时，必需有制造高纯度的病毒颗粒的系统，在该系统中必需有病毒颗粒的高生产培养系统。
丙型肝炎病毒(HCV)是具有约9.6 kb正链的单链RNA作为基因组的病毒。HCV的单链RNA基因组编码包含10种蛋白(核心蛋白、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的单链多聚蛋白(前体多聚蛋白(polyprotein precursor))。由HCV RNA基因组翻译的前体多聚蛋白被切成各个蛋白，发挥病毒蛋白的功能。
有人开发了利用培养细胞系统自主复制HCV RNA的复制子系统，并在多种HCV研究中使用。典型的亚基因组复制子为：将HCV基因组的结构蛋白区重组到耐药基因等标记基因中、并在其下游插入有EMCV (脑心肌炎病毒)的IRES的复制子。在导入有该亚基因组复制子RNA的培养细胞内确认到HCV RNA的复制(专利文献1)。通过研究HCV亚基因组复制子的复制，表明HCV基因组的遗传突变有时会显示出提高复制子的复制效率的效果，这种遗传突变被称作适应性突变(adaptive mutation) (专利文献1)。
有资料显示：来自基因型1b的Con1株的亚基因组复制子pFK‑I389neo/NS3‑39/wt (Con1/wt)的突变体、即在NS3‑NS5A区具有适应性突变的NK5.1株(Con1/NK5.1)与野生型Con1/wt相比具有约10倍的增殖能力(非专利文献4)。另一方面，在分析从重症肝炎患者中分离的、具有来自属于基因型2a的HCV的JFH1株的亚基因组复制子的复制子复制细胞中所含的复制子的核苷酸序列的论文(非专利文献5)中记载着：6个克隆中，有5个克隆虽然在各自的来自HCV基因组的区中确认到若干个突变，但在这些突变中并没有确认到共同的突变，而剩下的1个克隆是没有发生氨基酸突变的碱基突变，这表明：尽管JFH1株在Huh7细胞中没有适应性突变，但仍可增殖。
关于细胞培养系统中的HCV生产，Wakita等人研究表明：将来自JFH1株的全长基因组HCV复制子导入Huh7细胞中，可以生产感染性HCV颗粒(专利文献2和非专利文献6)。另外，Kaul等人报道了：JFH1株的NS5A蛋白的突变会带来较野生型JFH1株高约10倍的病毒生产量(非专利文献7)。
有报道称：在细胞培养系统中JFH1株的病毒颗粒生产能力为4.6×104FFU/mL (非专利文献8)，这与所报道的、在细胞培养系统中流感病毒的病毒颗粒生产能力为约4×109PFU/mL (非专利文献9)相比是非常低的。为了制造使用HCV颗粒作为抗原的疫苗，人们要求开发病毒颗粒生产能力更高的HCV株。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO 2004/104198；
专利文献2：国际公开WO 2005/080575；
非专利文献
非专利文献1：Choo等人, Science (1989) 244 (4902) 第359‑362页；
非专利文献2：Fried等人, N. Engl. J. Med. (2002) 第347卷, No.13 第975‑982页；
非专利文献3：Lusida等人, J. Clin. Microbiol. (2001) 39 (11) 第3858‑3864页；
非专利文献4：Krieger等人, J. Virol. (2001) 70: 4614‑4624；
非专利文献5：Kato等人, Gastroenterology (2003) 125: 1808‑1817；
非专利文献6：Wakita等人, Nat Med. (2005) 11(7) 第791‑796页；
非专利文献7：Kaul等人, J. Virol. (2007) 81(23) 第13168‑13179页；
非专利文献8：Zhong等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2005) 102 (26) 第9294‑9299页；
非专利文献9：Tree等人, Vaccine (2001) 19 (25‑26) 第3444‑3450页。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供：在细胞培养系统中显示出病毒高生产能力的HCV株。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现：若干个氨基酸突变会显著提高JFH1株的病毒生产能力，从而完成了本发明。
即，本发明包含下述[1]～[14]。
[1] 核酸，该核酸包含编码含有1个以上的氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的序列，当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，上述前体多聚蛋白中至少第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。
在优选的一个方案中，该核酸可以包含丙型肝炎病毒JFH1株的基因组的5'非翻译区和3'非翻译区。
[2] 上述[1]所述的核酸，其中，上述前体多聚蛋白为选自下述(a)～(f)的前体多聚蛋白：
(a)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第297位的酪氨酸被取代成组氨酸、第330位的丙氨酸被取代成苏氨酸、第395位的丝氨酸被取代成脯氨酸、第417位的天冬酰胺被取代成丝氨酸、第483位的天冬氨酸被取代成甘氨酸、第501位的丙氨酸被取代成苏氨酸、第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸、第931位的谷氨酰胺被取代成精氨酸、以及第961位的丝氨酸被取代成丙氨酸；
(b)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；
(c)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；
(d)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第786位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；
(e)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸被取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸被取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸被取代成精氨酸、第756位的缬氨酸被取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸；
(f)前体多聚蛋白，其中，当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，仅第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。
[3] 上述[2]所述的核酸，该核酸包含序列表的SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列。
[4] 上述[1]或[2]所述的核酸，其中，编码报道蛋白的核酸被插入在编码上述前体多聚蛋白的NS5A蛋白的区内。
[5] 上述[4]所述的核酸，其中，上述报道蛋白被整合到当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时位于第2394位～第2397位的氨基酸序列中，作为融合蛋白被翻译。
[6] 上述[5]所述的核酸，该核酸包含序列表的SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列。
[7] 丙型肝炎病毒颗粒，该病毒颗粒包含上述[1]～[3]所述的核酸。
[8] 培养细胞，该培养细胞生产上述[7]所述的丙型肝炎病毒颗粒。
[9] 丙型肝炎病毒疫苗，该疫苗是将上述[7]所述的丙型肝炎病毒颗粒灭活而得到的。
本发明还包含以下发明。
[10] 丙型肝炎病毒颗粒，该病毒颗粒包含上述[4]～[6]所述的核酸。
[11] 培养细胞，该培养细胞生产上述[10]所述的丙型肝炎病毒颗粒。
[12] 载体，该载体包含上述[1]～[6]中任一项所述的核酸。
[13] 筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法具备下述步骤：在受检物质的存在下，培养生产包含上述[4]或[6]所述的核酸的丙型肝炎病毒颗粒的培养细胞的步骤；以及检测所得培养物中的上述报道蛋白，当上述报道蛋白的表达量低时，判定为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性的步骤。
[14] 抗丙型肝炎病毒抗体，该抗体将上述[7]所述的丙型肝炎病毒颗粒识别为抗原。
发明效果
通过本发明，提供感染性HCV颗粒的高生产株。通过使用该感染性HCV颗粒的高生产株，可以提供高HCV生产系统。
附图说明
图1显示为了获得JFH1适应突变体而进行的实验流程。图中，“C”表示编码核心(core)蛋白的区、“E1”表示编码E1蛋白的区、“E2”表示编码E2蛋白的区、“p7”表示编码p7蛋白的区、“2”表示编码NS2蛋白的区、“3”表示编码NS3蛋白的区、“4A”表示编码NS4A蛋白的区、“4B”表示编码NS4B蛋白的区、“5A”表示编码NS5A蛋白的区、“5B”表示编码NS5B蛋白的区，另外，与C (核心)相邻的5'末端部分表示5'非翻译区，与5B (NS5B)相邻的3'末端部分表示3'非翻译区(图5、9、10和15中亦同)。
图2显示将JFH1病毒感染细胞继代培养2年而得到的JFH1适应突变体(JFH1a)的复制能力。
图3显示JFH1a和野生型JFH1wt的性状比较。纵轴为与未添加IFN‑α的对照进行比较的相对复制率(relative replication) (%)。“○”为JFH1wt的数据，“■”为JFH1a的数据。
图4显示通过解析JFH1a的6个克隆的序列发现的相对于野生型JFH1wt的氨基酸突变。图4中，在6个克隆中的2个以上的克隆中发现的氨基酸突变上注上“＊”。
图5是显示用于解析复制能力和感染性的野生型JFH1wt及其突变体的HCV全长基因组(前体多聚蛋白编码区和非翻译区)的结构和突变导入位点的概略图。进行了突变解析的区(限制酶AgeI‑SpeI片段)以灰色显示。突变导入位点以星号显示。
