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1、(10)申请公布号 CN 103396958 A (43)申请公布日 2013.11.20 CN 103396958 A *CN103396958A* (21)申请号 201310296734.4 (22)申请日 2013.07.15 C12N 1/20(2006.01) A61K 35/74(2006.01) A61P 37/04(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (71)申请人 广东温氏食品集团股份有限公司 地址 527439 广东省广州市新兴县勒竹镇榄 根 (72)发明人 周庆丰 余国莲 杜云平 梁健良 林丽苗 王雷 宋延华 (74)专利代理机构 深圳汇智容达专利商。
2、标事务 所 ( 普通合伙 ) 44238 代理人 刘新年 (54) 发明名称 草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种草分枝杆菌及其免疫增强 剂的制备方法， 所述草分枝杆菌是通过以下步骤 培养得到的 ： 采用斜面培养基活化草分枝杆菌 ； 采用种子培养基培养上述活化菌种得到种子液 ； 按照 3-6% 的接种量 （v/v） 将上述种子液接种到发 酵培养基中， 通气培养 48-50h， 得到发酵液 ； 所述 免疫增强剂是将草分枝杆菌发酵液灭活， 离心收 集菌体， 用 PBS 清洗 2-3 次， 计算离心得到的菌体 干重， 再与适量 PBS、 0.5-1%SDS 混合均匀，。
3、 进行高 压均质破碎， 离心超滤制备后制备得到的。 本发明 所提供的草分枝杆菌生产方法工艺简单， 培养周 期短， 有效降低生产成本。 本发明制备的免疫增强 剂既可单独使用， 也可与其他疫苗、 药物配伍使用 来提高机体免疫力， 且无毒副作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103396958 A CN 103396958 A *CN103396958A* 1/1 页 2 1. 一种草分枝杆菌的制备方法， 其特征在于 ： 包括以下步。
4、骤 ： （1） 采用斜面培养基活化草分枝杆菌 ； （2） 将活化的草分枝杆菌采用种子培养基进行种子培养， 得到种子液 ； （3） 按 3-6% 的接种量 （v/v） 将上述种子液接种到发酵培养基中， 通气培养 48-50h， 得 到草分枝杆菌发酵液 ； 所述斜面培养基的配方为 ： 大豆蛋白胨 5-10g/L， 酵母膏 3-8g/L， 葡萄糖 2-5g/L， 硫酸 镁0.4-0.6g/L， 磷酸氢二钾0.4-0.6g/L， 磷酸二氢钾0.4-0.6g/L， 氯化钙0.4-0.6g/L， 琼脂 15-20g/L， pH7.3-7.5 ； 所述种子培养基的配方为 ： 大豆蛋白胨 5-10g/L， 酵。
5、母膏 5-10g/L， 葡萄糖 5-10g/L， 硫 酸镁0.4-0.6g/L， 磷酸二氢钾0.4-0.6g/L， 磷酸氢二钾0.4-0.6g/L， 氯化钙0.4-0.6g/L， 甘 油 1-5g/L， pH7.3-7.5 ； 所述发酵培养基的配方为 ： 大豆蛋白胨 5-10g/L， 酵母膏 5-10g/L， 葡萄糖 5-10g/L， 硫 酸镁0.4-0.6g/L， 磷酸二氢钾0.4-0.6g/L， 磷酸氢二钾0.4-0.6g/L， 氯化钙0.4-0.6g/L， 甘 油 5-10g/L， pH7.3-7.5。 2. 根据权利要求 1 所述的草分枝杆菌的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （1）中。
6、， 在 28-37， 静置培养 72-96h 进行活化。 3. 根据权利要求 1 所述的草分枝杆菌的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （2）中， 在 28-37， 转速 200rpm 条件下进行种子培养。 4. 根据权利要求 1 所述的草分枝杆菌的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 （3）中， 在 28-37， 转速 150rpm， 通气比为 1 ： 0.8-1.2 的条件下进行发酵培养。 5. 一种草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法， 其特征在于 ： 将权利要求 1-4 任一项所述 的制备方法得到的草分枝杆菌的发酵液灭活， 离心收集菌体， 用 PBS 清洗 2-3 次， 再与适量 PBS、 0.5。