图6显示野生型JFH1wt及其突变体的感染性比较结果。WT表示JFH1wt、A/WT表示JFH1‑A/WT、B/WT表示JFH1‑B/WT、Mut5表示JFH1‑mut5 (本申请说明书和附图的其他部分亦同)。A：转染后的细胞内核心蛋白量的比较，B：释放到培养上清中的核心蛋白量的比较，C：培养上清的感染滴度的比较，D：比活性(相对比感染滴度。比活性＝(培养上清中的感染滴度)/(培养上清中的核心蛋白量))的比较。棒图A～C从左到右分别显示24小时后(24h)、48小时后(24h)、72小时后(24h)和96小时后(24h)的数据。
图7显示野生型JFH1wt及其突变体在长期培养(长期感染)中的感染滴度随时间的变化。＊：JFH1a、Δ：JFH1‑B/WT、×：JFH1‑Mut5、□：JFH1‑A/WT、◊：JFH1wt。
图8是显示野生型JFH1wt及其突变体在细胞感染的72小时后形成的转化灶(フォーカス，focus)的大小的照片。染色部分为转化灶。转化灶的大小表示感染的传播能力。A：JFH1‑A/WT，B：JFH1‑B/WT，C：JFH1a，D：JFH1‑Mut5，E：JFH1wt。
图9显示在JFH1‑B/WT的6个位置的氨基酸突变中仅1个位置的氨基酸突变恢复成野生型氨基酸的6种突变体的HCV全长基因组(前体多聚蛋白编码区和非翻译区)的结构图。星号显示保持JFH1‑B/WT的氨基酸突变的位点。
图10显示将在JFH1‑B/WT的6个位置见到的氨基酸突变各1个导入野生型JFH1wt中的6种突变体的HCV全长基因组(前体多聚蛋白编码区和非翻译区)的结构图。星号显示导入有来自JFH1‑B/WT的氨基酸突变的位点。
图11显示图9所示的突变体HCV (克隆)的感染滴度和病毒生产量。A：显示各突变体的培养上清中的感染滴度，这代表感染性病毒颗粒的细胞外释放水平。B：显示各突变体的释放到培养上清中的细胞外核心蛋白量。Ｃ：显示比活性(相对比感染滴度；比活性＝(培养上清中的感染滴度)/(培养上清中的核心蛋白量))，显示以WT的比活性为1时的值。31‑、74‑、451‑、756‑、786‑、862‑、451+、WT和B/WT分别表示31‑(A31V)、74‑(T74K)、451‑(R451G)、756‑(A756V)、786‑(A786V)、862‑(R862Q)、451+(G451R)、JFH1wt和JFH1‑B/WT (本申请说明书和附图的其他部分亦同)。
图12显示图10所示的突变体HCV (克隆)的感染滴度和病毒生产量。A：显示各突变体的培养上清中的感染滴度，这表示感染性病毒颗粒的细胞外释放水平。B：显示各突变体的释放到培养上清中的细胞外核心蛋白量。Ｃ：显示比活性(相对比感染滴度；比活性＝(培养上清中的感染滴度)/(培养上清中的核心蛋白量))，显示以WT的比活性为1时的值。31+、74+、451+、756+、786+、862+、WT和B/WT分别表示31+(V31A)、74+(K74T)、451+(G451R)、756+(V756A)、786+(V786A)、862+(Q862R)、JFH1wt和JFH1‑B/WT (本申请说明书和附图的其他部分亦同)。
图13显示图9所示的突变体HCV (克隆)在长期培养(长期感染)中其细胞外核心蛋白量和感染滴度随时间的变化。这还显示各克隆在长期感染中的增殖曲线。A：显示各突变体的培养上清中的细胞外核心蛋白量。B：显示各突变体的培养上清中的感染滴度。
图14显示图10所示的突变体HCV (克隆)在长期培养(长期感染)中其细胞外核心蛋白量和感染滴度随时间的变化。这还显示各克隆在长期感染中的增殖曲线。A：显示各突变体的培养上清中的细胞外核心蛋白量。B：显示各突变体的培养上清中的感染滴度。
图15显示在全长基因组HCV序列中整合有报道基因的复制子的结构图。报道基因(Rluc)被插入在复制子的前体多聚蛋白编码区(核心~NS5B)内的第2394位氨基酸与第2395位氨基酸之间。
图16显示整合有报道基因的野生型JFH1wt‑Rluc、突变体JFH1‑A/WT‑Rlu和JFH1‑B/WT‑Rluc的培养上清中的感染滴度。图中，WT表示JFH1wt，WT‑Rluc、A/WT‑Rluc和B/WT‑Rluc表示在JFH1wt、JFH1‑A/WT和JFH1‑B/WT中分别整合有Rluc基因的JFH1wt‑Rluc、JFH1‑A/WT‑Rluc和JFH1‑B/WT‑Rluc (图18中亦同)。
图17显示使JFH‑A/WT‑Rluc (图17A)和JFH‑B/WT‑Rluc (图17B)以100 FFU、50 FFU、25 FFU、12 FFU、6 FFU、3 FFU和0 FFU感染Huh7.5.1细胞，并于72小时后测定萤光素酶活性的结果、以及检测依赖于病毒量的萤光素酶活性。
图18显示使用JFH1‑A/WT‑Rluc和JFH1‑B/WT‑Rluc病毒的培养细胞感染增殖系统研究干扰素(IFN)的抗HCV作用的结果。A的纵轴显示以未添加IFN‑α的萤光素酶活性为100％时的抑制率(%)，B的纵轴显示以未添加IFN‑α的感染滴度为100％时的感染抑制率(%)。IFN‑α的用量(浓度)从左起依次为100 U/mL (白棒)、20、4、1、0 U/mL。A：通过萤光素酶分析得到的、干扰素存在下的萤光素酶活性(RLU)的抑制率。B：干扰素存在下的感染滴度(FFU/mL)的抑制率。
具体实施方式
本发明人等通过用JFH1株的HCV全长复制子复制系统进行长达2年的培养，从这些培养细胞中筛选病毒颗粒的增殖能力有所提高的适应突变体，发现了JFH1病毒高生产株，并制作了带有表达报道基因的全长HCV基因组的高感染性病毒颗粒，从而完成了本发明。
本发明涉及高生产性HCV JFH1突变体，该HCV JFH1突变体能够从包含HCV的全长基因组序列、持续复制全长基因组序列、并产生感染性病毒颗粒的Huh7细胞中分离。
本发明可以采用该领域技术范围内的分子生物学和病毒学的现有技术来实施。上述技术在文献中已作了充分说明。例如参照Sambrook等人、Molecular Cloning：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (第3版, 2001)和Mahy等人、Virology：a practical approach (1985，IRL PRESS)。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，其全部内容均通过引用而援用在本说明书中。
(1) 来自HCV JFH1基因组序列的突变体核酸
本发明涉及核酸，该核酸具有HCV JFH1突变体病毒的基因组序列，所述HCV JFH1突变体在其基因组中导入有使其病毒颗粒生产能力显著提高的适应性突变。本发明的核酸优选包含HCV全长基因组序列。
更具体而言，本发明的核酸是包含编码在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白(优选包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的前体多聚蛋白)中导入有氨基酸突变的前体多聚蛋白的序列的核酸；进一步具体而言，本发明的核酸是包含编码在前体多聚蛋白的从核心到NS2的区包含1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的序列的核酸。
本发明的核酸所编码的前体多聚蛋白包含HCV的结构蛋白和非结构蛋白。HCV的结构蛋白是指核心、E1、E2和p7，它们构成HCV的病毒颗粒部分。核心是指核心蛋白，E1和E2是包膜蛋白，p7是形成在宿主细胞膜上发挥作用的离子通道的蛋白。HCV的非结构蛋白是指NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，它们是具有参与病毒基因组的复制或HCV蛋白加工的活性的酶蛋白。已知HCV中有各种基因型，但已知各种基因型的HCV的基因组具有同样的基因结构(例如可参照图1)。由本发明的核酸编码的前体多聚蛋白优选从N末端到C末端依次包含核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白部分。由本发明的核酸编码的前体多聚蛋白可以进一步包含选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白。
本发明的核酸中所含的全长基因组序列在5'末端包含5'非翻译区、在其3'侧包含前体多聚蛋白编码区、在其3'侧以及3'末端包含3'非翻译区。全长基因组序列可以是从5'侧到3'侧依次包含5'非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3'非翻译区的序列。
HCV的5'非翻译区(还称作5'UTR或5'NTR)是提供用于蛋白翻译的内部核糖体结合位点(IRES)和复制所必需的元件的、从全长HCV基因组的N末端起约340个核苷酸的区域。
HCV的3'非翻译区(还称作3'UTR或3'NTR)具有辅助HCV复制的功能，除包含polyU区外，还包含约100个核苷酸的附加区(追加領域)。
在本发明中，“复制子RNA”是指在细胞内具有自身复制(自主复制)能力的RNA。由于被导入细胞中的复制子RNA进行自身复制、且其RNA拷贝在细胞分裂后被分配到子细胞中，所以如果使用复制子RNA则可以将外来基因稳定地导入到细胞中。当本发明的核酸是包含在5'末端含有5'非翻译区、在其3'侧含有前体多聚蛋白编码区、在其3'侧及3'末端含有3'非翻译区的全长基因组序列的RNA(全长基因组RNA)时，本发明的核酸是复制子RNA。
在本发明中，“核酸”包含RNA和DNA。在本说明书中，“蛋白编码区”、“编码蛋白的序列”是指编码预定蛋白的氨基酸序列、可以包含也可以不包含起始密码子和终止密码子的核苷酸序列。“前体多聚蛋白编码区”、“编码前体多聚蛋白的序列”也同样理解。
本说明书中，在核酸为RNA的情况下，引用序列表的SEQ ID NO来确定RNA的核苷酸序列或碱基时，该SEQ ID NO所示的核苷酸序列中的“T”(胸腺嘧啶)被读作“U”(尿嘧啶)。
本说明书中，“以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时第“Y”位的氨基酸”是指，在SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列中，以N末端的第1氨基酸(甲硫氨酸)作为第1位时，该氨基酸是位于第“Y”位的氨基酸残基、或者是在与SEQ ID NO: 2的序列比对的其他氨基酸序列中SEQ ID NO: 2的第“Y”位的氨基酸残基所对应的氨基酸。
本发明中，丙型肝炎病毒的JFH1株是指由Wakita等人从重症肝炎患者中分离的、属于基因型2a的HCV株(例如WO 2005/080575)。HCV的“基因型”是指由Simmonds等人按照国际分类进行分类的基因型。丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列优选为由GenBank Accession No. AB047639中公开的全长基因组序列编码的序列(SEQ ID NO: 2)。JFH1株的全长基因组序列优选为GenBank Accession No. AB047639中公开的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)。
本发明的核酸的优选方式为：包含编码含有1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的序列的核酸，当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，上述1个以上氨基酸取代包含至少一个第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。即，本发明的核酸优选为：包含编码含有1个以上氨基酸取代的丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的序列的核酸，其特征在于：当以序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，上述前体多聚蛋白的第862位的谷氨酰胺被取代成精氨酸。该核酸更优选：在5'末端包含5'非翻译区、在其3'侧包含前体多聚蛋白编码区、在其3'侧及3'末端包含3'非翻译区。该前体多聚蛋白编码序列可以进一步包含编码选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白的核苷酸序列。
导入到该前体多聚蛋白中的1个以上的氨基酸取代至少包含上述第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸(Q862R)，还优选进一步附加包含下述(1)‑(13)中的1个以上的氨基酸取代：
(1) 第31位的缬氨酸取代成丙氨酸(V31A)、
(2) 第74位的赖氨酸取代成苏氨酸(K74T)、
(3) 第297位的酪氨酸取代成组氨酸(Y297H)、
(4) 第330位的丙氨酸取代成苏氨酸(A330T)、
(5) 第395位的丝氨酸取代成脯氨酸(S395P)、
(6) 第417位的天冬酰胺取代成丝氨酸(N417S)、
(7) 第451位的甘氨酸取代成精氨酸(G451R)、
(8) 第483位的天冬氨酸取代成甘氨酸(D483G)、
(9) 第501位的丙氨酸取代成苏氨酸(A501T)、
(10) 第756位的缬氨酸取代成丙氨酸(V756A)、
(11) 第786位的缬氨酸取代成丙氨酸(V786A)、
(12) 第931位的谷氨酰胺取代成精氨酸(Q931R)、以及
(13) 第961位的丝氨酸取代成丙氨酸(S961A)。
在本说明书中，例如氨基酸突变Q862R是指第862位的氨基酸残基由Q (谷氨酰胺)取代成R (精氨酸)的突变。其他表示氨基酸突变的符号也同样理解。需要说明的是，这里氨基酸按照生物学领域中通常使用的氨基酸的单字母符号(Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition, 1989)来记载。
在本说明书中，氨基酸或氨基酸残基以生物学领域通常使用的氨基酸的单字母符号或三字母符号来记载，这也包含进行了氢氧化、糖链加成、硫酸化等翻译后修饰的氨基酸。
如果使用本发明的核酸，则可以制作能够生产病毒颗粒生产能力已显著提高的JFH1突变体病毒的复制子RNA。
本发明核酸的优选例子有：包含编码前体多聚蛋白的序列的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第297位的酪氨酸取代成组氨酸、第330位的丙氨酸取代成苏氨酸、第395位的丝氨酸取代成脯氨酸、第417位的天冬酰胺取代成丝氨酸、第483位的天冬氨酸取代成甘氨酸、第501位的丙氨酸取代成苏氨酸、第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸、第931位的谷氨酰胺取代成精氨酸、以及第961位的丝氨酸取代成丙氨酸。该核酸的优选例子见SEQ ID NO: 3。
本发明核酸的另一优选例子有：包含编码前体多聚蛋白的序列的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸取代成精氨酸、第756位的缬氨酸取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸取代成丙氨酸、以及第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。该核酸的优选例子见SEQ ID NO: 4。
本发明核酸的另一优选例子有：包含编码前体多聚蛋白的序列的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。该核酸的优选例子见SEQ ID NO: 5。
本发明核酸的另一优选例子有：包含编码前体多聚蛋白的序列的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸取代成精氨酸、第756位的缬氨酸取代成丙氨酸、第786位的缬氨酸取代成丙氨酸、第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。
本发明核酸的另一优选例子有：包含编码前体多聚蛋白的序列的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸取代成精氨酸、第786位的缬氨酸取代成丙氨酸、第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。
本发明核酸的另一优选例子有：包含编码前体多聚蛋白的序列的核酸，所述前体多聚蛋白在丙型肝炎病毒JFH1株的前体多聚蛋白的氨基酸序列(优选SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列)中导入有下述取代，即以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时，第31位的缬氨酸取代成丙氨酸、第74位的赖氨酸取代成苏氨酸、第451位的甘氨酸取代成精氨酸、第756位的缬氨酸取代成丙氨酸、第862位的谷氨酰胺取代成精氨酸。
为了使上述核酸发挥复制子RNA的作用，更优选在其5'末端包含5'非翻译区、在其3'侧包含前体多聚蛋白编码区、在其3'侧及3'末端包含3'非翻译区。
上述作为本发明的核酸的复制子RNA、或由该核酸制作的复制子RNA、特别是全长基因组复制子RNA (全长基因组HCV RNA)，与野生型JFH1株的复制子RNA相比具有显著提高的病毒生产能力。在本说明书中，病毒生产能力优选为培养细胞系统中的病毒颗粒生产能力(优选感染性病毒颗粒生产能力)。本发明的核酸或由该核酸制作的复制子RNA例如与野生型JFH1株的全长基因组复制子RNA相比，具有2倍以上、优选10倍以上、典型的是10倍~10,000倍、例如10倍~1,000倍的病毒生产能力。作为本发明的核酸的全长基因组复制子RNA与来自JFH1株的全长基因组复制子RNA相比，具有2倍以上、优选10倍以上的病毒生产能力，所述JFH1株编码SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的第2440位的缬氨酸被取代成亮氨酸的前体多聚蛋白。野生型JFH1株的全长基因组序列见SEQ ID NO: 1。SEQ ID NO: 2所示的序列是根据SEQ ID NO: 1所示的野生型JFH1株的全长基因组序列编码的前体多聚蛋白的氨基酸序列。
病毒生产能力可以通过测定培养上清的感染滴度来确定。感染滴度的测定可以按照任意的方法进行，但在本说明书中，以通过转化灶法测定的培养上清的感染滴度为基准。具体可以按照后述实施例中记载的方法确定感染滴度。
本发明的核酸或由该核酸制作的复制子RNA显示出高的病毒颗粒形成效率。该性质对用于病毒疫苗制造等所必需的病毒蛋白的大量生产也有利。该病毒颗粒形成效率还可以以算出的比活性(＝(培养上清中的感染滴度)/(培养上清中的核心蛋白量)；相对比感染滴度)的值为指标。具体可以按照后述实施例中所述的方法来确定比活性。
在本发明的核酸中，包含SEQ ID NO: 3～SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列的核酸(全长基因组复制子RNA)在病毒生产能力方面特别优异。另外，含有包含JFH1株的5'非翻译区、编码SEQ ID NO: 3～SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列所编码的突变型前体多聚蛋白的序列和JFH1株的3'非翻译区的全长基因组序列的核酸(全长基因组复制子RNA)也具有高的病毒生产能力。
本发明的核酸可以包含编码选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白的核苷酸序列、例如标记基因。标记基因包含：可以赋予细胞只选择表达该基因的细胞的选择性的选择标记基因(编码选择标记蛋白的核苷酸序列)和编码成为其基因表达指标的基因产物的报道基因(编码报道蛋白的核苷酸序列)。在本发明中，对优选的选择标记基因的例子没有限定，可以列举新霉素耐性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素耐性基因、吡啶硫胺素耐性基因、腺苷酰基转移酶基因、Zeocin耐性基因、潮霉素耐性基因、嘌呤霉素耐性基因等。本发明中，对优选的报道基因的例子没有限定，可以列举来自转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自大肠杆菌的β葡糖醛酸酶或β半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因、绿色萤光蛋白基因、来自水母的水母素(イクリオン，aequorin)基因、分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因等。
本发明的核酸在前体多聚蛋白编码区内可以包含编码选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白的核苷酸序列、例如标记基因。这种情况下，对插入在前体多聚蛋白内的选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白没有限定，但优选报道蛋白，更优选萤光素酶，进一步优选海肾萤光素酶(ウミシイタケルシフェラーゼ)。编码海肾萤光素酶的基因的核苷酸序列的例子见SEQ ID NO: 9。