7、-1%SDS 混合均匀， 进行高压均质破碎， 离心超滤即制成免疫增强剂。 6. 根据权利要求 5 所述的草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法， 其特征在于 ： 所述草分 枝杆菌免疫增强剂的浓度为 10-20%。 7. 根据权利要求 5 所述的草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法， 其特征在于 ： 向所述草 分枝杆菌免疫增强剂中添加 0.01% 的硫柳汞 （v/v） 。 8. 一种权利要求 5-7 任一项所述制备方法制备的草分枝杆菌免疫增强剂。 权 利 要 求 书 CN 103396958 A 2 1/9 页 3 草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法 技术领域 0001 本发明属于兽医生物制品技术领域， 具体。
8、地说， 本发明涉及一种草分枝杆菌的培 养方法及免疫增强剂的制备。 背景技术 0002 免疫增强剂是指单独或同时与抗原使用均能增强机体免疫应答的物质。 目前佐剂 的品种较多， 按其作用的先决条件可分为三类 ：（1） 免疫替代剂， 用来代替某些具有免疫增 强作用的生物因子的药物 ；（2） 免疫恢复剂， 能增强被抑制的免疫功能， 但对正常免疫功能 作用不大 ；（3） 免疫佐剂， 又称非特异性剌激剂。常用的免疫增强剂有卡介苗、 短小棒状杆 菌、 内毒素、 免疫核糖核酸、 胸腺素、 转移因子、 双链聚核苷酸、 氢氧化铝铝胶佐剂等。 0003 上述佐剂中， 有的虽然已经研究成功应用于人类如胸腺素， 但是价。
9、格较为昂贵， 不 可能用于动物。目前动物用疫苗所用佐剂如氢氧化铝铝胶佐剂， 通过延长疫苗在注射部位 的停留时间发挥佐剂效应， 还没有直接通过增强动物机体自身的免疫应答能力的佐剂来提 高免疫效果， 致使动物免疫效果较差， 影响了畜禽养殖业的快速健康发展。因此， 研发新型 的免疫增强剂， 改善动物免疫效果， 成为畜禽养殖业亟待解决的问题之一。 0004 草分枝杆菌 (Mycobacterium phlei) 属于放线菌纲放线菌目分枝杆菌科， 是一 种非致病性微生物。草分枝杆菌中的分枝杆菌胞壁酰二肽 (MDP) 具有很强的免疫治疗 作用， 草分枝杆菌多糖 MPS 在免疫调节、 抑制病毒复制方面有很好。
10、效果 ( 周莉婷， 赵晶晶 等， 分枝杆菌多糖免疫调节剂研究进展， 药物生物技术， 2011.18(2) ： 176-179)。公开号为 CN102764434A 的中国发明专利申请， 也公开了一种动物用免疫增强剂的制备方法及应用 ： 将草分枝杆菌在 37通气培养， pH7.0， 发酵培养 5 天后细菌浓度为 5107cfu/mL（发酵 培养基为酵母提取粉 5g 10g， 浓缩麦芽汁 5.0g 20g， 葡萄糖 20g 100g， 磷酸氢二铵 1.0g 4.0g， 磷酸氢二钾 0.5g 1.0g， 注射用水加至 1000mL） ， 再通过灭活、 浓缩、 提纯、 均 质等工序制备成一种动物用免疫。
11、增强剂。这种培养方法耗时长、 菌浓度低。 发明内容 0005 有鉴于此， 有必要针对上述问题， 提供一种草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方 法。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案。 0007 一种草分枝杆菌的制备方法， 包括以下步骤 ： 0008 （1） 采用斜面培养基活化草分枝杆菌 ； 0009 （2） 将活化的草分枝杆菌采用种子培养基进行种子培养， 得到种子液 ； 0010 （3）按照 3-6% 的接种量 （v/v）将上述种子液接种到发酵培养基中， 通气培养 48-50h， 得到草分枝杆菌的发酵液 ； 0011 所述斜面培养基的配方为 ： 大豆蛋白胨 5-10g/L， 酵。