以该海肾萤光素酶为代表的选择标记蛋白或报道蛋白等异种蛋白(优选报道蛋白、更优选萤光素酶)被插入前体多聚蛋白内时，优选插入在以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时位于第2394位～第2397位的氨基酸序列中。具体而言，异种蛋白被插入在前体多聚蛋白内时，可以插入在以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时的第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间、第2395位氨基酸残基与第2396位氨基酸残基之间、或第2396位氨基酸残基与第2397位氨基酸残基之间的任一处。需要说明的是，在本发明中，“异种蛋白被插入(或整合)在以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时位于第2394位～第2397位的氨基酸序列中”是指，不管编码该异种蛋白的DNA片段的实际插入位点如何，在插入有包含异种蛋白的氨基酸序列的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的比对中，包含异种蛋白的氨基酸序列被附加在包含以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时位于第2394位～第2397位的氨基酸残基的序列中的任一个位置上。例如，用XhoI切断包含编码异种蛋白的ORF、且在其5'侧及3'侧包含XhoI识别位点(5'‑CTCGAG‑3')的DNA片段、并将其导入编码SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的DNA的AbsI识别位点(5'‑CCTCGAGG‑3')中时，包含以相当于XhoI识别位点的氨基酸序列Leu‑Glu开始的氨基酸序列的异种蛋白被插入在相当于AbsI识别位点的SEQ ID NO: 2的第2394位～第2397位的氨基酸序列(Pro‑Leu‑Glu‑Gly)内。此时异种蛋白的实际插入位点可以是SEQ ID NO: 2的第2394位氨基酸残基(Pro)与第2395位氨基酸残基(Leu)之间的位置，但也可以规定为第2395位氨基酸残基(Leu)与第2396位氨基酸残基(Glu)之间、或第2396位氨基酸残基(Glu)与第2397位氨基酸残基(Gly)之间的位置，严密特定实际的插入位置并不合适。但在这种情况下，由于已经明确在SEQ ID NO: 2的第2394位～第2397位的氨基酸序列中的任一位置存在包含异种蛋白的附加的氨基酸序列，因此该异种蛋白也被插入(或整合)在相同的第2394位～第2397位的氨基酸序列中。
具有包含编码如此操作插入有异种蛋白的前体多聚蛋白的序列的全长基因组核酸的病毒颗粒与野生型JFH1株的病毒颗粒相比，感染性(感染滴度)高达5倍以上、优选10倍或10倍以上。编码在以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时位于第2394位～第2397位的氨基酸序列中(还可以规定为第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间)插入有异种蛋白的前体多聚蛋白的HCV全长基因组序列的优选例子有：SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7。
本发明的核酸还优选进一步包含IRES序列。本发明中的“IRES序列”是指可以使核糖体结合在RNA内部并开始翻译的内部核糖体结合位点。以下，对本发明中的IRES序列的优选例子没有限定，可以列举EMCV IRES (脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点)、FMDV IRES、HCV IRES等。当本发明的核酸包含IRES序列时，优选在HCV基因组序列的5'非翻译区(5'NTR)与编码核心蛋白的核酸序列之间依次插入报道基因(编码报道蛋白的核酸序列)和IRES序列。
本发明的核酸可以通过采用本领域技术人员所公知的基因工程学技术将上述引起1个以上氨基酸取代的碱基取代导入包含编码HCV JFH1株的前体多聚蛋白的序列的核酸中来制作。对包含编码HCV JFH1株的前体多聚蛋白的序列的核酸没有限定，例如可以是包含SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的DNA、或包含该DNA的重组载体(例如重组质粒载体)。
关于上述引起氨基酸取代的碱基取代，当根据在生物学领域周知的遗传密码表比较取代部位的氨基酸密码子与取代前的氨基酸密码子时可以容易地进行确定。
本发明还提供包含本发明的核酸的载体。包含本发明的核酸的载体可以是重组载体，但更优选为表达载体。本发明的核酸优选插入在载体中的转录启动子的下游。本发明的核酸通过与转录启动子进行功能性连接，在转录启动子的控制下被整合。对转录启动子没有限定，可以列举T7启动子、SP6启动子、T3启动子等，但特别优选T7启动子。对载体没有限定，可以使用pUC19 (TaKaRa公司)、pBR322 (TaKaRa公司)、pGEM‑T、pGEM‑T Easy、pGEM‑3Z (均由Promega公司制)、pSP72 (Promega公司)、pCRII (Invitrogen公司)、pT7Blue (Novagen公司)等。来自表达载体的HCV复制子RNA的合成例如可以使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)等来进行。制作的HCV复制子RNA可以利用本领域技术人员所周知的RNA提取法或纯化法等进行提取、纯化。
(2) 生产感染性HCV颗粒的细胞的制作
本发明还涉及使用(1)中记载的本发明的突变体核酸生产的HCV颗粒。该HCV颗粒优选为感染性病毒颗粒。
本发明的HCV颗粒(优选感染性HCV颗粒)可以通过将包含上述(1)的核酸的全长基因组RNA导入到细胞中进行培养来制作。即，本发明还提供包含上述(1)中记载的本发明的核酸的HCV颗粒。
导入RNA的细胞只要是允许HCV颗粒形成的细胞即可，但优选为培养细胞。上述细胞的例子有：Huh7细胞、HepG2细胞、IMY‑N9细胞、HeLa细胞、293细胞等或它们的衍生株等培养细胞。更优选的例子有：Huh7细胞等来自肝脏的培养细胞，进一步优选Huh7细胞和Huh7细胞的衍生株(例如Huh7.5细胞、Huh7.5.1细胞等)。另外，还可以列举使CD81基因和/或Claudin1基因在Huh7细胞、HepG2细胞、IMY‑N9细胞、HeLa细胞或293细胞中表达的细胞，其中优选使用Huh7细胞或Huh7细胞的衍生株。在本发明中，“衍生株”是指由该细胞衍生的细胞株，通常是指该细胞的亚克隆株。
作为将RNA导入到细胞中的方法，可以使用公知的任意方法。上述方法的例子有：磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、微量注射法、电穿孔法，但优选脂质转染法和电穿孔法，进一步优选电穿孔法。
细胞的生产病毒颗粒的能力还可以使用抗释放到培养液中的构成HCV颗粒的要素(例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白)的抗体来测定。另外，通过使用了特异性引物的RT‑PCR法扩增、测定培养液中的HCV颗粒所含有的HCV基因组RNA，也可以间接检测HCV颗粒的存在。
所制作的病毒是否具有感染能力，这可如下判断：培养通过上述方法导入有HCV RNA的细胞，将所得上清添加在HCV容许性细胞(例如Huh7)中，例如在48小时后将细胞用抗核心抗体进行免疫染色，数出感染细胞数，或者使细胞提取物在SDS‑聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，利用蛋白质印迹检测核心(core)蛋白，即可判断是否具有感染能力。需要说明的是，此处也将由导入有JFH1株的基因组RNA的细胞生成的感染性HCV颗粒称作JFH1病毒。
通过将如上制作的、导入有全长基因组RNA的细胞进行定期继代培养，可以得到持续产生感染性HCV颗粒的细胞。这种细胞株可以长期培养。持续产生感染性HCV颗粒的、可以长期培养的细胞在可以持续生产HCV疫苗所必需的HCV颗粒方面优异。
本发明还涉及生产如上制作的JFH1突变体的HCV颗粒的细胞、优选培养细胞。
(3) 适应性突变的解析
通过将由上述(2)制作的、持续生产HCV颗粒的细胞株继续进行继代培养，在HCV基因组中引起适应性突变，期待HCV颗粒生产显著提高。继代培养通常要进行十几次(1～2个月)，但在本发明中，由于适应性突变的导入，继续继代培养1年、进一步优选2年。
需要说明的是，分析表明：利用适应性突变的组合，RNA复制效率达到200倍以上，反之，被抑制在1/5以下，只增加适应性突变的数目未必就好，呈现出复杂的情况(Lohmann V等人. J Virol 77: 3007‑3019, 2003.)。另外，若HCV株不同，则适应性突变的效果也不同，所以适应性突变通过何种理由影响HCV 基因组的复制效率，其细节尚不清楚。(1)的本发明核酸可以是通过导入该适应性突变而得到的适应突变体。
(4) HCV颗粒的应用
(2)中得到的HCV颗粒适合用作疫苗、用作用于制作抗HCV抗体的抗原。
具体而言，还可以将HCV颗粒直接用作疫苗，但也可以利用该领域已知的方法将其毒性减弱或灭活后使用。病毒的灭活可以通过将福尔马林、β‑丙内酯、戊二醛等灭活剂例如添加混合在病毒悬浮液中，使其与病毒反应而达成(Appaiahgari, M. B. & Vrati, S., Vaccine, 22: 3669‑3675, 2004)。因此，本发明还涉及将(2)中得到的HCV颗粒灭活而得到的HCV疫苗。
本发明的疫苗通常可以制成溶液或悬浮液的任一种形式进行给药。本发明的疫苗还可以制成适合溶解或悬浮于液体中的固体的形态。制备物以乳浊液的形式进行制备、或者可以在脂质体中胶囊化。HCV颗粒等活性免疫原性成分经常与药学上可接受的、适合于活性成分的赋形剂混合。在适当的赋形剂中，例如有水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的混合物。并且，根据需要，疫苗可以含有少量的助剂(例如加湿剂或乳化剂)、pH缓冲剂和/或一种以上的提高疫苗效能的佐剂。