12、母膏 5-10g/L， 葡萄糖 5-10g/ L， 硫酸镁0.4-0.6g/L， 磷酸氢二钾0.4-0.6g/L， 磷酸二氢钾0.4-0.6g/L， 氯化钙0.4-0.6g/ 说 明 书 CN 103396958 A 3 2/9 页 4 L， 琼脂 15-20g/L， pH7.3-7.5 ； 0012 所述种子培养基的配方为 ： 大豆蛋白胨 5-10g/L， 酵母膏 5-10g/L， 葡萄糖 5-10g/ L， 硫酸镁0.4-0.6g/L， 磷酸二氢钾0.4-0.6g/L， 磷酸氢二钾0.4-0.6g/L， 氯化钙0.4-0.6g/ L， 甘油 1-5g/L， pH7.3-7.5 ； 0013。
13、 所述发酵培养基的配方为 ： 大豆蛋白胨 5-10g/L， 酵母膏 5-10g/L， 葡萄糖 5-10g/ L， 硫酸镁0.4-0.6g/L， 磷酸二氢钾0.4-0.6g/L， 磷酸氢二钾0.4-0.6g/L， 氯化钙0.4-0.6g/ L， 甘油 5-10g/L， pH7.3-7.5。 0014 优选地， 步骤 （1） 中， 在 28-37， 静置培养 72-96h 进行活化。 0015 优选地， 步骤 （2） 中， 在 28-37， 转速 200rpm 条件下进行种子培养。 0016 优选地， 步骤 （3） 中， 在 28-37， 转速 150rpm， 通气比为 1 ： 0.8-1.2 的。
14、条件下进行 发酵培养。 0017 一种草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法， 将上述任一项所述的草分枝杆菌的制备 方法制备得到的草分枝杆菌的发酵液灭活， 离心收集菌体， 用 PBS 清洗 2-3 次， 计算离心得 到的菌体干重， 再与适量 PBS、 0.5-1%SDS 混合均匀， 进行高压均质破碎， 离心超滤即制成免 疫增强剂。 0018 优选地， 所述草分枝杆菌免疫增强剂的浓度为 10-20%。 0019 优选地， 向所述草分枝杆菌免疫增强剂中添加 0.01% 的硫柳汞 （v/v） 。 0020 一种上述任一项草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法制备的草分枝杆菌免疫增强 剂。 0021 SDS 即十二烷。
15、基硫酸钠属阴离子表面活性剂。易溶于水， 与阴离子、 非离子复配伍 性好， 具有良好的乳化、 发泡、 渗透、 去污和分散性能。SDS 是一种已知的能够使蛋白质变性 的去污剂。它可用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳， 它也可以用于核酸抽提操作 中破坏细胞壁及裂解核酸 ： 蛋白复合物。在较高温度下， 破坏蛋白质与 DNA 的结合， 导致蛋 白质变性， 使 DNA 释放出来。在乳液聚合反应中， 可充当两相溶液的乳化剂。使用 SDS 处理 菌体， 比使用吐温等非离子表面活性剂处理菌体效果更好。 吐温不破坏蛋白的结构， 只是减 少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。SDS 的用量以 0.5-1% 为宜，。
16、 使用量量过高 （如 2%） 会增加草分枝杆菌免疫增强剂后续处理的困难。 0022 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 0023 1本发明所提供的草分枝杆菌生产方法工艺简单、 操作方便。 0024 2 本发明所提供的草分枝杆菌生产方法， 使用的培养基非常适合于草分枝杆菌的 生长， 培养时间仅48h左右， 菌落数即达到109cfu/mL， 活性强， 同时菌株同步性较好， 相比专 利 CN102764434A 中长达 5d 的培养时间， 能大大缩短培养周期， 节约了水电及人力， 有效降 低生产成本。 0025 3本发明所提供的草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法确保各种活性成分能释放 出来、 。