佐剂是该免疫系统的非特异性刺激因子。它们增强宿主对HCV疫苗的免疫应答。对有效的佐剂的例子没有限定，包含下述佐剂：氢氧化铝、N‑乙酰基‑胞壁酰‑L‑苏氨酰‑D‑异谷氨酰胺(thr‑MDP)、N‑乙酰基‑正‑胞壁酰‑L‑丙氨酰‑D‑异谷氨酰胺(CGP11637、称作nor‑MDP)、N‑乙酰基‑胞壁酰‑L‑丙氨酰‑D‑异谷氨酰胺酰‑L‑丙氨酸‑2‑(1'‑2'‑二棕榈酰‑sn‑甘油基‑3‑羟基磷酰氧基)‑乙胺(CGP19835A、称作MTP‑PE)和RIBI。RIBI是在2%角鲨烯/Tween (注册商标) 80乳剂中含有从细菌中提取的3种成分、即单磷脂A、海藻糖二霉菌酸和细胞壁骨架(HPL+TDM+CＷS)的佐剂。佐剂的效能通过测定通过给予由HCV颗粒制成的疫苗而产生的抗体量即可确定。
本发明的疫苗通常是通过胃肠外给药、例如通过皮下注射或肌内注射等注射进行给药。适合于其他给药方式的其他剂型有：栓剂和根据情况进行口服给药的处方药。
例如在皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药的注射剂中，本发明的HCV疫苗和医药上可接受的载体或稀释剂的其他具体例子中，稳定化剂、碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、白蛋白或酪蛋白等蛋白、牛血清或脱脂乳等含蛋白的物质、以及缓冲液(例如磷酸缓冲液)等可以一起给药。
栓剂中使用的现有粘合剂和载体中，例如可以包含聚亚烷基二醇或三甘油。这种栓剂可以由含有0.5%～50%范围、优选1%～20%范围的活性成分的混合物形成。口服处方药含有通常使用的赋形剂。该赋形剂例如有：药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
本发明的疫苗制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释处方剂或粉末剂的形态，含有10%～95%、优选25%～70%的活性成分(病毒颗粒或其一部分)。
本发明的疫苗以适于给药剂型的方法、以及具有预防和/或治疗效果的量进行给药。适合的给药量通常为每次给予0.01μg～100,000μg范围的抗原，这取决于所处置的患者、该患者免疫系统中的抗体合成能力和期望的防御程度，还取决于口服、皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药途径等给药途径。
本发明的疫苗可以按照单独给药时间表进行给药、或者优选按照联合给药时间表进行给药。按照联合给药时间表进行给药时，接种开始时分别给予1～10种物质，接着按照维持和/或强化免疫应答所必需的时间间隔进行给药，例如第2次给药可在1～4个月后进行分别的给药。根据需要，几个月后可以继续给药。给药的要旨也至少部分性地根据个体的必要性来决定，取决于医生的判断。
并且，本发明的含有HCV颗粒的疫苗可以和其他免疫控制剂(例如免疫球蛋白)同时给药。
本发明的疫苗还有以下使用方法：将疫苗给予健康人，在健康人体内诱导对HCV的免疫应答，对于新的HCV感染则预防性使用。并且，还有下述使用方法：将疫苗给予感染了HCV的患者，在机体内诱导对HCV的强免疫反应，从而用作消除HCV的治疗性疫苗。
本发明的HCV颗粒可用作用于制作抗体的抗原。通过将本发明的HCV颗粒给予哺乳类或鸟类，可以制作抗体。哺乳类动物有：小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、豚鼠、单峰驼、双峰驼、大羊驼(Lama)等。单峰驼、双峰驼和大羊驼适合制作仅包含H链的抗体。鸟类动物的例子有：鸡、鹅、鸵鸟等。采取给予了本发明HCV颗粒的动物的血清，按照已知方法可以获得抗体。
使用经本发明的HCV颗粒免疫的动物的细胞，可以制作产生单克隆抗体产生细胞的杂交瘤。杂交瘤的制造方法是周知的，可以采用Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)中记载的方法。
产生单克隆抗体的细胞可以通过细胞融合而生成，还可以利用通过导入癌基因DNA或感染Epstein‑Barr病毒使B淋巴细胞不死化等其他方法而生成。
通过上述方法得到的单克隆抗体或多克隆抗体对HCV的诊断或治疗、预防有用。因此，将本发明的HCV颗粒识别为抗原的抗HCV抗体也包含在本发明范围内。
使用本发明的HCV颗粒制作的抗体可与医药上可接受的溶解剂、添加剂、稳定剂、缓冲液等同时给药。给药途径可以是任一种的给药途径，但优选为皮下、皮内、肌肉内给药，更优选静脉内给药。
(5) 在筛选抗HCV药物中的应用
在进行HCV治疗药的开发时，除黑猩猩外，不存在反映病毒感染的有效动物、也不存在高效的体外病毒培养系统，所以无法充分进行药物评价成为障害。但近年来有人开发了可以评价HCV‑RNA的复制的亚基因组HCV复制子系统(Lohmann, V.等人, Science，285：110‑113, 1999)，作为与抑制病毒复制有关的HCV抑制剂的筛选系统取得了重要进步。
但是，上述亚基因组HCV复制子系统中存在无法评价HCV结构蛋白的功能的问题。实际上，已知作为HCV结构蛋白之一的核心蛋白会影响宿主的转录因子。因此，评价HCV感染的细胞中发生的现象时，仅凭亚基因组HCV复制子系统是不够的。在使用亚基因组HCV复制子系统进行筛选而选择的药物中，预测有时也无法充分抑制HCV的复制。
因此，为了解决上述亚基因组HCV复制子系统的问题，人们使用HCV N株(基因型1b)、HCV Con‑1 (基因型1b)、HCV H77株(基因型1a)开发了全长基因组HCV复制子系统(Ikeda, M等人, J. Virol., 76: 2997‑3006, 2002；Pietschmann, T等人, J. Virol. 76: 4008‑4021, 2002；Blight, KJ等人, J. Virol. 77: 3181‑3190, 2003)。但是，即使将包含上述HCV株的结构蛋白的全长RNA导入细胞中，也没有确认到病毒颗粒释放到培养液中(Blight, KJ等人, J. Virol. 77: 3181‑3190, 2003)。因此，在该全长基因组HCV复制子系统中，出现了无法筛选在病毒的释放、感染过程中起作用的治疗药的问题。
使用HCV复制子来筛选抗HCV药物时，在受检物质的存在下培养感染性HCV颗粒和HCV感染容许细胞、例如Huh7细胞，测定HCV的复制和/或颗粒生产，从而评价受检物质的抗HCV效果。为了监测HCV的复制和颗粒生产，必需采用PCR或RNA印迹法测定HCV基因组量、或者通过EIA法或细胞免疫染色来检出测定核心蛋白或非结构蛋白(例如NS3蛋白) (Aoyagi, K.等人, J. Clin. Microbiol., 37: 1802‑1808, 1999)。但是，由于上述测定方法的操作繁杂、难以高流通量化、成本增加，所以在抗HCV药物的筛选中人们希望开发简便且廉价的评价方法。因此，有人想出了下述方法：制作将报道基因整合到全长基因组HCV中的复制子，该复制子进行自身复制，监测由其基因组中的报道基因翻译的报道蛋白。例如，制作在JFH1、J6CF/JFH1(Jc‑1)和Con1/JFH1的5'NTR与编码核心蛋白的基因之间插入有萤光素酶基因和EMCV IRES作为报道基因的载体、Luc‑JFH1、Luc‑Jc1和Luc‑Con1，研究其功能(Koutsoudakis, G.等人，J. Virol. 80: 5308‑5320, 2006)。制作带有上述报道选择性全长基因组HCV复制子的病毒，使其感染Huh7细胞时，在感染细胞中作为报道基因的萤光素酶基因表达，合成萤光素酶。因此，通过测定萤光素酶活性，可以测定感染的效果，所以省去了测定HCV的基因组量或蛋白的时间，非常方便。
但是，报道基因等外来基因的插入会使基因组长度增加，所以复制效率容易大幅降低。实际上，Luc‑JFH1与JFH1的相比结果是，其复制能力低5倍，而且感染滴度也低3~10倍(Koutsoudakis, G.等人. J. Virol. 80: 5308‑5320, 2006)，为了在筛选中使用带有表达报道基因的全长HCV基因组的病毒颗粒，必需开发感染滴度更高的HCV病毒。
相对于此，在本发明中成功制作了来自JFH1突变体的全长基因组复制子，所述JFH1突变体中虽然导入有报道基因但仍保持高复制能力。通过使用本发明的该全长基因组复制子，可以提供高效率的筛选方法。上述筛选方法也包含在本发明范围内。
在该筛选中，可以有效使用上述的、具有全长基因组序列的HCV RNA (全长基因组复制子RNA)，所述全长基因组序列在前体多聚蛋白编码序列内、特别是在以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时相当于第2394位～第2397位的氨基酸序列中(例如以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准时的第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间)的位置插入有标记基因。作为标记基因，优选报道蛋白。
适合在本发明的该筛选中使用的、来自整合有报道蛋白编码序列的JFH1突变体的全长基因组复制子的结构可以是：从5'侧到3'侧依次包含本发明的JFH1适应突变体的5'非翻译区、报道蛋白编码序列、EMCV (脑心肌炎病毒，Encephalomyocarditis virus)的IRES序列以及JFH1适应突变体的核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3'非翻译区的核酸。
上述复制子的更优选的结构可以是：从5'侧到3'侧依次包含本发明的JFH1适应突变体的5'非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、编码在NS5A蛋白中功能性(符合读框的)插入有报道蛋白的蛋白的序列、NS5B蛋白编码序列和3'非翻译区的核酸。
作为本发明的JFH1适应突变体，可以适当使用上述(1)所述的本发明的核酸。
特别优选的上述复制子的结构可以是：编码在从HCV前体多聚蛋白的N末端起第2394位～第2397位的氨基酸序列中(例如第2394位氨基酸残基与第2395位氨基酸残基之间)功能性(符合读框的)插入有报道蛋白的蛋白的核酸。
报道蛋白的例子有：萤光素酶、分泌型碱性磷酸酶、绿色萤光蛋白(GFP)、β‑内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶、新霉素磷酰转移酶与萤光素酶的融合蛋白等。更优选萤光素酶，进一步优选海肾萤光素酶。编码海肾萤光素酶的基因的核苷酸序列的一个例子见SEQ ID NO: 9。
在上述全长基因组HCV中整合有报道基因的复制子中，特别优选的序列为包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列的核酸，其中，当该核酸为RNA时，核苷酸序列中的碱基符号“T”读作“U”。在本发明的感染性HCV颗粒的制造中可以使用HCV基因组RNA或HCV基因组DNA。通过使用上述全长基因组复制子HCV RNA，可以提供以萤光素酶活性为指标的、高灵敏度的HCV感染测定系统。