17、有效地保护了活性成分、 使免疫增强剂的免疫效果明显， 并延长免疫增强剂的使用期 限。 0026 4本发明制备的免疫增强剂既可单独使用， 也可与其他疫苗、 药物配伍使用来提 高机体免疫力， 且无毒副作用。 说 明 书 CN 103396958 A 4 3/9 页 5 附图说明 0027 图 1 为本发明实施例 1 中草分枝杆菌的生长曲线图。 具体实施方式 0028 为了更好的理解本发明， 下面结合实施例作进一步说明。本发明中的草分枝杆菌 来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌种编号为 CGMCC4.1180。 0029 实施例 1 ： 草分枝杆菌的制备 0030 （1） 斜面培养 。
18、0031 斜面培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨8， 酵母膏5， 葡萄糖5， 硫酸镁0.5， 磷酸氢二钾0.5， 磷酸二氢钾 0.5， 氯化钙 0.4， 琼脂 15， 蒸馏水余量， pH7.3， l2l湿热灭菌 30min。 0032 将菌种接种斜面培养基后， 将其放在 37生化培养箱中， 静置 72-96h 进行菌种活 化。 0033 （2） 种子培养 0034 种子培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨8， 酵母膏5， 葡萄糖5， 硫酸镁0.5， 磷酸氢二钾0.5， 磷酸二氢钾 0.5， 氯化钙 0.4， 甘油 3， 蒸馏水余量， pH7.3， l2l湿热灭菌 30min。 0035 将活化的。
19、草分枝杆菌采用种子培养基在 37， 转速 200rpm 条件下进行种子培养 48h 以上， 得到种子液。 0036 （3） 发酵培养 0037 发酵培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨8， 酵母膏5， 葡萄糖5， 硫酸镁0.5， 磷酸氢二钾0.5， 磷酸二氢钾 0.5， 氯化钙 0.4， 甘油 8， 蒸馏水余量， pH7.3， l2l湿热灭菌 30min。 0038 按照3%的接种量 （v/v） 将上述种子液接种到发酵培养基中， 在37， 转速150rpm， 通气比 1 ： 1 的条件下通气培养 48-50h， 培养至 OD600 检测变化不大， 停止发酵， 得到草分枝 杆菌的发酵液。 0039。
20、 在培养过程中， 定时取样测定发酵液的 OD600。由图 1 可知， 培养 10h 内草分枝杆 菌生长缓慢， 10h 左右进入快速增殖期， 于培养后 48h 左右进入稳定期 OD600 值达到 2.5 以 上， 菌落数达到 109cfu/mL 以上。 0040 实施例 2 ： 草分枝杆菌的制备 0041 （1） 斜面培养 0042 斜面培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨 10， 酵母膏 8， 葡萄糖 10， 硫酸镁 0.4， 磷酸氢二钾 0.5， 磷酸二氢钾 0.5， 氯化钙 0.5， 琼脂 20， 蒸馏水余量， pH7.4， l2l湿热灭菌 30min。 0043 将菌种接种斜面培养基后， 。
21、将其放在 30生化培养箱中， 静置 72-96h 进行菌种活 化。 0044 （2） 种子培养 0045 种子培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨 5， 酵母膏 10， 葡萄糖 8， 硫酸镁 0.6， 磷酸氢二钾 0.4， 磷酸二氢钾 0.4， 氯化钙 0.6， 甘油 1， 蒸馏水余量， pH7.4， l2l湿热灭菌 30min。 0046 将活化的草分枝杆菌采用种子培养基在 30， 转速 200rpm 条件下进行种子培养 48h 以上， 得到种子液。 0047 （3） 发酵培养 0048 发酵培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨 5， 酵母膏 8， 葡萄糖 10， 硫酸镁 0.4， 磷酸氢二钾 。
22、说 明 书 CN 103396958 A 5 4/9 页 6 0.6， 磷酸二氢钾 0.6， 氯化钙 0.5， 甘油 5， 蒸馏水余量， pH7.4， l2l湿热灭菌 30min。 0049 按照4%的接种量 （v/v） 将上述种子液接种到发酵培养基中， 在30， 转速150rpm， 通气比 1 ： 1 的条件下通气培养 48-50h， 培养至 OD600 检测变化不大， 停止发酵， 得到草分枝 杆菌的发酵液。 0050 实施例 3 ： 草分枝杆菌的制备 0051 （1） 斜面培养 0052 斜面培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨 5， 酵母膏 10， 葡萄糖 8， 硫酸镁 0.6， 磷酸氢二。
23、钾 0.4， 磷酸二氢钾 0.4， 氯化钙 0.6， 琼脂 18， 蒸馏水余量， pH7.5， l2l湿热灭菌 30min。 0053 将菌种接种斜面培养基后， 将其放在 35生化培养箱中， 静置 72-96h 进行菌种活 化。 0054 （2） 种子培养 0055 种子培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨 10， 酵母膏 8， 葡萄糖 10， 硫酸镁 0.4， 磷酸氢二钾 0.6， 磷酸二氢钾 0.6， 氯化钙 0.5， 甘油 5， 蒸馏水余量， pH7.5， l2l湿热灭菌 30min。 0056 将活化的草分枝杆菌采用种子培养基在 35， 转速 200rpm 条件下进行种子培养 48h 以。
24、上， 得到种子液。 0057 （3） 发酵培养 0058 发酵培养基 （g/L） ： 大豆蛋白胨 10， 酵母膏 10， 葡萄糖 8， 硫酸镁 0.6， 磷酸氢二钾 0.4， 磷酸二氢钾 0.4， 氯化钙 0.6， 甘油 10， 蒸馏水余量， pH7.5， l2l湿热灭菌 30min。 0059 按照6%的接种量 （v/v） 将上述种子液接种到发酵培养基中， 在35， 转速150rpm， 通气比 1 ： 1 的条件下通气培养 48-50h， 培养至 OD600 检测变化不大， 停止发酵， 得到草分枝 杆菌的发酵液。 0060 实施例 4 ： 草分枝杆菌免疫增强剂的制备 0061 将实施例 1 。
25、制备的发酵液经 0.2% 甲醛灭活， 离心收集菌体， 用 PBS 洗 2-3 次， 计算 离心得到的菌体干重， 再与适量 PBS、 0.5%SDS 混合均匀， 90处理 0.5 小时后， 进行高压均 质破碎， 离心除去沉淀， 进行纯化浓缩即制成20%的免疫增强剂。 制成后于4保存， 如需较 长时间保存， 可向免疫增强剂中加入0.01%的硫柳汞 （v/v） 。 该制备方法安全且能把菌体中 的有效免疫成分提取出来， 去除多余组分使免疫效果显著。 0062 实施例 5 ： 草分枝杆菌免疫增强剂的制备 0063 将实施例 1 制备的发酵液经 0.2% 甲醛灭活， 离心收集菌体， 用 PBS 洗 2-3。
26、 次， 最后 离心得到的菌体烘干称重后与适量PBS、 1%SDS混合均匀， 90处理0.5小时后， 进行高压均 质破碎， 离心除去沉淀， 进行纯化浓缩即制成10%的免疫增强剂。 制成后于4保存， 如需较 长时间保存， 可向免疫增强剂中加入 0.01% 的硫柳汞 （v/v） 。 0064 实施例 6 ： 草分枝杆菌免疫增强剂的制备 0065 将实施例 1 制备的发酵液经加热灭活， 离心收集菌体， 用 PBS 洗 2-3 次， 最后离心 得到的菌体烘干称重后与适量PBS、 0.8%SDS混合均匀， 90处理0.5小时后， 进行高压均质 破碎， 离心除去沉淀， 进行纯化浓缩即制成15%的免疫增强剂。。
27、 制成后于4保存， 如需较长 时间保存， 可向免疫增强剂中加入 0.01% 的硫柳汞 （v/v） 。 0066 实施例 7 ： 不同草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法比较 0067 选取 40 头生长状况一致健康的 28 日龄的断奶仔猪， 进行草分枝杆菌免疫增强剂 说 明 书 CN 103396958 A 6 5/9 页 7 后处理方法效果对比试验。将这 40 头猪随机分成 A、 B、 C、 D 四组， 每组各 10 头。其中 A 组 为对照组， B 组、 C 组、 D 组为试验组 , 其中 C 组采用实施例 4 制备的草分枝杆菌制剂， D 组 采用的草分枝杆菌制剂为菌体烘干称重后与适量PBS、 。