使用在本发明的全长基因组HCV RNA中整合有编码报道蛋白的序列的复制子进行的筛选方法例如可以是筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括：如上操作将该复制子导入到培养细胞中，制作生产丙型肝炎病毒颗粒的培养细胞，之后在受检物质的存在下培养(i)所得的生产丙型肝炎病毒颗粒的培养细胞或(ii)从该细胞释放到培养上清中的丙型肝炎病毒颗粒与丙型肝炎病毒感受性细胞(HCV感染容许细胞)的组合，测定所得培养物中的报道蛋白。上述筛选方法还可用作药物评价系统。
上述药物评价系统的具体例子有：筛选具有抗HCV作用的物质的方法，该方法是通过下述(1)~(3)来评价受检物质的抗HCV效果：(1)在受检物质的存在下培养感染性HCV颗粒和HCV感染容许细胞、例如Huh7细胞，所述感染性HCV颗粒包含如上操作将报道基因整合在全长基因组HCV中的复制子作为基因组；(2)测定随着HCV的复制、颗粒产生而产生的报道蛋白；(3)比较所产生的报道蛋白的水平和未加入受检物质的对照中的报道蛋白的检测水平。
本发明的筛选方法的另一例子为：评价受检物质的抗HCV效果的方法，该方法是通过下述(1)～(3)进行评价：(1)在受检物质的存在下培养产生感染性HCV颗粒的细胞，该细胞包含如上操作将报道基因整合到全长基因组HCV中的复制子作为基因组；(2)测定随着HCV的复制、颗粒产生而产生的报道蛋白；(3)比较所产生的报道蛋白的水平和未加入受检物质的对照中的报道蛋白的水平。
更具体而言，上述筛选方法可以是筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括下述步骤：在受检物质的存在下培养生产丙型肝炎病毒颗粒的培养细胞的步骤，所述丙型肝炎病毒颗粒包含插入有编码报道蛋白的核酸的JFH1突变体的全长基因组HCV RNA即本发明的核酸；以及测定所得培养物中的该报道蛋白，当上述报道蛋白的表达量低时判定为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性的步骤。
(6) SEQ ID NO的概要
SEQ ID NO: 1是野生型JFH1 (JFH1wt)的全长基因组序列；
SEQ ID NO: 2是根据野生型JFH1 (JFH1wt)的全长基因组序列编码的、前体多聚蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO: 3是突变体JFH1‑A/WT的全长基因组序列。第341位～第9442位核苷酸是前体多聚蛋白编码序列；
SEQ ID NO: 4是突变体JFH1‑B/WT的全长基因组序列。第341位～第9442位核苷酸是前体多聚蛋白编码序列；
SEQ ID NO: 5是突变体JFH1‑Q862R的全长基因组序列。第341位～第9442位核苷酸是前体多聚蛋白编码序列；
SEQ ID NO: 6是突变体JFH1‑A/WT‑Rluc的全长基因组序列。第341位～第10381位核苷酸是蛋白编码序列；
SEQ ID NO: 7是突变体JFH1‑B/WT‑Rluc的全长基因组序列。第341位～第10381位核苷酸是蛋白编码序列；
SEQ ID NO: 8是突变体JFH1wt‑Rluc的全长基因组序列。第341位～第10381位核苷酸是蛋白编码序列；
SEQ ID NO: 9是海肾萤光素酶基因的全长序列；
SEQ ID NO: 10～SEQ ID NO: 18为PCR引物。
实施例
以下，利用实施例进一步具体地说明本发明。但本发明的技术范围并不受这些实施例的限定。
实施例1：用于高生产JFH1病毒颗粒的JFH1适应突变体的获得
使用作为质粒DNA的pJFH‑1 (Wakita, T.等人, Nat. Med., 11 (2005) 第791‑796页和国际公开WO2004/104198)作为DNA源，所述质粒DNA是将从重症肝炎的日本人患者中分离的基因型2a的丙型肝炎病毒(HCV) JFH1株(GenBank Accession No.AB047639；JP2002‑171978 A)的基因组RNA全区的cDNA (全基因组cDNA (full‑genome cDNA)；SEQ ID NO: 1)克隆到插入有T7启动子的pUC19质粒载体中的T7启动子序列下游的EcoRI‑XbaI位点而得到的。用XbaI切断pJFH‑1，之后加入绿豆核酸酶20U (反应液总量为50μL)，在30℃下温育30分钟，从而使XbaI切断末端变得平滑。接着，进行苯酚氯仿萃取、乙醇沉淀，得到除去了切断末端的CTAG 4个碱基的XbaI切断片段。以该DNA片段为模板，使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)来合成RNA。如下操作将如此合成的JFH1株的全长基因组HCV RNA (full‑length genomic HCV RNA)导入细胞中。
前1天，将1×106个Huh7细胞接种在10cm的培养皿中，用不含抗生素的培养基进行培养。在30μl脂质转染胺2000 (Invitrogen公司)和OPTI‑MEM (Invitrogen公司)的混合液中加入悬浮在1ml OPTI‑MEM (Invitrogen公司)中的6μg JFH1株的全长基因组HCV RNA，使之在室温下反应20分钟，形成RNA‑脂质转染胺复合体。向前1天准备的Huh7细胞中添加该RNA‑脂质转染胺复合体。24小时后将上清更换成新的培养基。之后继续培养2年。该继代培养期间远远长于用于得到适应突变体(culture‑adapted variant)的通常的培养期间即1～2个月(十几次继代)。由该继代培养结束后的细胞生产的病毒株命名为JFH1a。另一方面，与上述同样将按照与上述相同的方法合成的JFH1株的全长基因组HCV RNA(由野生型JFH1株合成的全长基因组JFH1 RNA)导入Huh7.5.1细胞中。由培养刚刚开始后的野生型JFH1株的 RNA导入细胞生产的病毒株命名为JFH1wt。图1显示在本实施例中进行的实验流程。
实施例2：作为JFH1适应突变体(adapted JFH1 variant)的JFH1a的性状解析(characterization)
在病毒感染24小时前，将Huh7.5.1细胞按2×104个/孔(well)接种在24孔平板中。接下来，在37℃下用实施例1中制作的JFH1wt和JFH1a的病毒颗粒按M.O.I (感染复数) 0.006感染Huh7.5.1细胞2小时。除去病毒液，加入新的培养基，在37℃下继续培养7天。经时回收细胞，提取总RNA (total RNA)。提取总RNA时使用市售的RNA提取试剂ISOGEN (NIPPON GENE公司)，按照附录的操作指南进行提取。RNA的定量通过两步骤RT‑PCR来实施，向cDNA转换时使用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒(TOYOBO公司)。PCR反应通过SYBR GreenI检测来进行。通过使用Light Cycler (Roche公司)分析所得的PCR产物，确定细胞内的HCV RNA量。用于测定JFH1a基因组的引物序列为按照扩增HCV的NS3区的方式设计的引物，即5'‑CTTTGACTCCGTGATCGACC‑3'(SEQ ID NO: 10)和5'‑CCCTGTCTTCCTCTACCTG‑3'(SEQ ID NO: 11)。使用5'‑TGGCACCCAGCACAATGAA‑3' (SEQ ID NO: 12)和5'‑CTAAGT CATAGTCCGCCTAGAAGCA‑3' (SEQ ID NO: 13)作为扩增标准化用的肌动蛋白基因的引物，同样通过两步骤RT‑PCR来定量，由所得数据算出每100ng总RNA的HCV RNA拷贝数(图2)。其结果，在培养的第6天，JFH1a显示出JFH1wt的约1,000倍高的复制能力。
接下来，分析JFH1wt和JFH1a的干扰素感受性。在病毒感染24小时前，在24孔平板的每孔中接种3×104个Huh7.5.1细胞。第二天，使JFH1wt和JFH1a以0.006的M.O.I.感染细胞2小时。感染后用PBS(‑)清洗细胞3次，用含有图3中记载的浓度(0、0.16、0.8、4、20、100IU/mL)的干扰素α (IFN‑α) (Universal Type I干扰素, PBL InterferonSource公司)的培养基培养72小时。按照上述方法，通过定量的RT‑PCR来定量用图3中记载的IFN‑α浓度处理的细胞内的HCV RNA量。由所得数据算出相对于未添加干扰素α(IFN‑α)的对照(相当于图3的IFN‑α的0 IU/mL)的相对复制率(%)。由其结果判定：JFH1a和野生型的JFH1wt显示出同样的干扰素感受性(图3)。
实施例3：JFH1a突变的解析
在本实施例中，为了根据JFH1a的高病毒颗粒生产能力研究重要的适应性突变，首先分析JFH1a的基因组序列。使用ISOGEN‑LS (NIPPON GENE公司)，从实施例2中得到的JFH1a病毒感染细胞中提取总RNA，通过逆转录反应合成cDNA。该cDNA合成的逆转录反应使用特异性引物A9482: 5'‑GGAACAGTTAGCTATGGAGTGTA CC‑3' (SEQ ID NO: 16)，使用Transcriptor first Strand cDNA合成试剂盒(Roche公司)来进行。逆转录的程序按照附录的操作指南来进行。以所得的cDNA为模板，通过PCR反应扩增编码从核心蛋白到NS3蛋白的序列。使用S58: 5'‑TGTCTTCACGCAGAAAGCGCCTAG‑3' (SEQ ID NO: 17)和AS4639: 5'‑CTGAGCTGGTATTATGGAGACGT CC‑3' (SEQ ID NO: 18)作为PCR用引物。将通过PCR反应得到的DNA片段连接在pGEM‑T Easy载体(Promega公司)中，转化成大肠杆菌DH5α，之后在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养，筛选转化大肠杆菌。取出6个集落，在LB培养基中培养一夜，使用Wizard Plus SV Miniprep DNA纯化系统(Promega公司)提取纯化质粒，确认了PCR扩增的DNA片段的核苷酸序列。
其结果，在JFH1a的前体多聚蛋白的从核心蛋白到NS3蛋白的区(前体多聚蛋白的N末端侧的一半)，与JFH1的前体多聚蛋白序列(SEQ ID NO: 2)相比发现多个氨基酸取代(突变) (图4)。还显示出6个克隆中的2个以上克隆存在共同的氨基酸突变(在图4中，用“＊”显示)。
实施例4：突变体质粒的构建
构建实施例3所示的、具有J FH1a的高病毒颗粒生产能力所必需的适应性突变的质粒。如图4所示，由在6个克隆的核苷酸序列中共同发现的突变氨基酸的图式可以判定：JFH1a至少由2个突变株构成。此处将上述2个突变株分别称作组A、组B。选择Clone5‑2作为组A、选择Clone5‑4作为组B，制作两种的突变体嵌合。将Clone5‑2和Clone5‑4用限制酶AgeI和SpeI消化，得到包含经PCR扩增的5'侧的突变的区的DNA片段。通过连接反应使上述DNA片段与同样用AgeI和SpeI进行酶处理而得到的pJFH1载体片段结合，从而分别得到pJFH1‑A/WT、pJFH1‑B/WT。
图5是显示由突变体质粒制作的HCV突变体全长基因组中的突变导入位点的概略图。由突变体质粒pJFH1‑A/WT表达的HCV突变体JFH1‑A/WT具有全长基因组序列(SEQ ID NO: 3)，所述全长基因组序列编码在野生型JFH1 (也称作JFH1wt)病毒的前体多聚蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)的N末端侧的一半(从核心到NS3的一部分)导入有K74T、Y297H、A330T、S395P、N417S、D483G、A501T、Q862R、Q931R和S961A这10个氨基酸取代的蛋白。由突变体质粒pJFH1‑B/WT表达的HCV突变体JFH1‑B/WT具有全长基因组序列(SEQ ID NO: 4)，所述全长基因组序列编码在野生型JFH1 (也称作JFH1wt)病毒的前体多聚蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)的N末端侧的一半(从核心到NS3的一部分)导入有V31A、K74T、G451R、V756A、V786A和Q862R这6个氨基酸取代的蛋白。
需要说明的是，使用将在JFH1wt的前体多聚蛋白的氨基酸序列中导入有V2440L氨基酸取代的HCV突变体JFH1‑mut5的全长基因组序列在T7 RNA启动子的控制下克隆化的质粒作为对照。据报道，与JFH1wt相比，该病毒JFH1‑mut5的病毒生产能力高10倍(Kaul等人, J. Virol. (2007) 81: 13168‑13179)。
实施例5：HCV适应突变体的HCV颗粒生产能力的解析
比较野生型JFH1wt及其3种适应突变体JFH1‑A/WT、JFH1‑B/WT和JFH1‑mut5的病毒颗粒生产能力。
首先，以pJFH‑1和实施例4中制作的突变体质粒为模板，利用实施例1所示的方法合成上述4种病毒JFH1wt、JFH1‑A/WT、JFH1‑B/WT和JFH1‑mut5的全长基因组HCV RNA。接下来，将各4μg合成的4种HCV RNA与100μL以5×106细胞/ml的密度悬浮在Microporation试剂盒(Degital Bio公司)中所含的缓冲液R中的Huh7.5.1细胞混合，使用MicroPorator (Digital Bio公司)，在以1350V (脉冲电压)、30ms (脉冲宽度)进行1次脉冲的条件下进行电穿孔(转染)。将细胞悬浮于10ml培养基中，在6孔平板的每孔中接种2mL (2×105细胞)。转染后于4、24、48、72、96小时回收细胞和培养上清，使用Ortho (オーソ) HCV抗原IRMA试验(Aoyagi等人, J. Clin. Microbiol., 37 (1999) 第1802‑1808页)来定量新产生的细胞内核心蛋白量(图6A)。同样操作，测定各时间点的培养上清中的核心蛋白量(图6B)。转染效率的校正使用4小时后的细胞内核心蛋白量来进行。
另外，利用病毒效价测定法(转化灶形成实验，focus forming assay)测定JFH1wt、JFH1‑A/WT、JFH1‑B/WT和JFH1‑mut5的各时间点的培养上清中的病毒感染滴度。更具体而言，在96孔平板的每孔中接种6×103个Huh7.5.1细胞，第二天用经培养基逐步稀释的培养上清感染细胞，在37℃下培养72小时。病毒感染细胞的检测通过抗原抗体反应的免疫染色法来进行。将感染72小时后的细胞在室温下、在10%福尔马林‑PBS(‑)溶液中固定20分钟，之后在室温下用0.5% Triton X‑PBS(‑)处理10分钟。之后，加入用5%脱脂乳‑PBS(‑)稀释的抗HCV‑核心(克隆CP14)单克隆抗体(300倍稀释物)作为一次抗体，使之在室温下反应1小时。再用PBS(‑)清洗3次，之后加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体(300倍稀释物)，使之在室温下反应1小时。用PBS(‑)清洗3次，之后加入Konica Immunostain HRP‑1000 (コニカミノルタ公司)，在显微镜下测定染成蓝色的病毒抗原阳性细胞集团(免疫转化灶，也称作转化灶)的数目(图6C)。
根据所得的核心蛋白量和感染滴度，通过下式算出比活性(相对比感染滴度(relative specific infectivity))。比活性＝(培养上清中的感染滴度)/(培养上清中的核心蛋白量)。其结果见图6D。
在Huh7.5.1细胞中，JFH1‑A/WT和JFH1‑B/WT与野生型JFH1wt相比显示出高达100倍以上的感染滴度、与JFH1‑mut5相比显示出高达10倍以上的感染滴度(图6C)。显示JFH1‑A/WT和JFH1‑B/WT的感染滴度高和病毒蛋白向细胞外的释放量高的这些结果意思是指这些病毒将大量的感染性病毒颗粒释放到培养上清中。即，显示JFH1‑A/WT和JFH1‑B/WT具有非常高的感染性病毒颗粒生产能力(图6B、6C)。
另外，如图6D所示，还显示出JFH1‑B/WT的比活性明显高。该结果表明：JFH1‑B/WT的感染力强、或者可以非常高效地形成病毒颗粒。如上所述，高效率的病毒颗粒形成能力是可以在以疫苗制造等为目的的HCV颗粒生产中有效利用的、非常优异的性质。
实施例6：适应突变体病毒的感染传播(infection transmission)的解析
接下来，分析JFH1wt、JFH1a、JFH1‑A/WT、JFH1‑B/WT和JFH1‑mut5这5种HCV的感染传播力。在进行病毒感染20～24小时前，在6孔平板的每孔中接种1×105个Huh7.5.1细胞。第二天，将这5种病毒用0.001的M.O.I. (100 FFU/mL, 1 mL)在37℃下感染2小时。2小时后除去病毒液，加入2 ml新的培养基，将细胞在37℃下继续培养23天。每隔3～4天取20%左右的该细胞进行继代培养，每次回收上清并在‑80℃下保存。利用实施例5记载的病毒效价测定法(转化灶形成实验)测定回收的培养上清中的病毒感染滴度。其结果，感染后JFH1a和JFH1‑B/WT的病毒感染滴度急速上升，感染传播迅速，这表明上述2种病毒具有高感染传播力(图7)。
为了确认JFH1‑B/WT的感染传播力高，用5种病毒(各50 FFU)感染Huh7.5.1细胞(6×103细胞)，比较在感染72小时后形成的转化灶的大小。将转化灶按照实施例5记载的病毒效价测定法(转化灶形成实验)的程序进行染色、观察。其结果，如图8所示，显示出JFH1a、JFH1‑B/WT的转化灶尺寸特别大、感染传播力格外高。
实施例7：适应突变体病毒JFH1‑B/WT的解析
详细分析具有病毒高生产能力、且感染传播力高的JFH1适应突变体病毒JFH1‑B/WT所具有的6个位置氨基酸突变(氨基酸取代)。在基因的点突变导入中通常采用位点定向诱变法。突变体的制作是使用QuickChange II XL位点定向诱变试剂盒(Stratagene公司)，按照附录的操作指南，以将JFH1‑B/WT或JFH1wt的全长基因组序列克隆化的质粒为模板，使用点突变导入用引物来进行。如此操作导入到HCV基因组序列中的点突变通过使用DNA序列分析仪进行序列测定即可确认。
将制作的6个位置氨基酸突变(V31A、K74T、G451R、V756A、V786A和Q862R)中的任一个恢复成野生型氨基酸的突变体和将该6个位置氨基酸突变中的任一个导入JFH1wt (野生型)中的突变体分别见图9和图10。
将JFH1‑B/WT的6个位置氨基酸突变中的1个位置氨基酸突变恢复成野生型氨基酸的碱基突变导入JFH1‑B/WT全长基因组序列中得到的6种HCV突变体命名为31‑(A31V)、74‑(T74K)、451‑(R451G)、756‑(A756V)、786‑(A786V)和862‑(R862Q) (图9)。31‑(A31V)是将氨基酸取代A31V导入JFH1‑B/WT中得到的突变体，74‑(T74K)是将氨基酸取代T74K导入JFH1‑B/WT中得到的突变体，451‑(R451G)是将氨基酸取代R451G导入JFH1‑B/WT中得到的突变体，756‑(A756V)是将氨基酸取代A756V导入JFH1‑B/WT中得到的突变体，786‑(A786V)是将氨基酸取代A786V导入JFH1‑B/WT中得到的突变体，862‑(R862Q)是将氨基酸取代R862Q导入JFH1‑B/WT中得到的突变体。进行与实施例4相同的操作，制作上述突变体的全长基因组序列被克隆化的突变体质粒。
另外，将引起JFH1‑B/WT的6个位置氨基酸突变中的1个位置氨基酸突变的碱基突变导入野生型JFH1wt全长基因组序列中得到的6种HCV突变体命名为31+(V31A)、74+(K74T)、451+(G451R)、756+(V756A)、786+(V786A)和862+(Q862R) (图10)。31+(V31A)是将氨基酸取代V31A导入JFH1wt中得到的突变体，74+(K74T)是将氨基酸取代K74T导入JFH1wt中得到的突变体，451+(G451R)是将氨基酸取代G451R导入JFH1wt中得到的突变体，756+(V756A)是将氨基酸取代V756A导入JFH1wt中得到的突变体，786+(V786A)是将氨基酸取代V786A导入JFH1wt中得到的突变体，862+(Q862R)是将氨基酸取代Q862R导入JFH1wt中得到的突变体。进行与实施例4相同的操作，制作上述突变体的全长基因组序列被克隆化的突变体质粒。
再以制作的突变体质粒为模板，通过实施例1所示的方法合成全长基因组HCV RNA。
接着，按照与实施例5相同的方法，通过电穿孔将各4μg的图9所示的6种突变体病毒31‑(A31V)、74‑(T74K)、451‑(R451G)、756‑(A756V)、786‑(A786V)和862‑(R862Q)的全长基因组HCV RNA、以及图10所示的突变体病毒451+(G451R)的全长基因组HCV RNA、JFH1wt和JFH1‑B/WT的全长基因组HCV RNA分别转染到Huh7.5.1细胞(1×106)中。将转染的细胞悬浮于10 mL培养基中，在6孔平板上各接种2 mL (2×105细胞)。按照实施例5记载的方法测定转染后24、48、72、96小时的培养上清中的病毒感染滴度(FFU/mL)和核心蛋白量(pg/孔)。图11中显示72小时后的测定结果。如图11A、11B和11C所示，将第451位的氨基酸恢复成野生型的G (甘氨酸)时，比活性显著降低。需要说明的是，比活性(相对比感染滴度(relative specific infectivity))是指用培养上清中的感染滴度除以培养上清中的核心蛋白质量而得到的值。比活性强表明感染力强或者可以非常高效率地形成病毒颗粒。由此表明：G451R的突变对提高感染力或有效率的病毒颗粒形成能力至关重要。
同样，通过电穿孔将各4μg的图10所示的6种突变体病毒31+(V31A)、74+(K74T)、451+(G451R)、756+(V756A)、786+(V786A)和862+(Q862R)的全长基因组HCV RNA、以及JFH1wt和JFH1‑B/WT的全长基因组HCV RNA分别转染到Huh7.5.1细胞(1×106个)中。将转染的细胞悬浮于10mL培养基中，在6孔平板的每孔中各接种2mL (2×105细胞)。测定转染后24、48、72、96小时的培养上清中的病毒感染滴度(FFU/mL)、核心蛋白量(pg/孔)。图12中显示72小时后的测定结果。培养上清中的感染滴度显示：通过将K74T、G451R、Q862R的氨基酸突变分别导入JFH1wt中，感染性病毒颗粒生产能力有所提高(图12A)。另外，通过导入Q862R突变，细胞外核心蛋白量增加至JFH1wt的10倍(图12B)。
上述测定结果表明：通过导入G451R突变，与JFH1wt相比病毒感染力和感染性病毒颗粒生产能力有所提高。另外还显示：K74T突变和Q862R突变也提高了感染性病毒颗粒生产能力。但是，仅凭这些突变还不能超过JFH1‑B/WT。
并且，为了研究在长期感染中病毒感染传播力随时间的变化，进行与实施例6相同的实验。将由各突变体质粒合成的全长基因组HCV RNA转染到Huh7.5.1细胞中，用产生的各感染性病毒颗粒感染Huh7.5.1细胞(M.O.I.＝0.001)，进行长期培养(每隔3～4天采集20%左右的细胞进行继代培养)，经时测定培养上清的病毒生产量和感染滴度。31‑(A31V)、74‑(T74K)、451‑(R451G)、756‑(A756V)、786‑(A786V)、862‑(R862Q)、451+(G451R)、JFH1wt和JFH1‑B/WT的结果汇总在图13中，而31+(V31A)、74+(K74T)、451+(G451R)、756+(V756A)、786+(V786A)、862+(Q862R)、JFH1wt和JFH1‑B/WT的结果汇总在图14中。
其结果表明：在将第451位的氨基酸残基恢复成野生型的G (甘氨酸)的突变体(451‑(R451G))中，培养上清中的核心蛋白量的增加时间延迟(图13A)，所以G451R突变与感染传播力有关。另外，将第451位的氨基酸残基恢复成野生型的G (甘氨酸)的突变体(451‑(R451G))、将第74位的氨基酸残基恢复成野生型的K(赖氨酸)的突变体74‑(T74K)、将第862位的氨基酸残基恢复成野生型的Q(谷氨酰胺)的突变体(862‑(R862Q))与JFH1‑B/WT相比感染滴度减少(图13B)。
如图14所示，培养上清中核心蛋白质量和感染滴度的增加的图形显示出：K74T、G451R、Q862R的突变有助于提高感染传播力(图14A和14B)。特别是通过导入G451R突变，与JFH1wt相比，在核心蛋白质量和感染滴度两个方面均显示出显著的增加，即使在长期感染(长期培养)中，也显示出感染性病毒颗粒生产能力大幅提高。
根据以上解析可知：K74T、G451R、Q862R的突变使HCV生产能力增强。需要说明的是，突变体862+(Q862R) (也称作JFH1‑Q862R)的全长基因组序列见SEQ ID NO: 5。
实施例8：将报道基因整合在全长基因组序列中的突变体的制作
为了容易检测HCV的感染和增殖，制作包含整合有萤光素酶基因作为报道基因的全长HCV基因组序列的突变体。制作的突变体的结构图见图15。
具体而言，如下制作将编码HCV前体多聚蛋白的DNA片段功能性连接在T7启动子下游的质粒载体(pJFH1wt‑Rluc、pJFH1‑A/WT‑Rluc、pJFH1‑B/WT‑RLuc)，所述HCV前体多聚蛋白在JFH1wt (野生型)、JFH1‑A/WT和JFH1‑B/WT (适应突变体)的全长基因组中、在从该HCV的前体多聚蛋白的N末端的第1氨基酸(甲硫氨酸)起计数的、第2394位氨基酸残基(氨基酸2394位)与第2395位氨基酸残基(氨基酸2395位)之间(还可以规定为2395位与2396位之间或者2396位与2397位之间)插入有包含311个氨基酸残基的海肾(Renilla reniformis)萤光素酶。
首先，以插入在质粒pGL4.27 (Promega公司)中的海肾萤光素酶基因(SEQ ID NO: 9)为模板，使用末端具有XhoI识别位点(ctcgag)的2个引物5'‑ctcgagATGGCTTCCAAGGTGTACGACCCC‑3' (SEQ ID NO: 14)和5'‑ctcgagCTGCTCGTTCTTCAGCACGCGCTC‑3' (SEQ ID NO: 15)，扩增海肾萤光素酶基因片段。用XhoI消化已扩增的基因片段。
另一方面，将JFH1wt、JFH1‑A/WT和JFH1‑B/WT的全长基因组序列被克隆化的质粒(分别为pJFH‑1、pJFH1‑A/WT和pJFH1‑B/WT)用识别核苷酸序列5'‑CCTCGAGG‑3'的限制酶AbsI消化(消化位置为从5'末端起的7523/7527)，在该限制位点插入上述得到的海肾萤光素酶基因扩增产物的XhoI消化片段，进行克隆，筛选具有功能性连接有海肾萤光素酶的载体的克隆。将如此操作得到的海肾萤光素酶(也称作Rluc)基因导入突变体分别命名为JFH1wt‑Rluc、JFH1‑A/WT‑Rluc、JFH1‑B/WT‑RLuc。被克隆化在载体中的JFH1‑A/WT‑Rluc的全长基因组序列(SEQ ID NO: 5)、JFH1‑B/WT‑RLuc的全长基因组序列(SEQ ID NO: 6)和JFH1wt‑Rluc的全长基因组序列(SEQ ID NO: 7)通过核苷酸序列测定来确认。
需要说明的是，如上所述，制作JFH1wt‑Rluc、JFH1‑A/WT‑Rluc、JFH1‑B/WT‑RLuc时，用XhoI消化在海肾萤光素酶基因(933bp)的5'末端和3'末端添加有XhoI识别位点的ctcgag的基因，并将其插入pJFH‑1、pJFH1‑A/WT或pJFH1‑B/WT的AbsI切断位点。JFH1wt‑Rluc、JFH1‑A/WT‑Rluc、JFH1‑B/WT‑RLuc在从JFH1wt、JFH1‑A/WT或JFH1‑B/WT的前体多聚蛋白的N末端的第1氨基酸(甲硫氨酸)起计数的氨基酸2394位与2395位之间(还可以规定为2395位与2396位之间或2396位与2397位之间)插入有海肾萤光素酶蛋白。
接下来，将上述的序列被克隆化的重组载体(pJFH1wt‑Rluc、pJFH1‑A/WT‑Rluc、pJFH1‑B/WT‑RLuc)用XbaI消化，切出插入片段，用绿豆核酸酶处理，之后使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion公司)合成全长基因组序列HCV RNA。需要说明的是，JFH1wt‑Rluc、JFH1‑A/WT‑Rluc和JFH1‑B/WT‑Rluc达到在各HCV全长基因组序列(9678bp)中添加有海肾萤光素酶的933bp和6bp的XhoI识别位点(ctcgag)的10617bp。按照与实施例5相同的方法，将由pJFH1wt、pJFH1wt‑Rluc、pJFH1‑A/WT‑Rluc和pJFH1‑B/WT‑Rluc合成的HCV RNA转染到HuH7.5.1细胞中，72小时后测定培养上清中的感染滴度。测定感染滴度时，按照与实施例5相同的方法，通过使用抗HCV‑核心(CP14)单克隆抗体进行细胞染色、计测转化灶数目来进行。
其结果，将Rluc基因整合在野生型JFH1wt中时，病毒生产能力与野生型JFH1wt相比低约10倍(图16)。另一方面，将Rluc基因整合在突变体JFH1‑A/WT或JFH1‑B/WT中时，与JFH1wt‑Rluc相比感染滴度高约100倍(图16)。
进一步分析由整合有Rluc基因的全长基因组序列生产的HCV颗粒的量与萤光素酶活性的相关。在48孔平板上按1.0×104个/孔接种Huh7.5.1细胞，24小时后用JFH‑A/WT‑Rluc和JFH‑B/WT‑Rluc以100、50、25、12、6、3和0 FFU (转化灶形成单元)感染2小时。感染后用PBS(‑)清洗细胞2次，每孔加入200μL新鲜培养基。病毒感染72小时后，从平板中回收细胞，测定萤光素酶的活性。萤光素酶的活性通过使用海肾萤光素酶分析系统(Promega公司)，按照附录的操作指南进行测定。具体如下：除去培养上清，用200μL PBS(‑)清洗2次，加入200μL试剂盒中所含的溶解缓冲液(裂解缓冲液) (海肾萤光素酶分析系统；Promega公司)，在室温下搅拌15分钟，使细胞溶解。将20μL的溶解液移至萤光素酶分析平板中，加入100μL底物，用Glomax发光计(Promega公司)测定发光。其结果，可以检测出依赖于病毒量的萤光素酶活性(图17)。
实施例9：干扰素对HCV感染和增殖的抑制效果
关于干扰素对HCV感染和增殖的抑制效果，以公知的干扰素作为受试药物进行实验，确认使用了在全长HCV基因组序列中整合有报道基因的JFH1突变体(实施例8)的抗HCV物质筛选系统的有效性。
在病毒感染的24小时前，在两块(2セット) 48孔平板的每孔中接种1.2×104个Huh7.5.1细胞。第二天，向细胞中加入100 FFU的JFH‑A/WT‑Rluc或JFH‑B/WT‑Rluc病毒，感染2小时。感染后用PBS(‑)清洗细胞2次，再用含有图18中记载的浓度(0、1、4、20、100 U/mL)的干扰素α (IFN‑α) (Universal Type I干扰素；PBL InterferonSource公司)的培养基培养72小时。利用实施例5记载的病毒效价测定法(转化灶形成分析)测定上述两块病毒感染平板中的一块平板的病毒感染滴度，按照实施例8记载的方法测定另一块平板的萤光素酶活性。其结果见图18。
干扰素α剂量依赖性地抑制HCV的感染(图18B)。另外，在萤光素酶分析中显示：所示的萤光素酶活性与感染滴度之间高度相关(图18A)。该结果表明：使用整合有Rluc基因的JFH1wt及其突变体时，可以以萤光素酶活性为指标，通过测定感染抑制率，高效率筛选干扰素等抗HCV物质。
序列表的自由文本
SEQ ID NO: 3～8为JFH1突变体；
SEQ ID NO: 10～18为引物。