28、0.2%吐温80混合均匀后进行高压均 质所得。各试验组中每头猪注射的猪瘟疫苗的含量相同。具体实验设计见表 1。 0068 表 1 不同草分枝杆菌免疫增强剂的制备方法比较的实验设计 0069 组别实验处理 对照组 A不注射猪瘟疫苗和草分枝杆菌制剂 试验组 B注射猪瘟疫苗 试验组 C注射猪瘟疫苗 +0.1mg 草分枝杆菌制剂 (SDS) 试验组 D注射猪瘟疫苗 +0.1mg 草分枝杆菌制剂 ( 吐温 80) 0070 所有试验仔猪于首免前 1d、 首免后 14d 前腔静脉采血， 制备血清， 使用 IDEXX 猪瘟 病毒抗体检测试剂盒测定每个血清样本的阻断率。结果判定 ： 如果被检样本的阻断率大于 。
29、或等于 40， 该样本被判定为阳性 （有 CSFV 抗体存在） ， 并记录下阳性头数 ； 如果被检样本 的阻断率小于或等于 30， 该样本被判定为阴性 （无 CSFV 抗体存在） ， 并记录下阴性头数 ； 如果被检样本阻断率在 30 40之间， 该样本被判定为不确定， 并记录下不确定头数。 0071 表 2 首免后 14d 猪瘟抗体检测结果 0072 0073 首免前 1d 检测结果均为阴性。首免猪瘟抗体水平的测定结果见表 2。从表 2 可 知， 首免后14d采血测抗体状况， B组抗体检测阳性率只有40%， 而添加了草分枝杆菌制剂的 C 组、 D 组抗体检测阳性率为 100%。其中 C 组的抗。
30、体水平明显高于 D 组， 说明本方法制备的 草分枝杆菌制剂免疫效果更显著。 0074 实施例 8 ： 单独使用草分枝杆菌免疫增强剂在饲养肉鸡上的应用 0075 选择 200 只 7 日龄肉鸡， 均分为实验组和对照组两组。实验组注射实施例 4 制备 得到的草分枝杆菌菌体免疫增强剂0.1mg/kg， 且每21天注射1次。 同时实验组与对照组饲 说 明 书 CN 103396958 A 7 6/9 页 8 养管理、 免疫程序、 投药程序都按常规肉鸡饲养办法和免疫程序进行， 64 日出栏。其中试验 组每只药费只有0.43元， 对照组每只药费0.65元， 说明草分枝杆菌免疫增强剂有明显的增 强免疫力的作。
31、用。 0076 实施例 9 ： 草分枝杆菌免疫增强剂与猪瘟疫苗的使用效果 0077 选取50头生长状况一致健康的28日龄的断奶仔猪进行草分枝杆菌免疫增强剂与 猪瘟疫苗的使用效果试验。将这 50 头猪随机分成 A、 B、 C、 D、 E 五组， 每组各 10 头。其中 A 组为对照组， B组、 C组、 D组、 E组为试验组， 各试验组中每头猪注射的猪瘟疫苗的含量相同， 选用实施例 4 制备得到的草分枝杆菌免疫增强剂进行试验。具体实验设计见表 3。 0078 表 3 草分枝杆菌免疫增强剂与猪瘟疫苗实验设计 0079 组别实验处理 （每头） 对照组 A不注射猪瘟疫苗和草分枝杆菌免疫增强剂 试验组 B。
32、注射猪瘟疫苗 试验组 C注射猪瘟疫苗 +0.03mg 草分枝杆菌免疫增强剂 试验组 D注射猪瘟疫苗 +0.05mg 草分枝杆菌免疫增强剂 试验组 E注射猪瘟疫苗 +0.08mg 草分枝杆菌免疫增强剂 0080 所有试验仔猪于首免后 14d 进行二免， 首免前 1d、 首免后 14d 及二免后 14d 前腔 静脉采血， 制备血清， 使用 IDEXX 猪瘟病毒抗体检测试剂盒测定每个血清样本的阻断率。 结果判定 ： 如果被检样本的阻断率大于或等于 40， 该样本被判定为阳性 （有 CSFV 抗体存 在） ， 并记录下阳性头数 ； 如果被检样本的阻断率小于或等于30， 该样本被判定为阴性 （无 CSF。
33、V抗体存在） ， 并记录下阴性头数 ； 如果被检样本阻断率在3040之间， 该样本被判定 为不确定， 并记录下不确定头数。 0081 首免前 1d 检测结果均为阴性。首免、 二免猪瘟抗体水平的测定结果见表 4、 表 5。 0082 表 4 首免后 14d 猪瘟抗体检测结果 0083 说 明 书 CN 103396958 A 8 7/9 页 9 0084 0085 从表 4 可知， 首免后 14d 采血测抗体状况， B 组的抗体检测阳性率只有 30%。而添 加了草分枝杆菌免疫增强剂的 C 组、 D 组、 E 组的抗体检测阳性率已经全部达到 100%。说明 添加了草分枝杆菌免疫增强剂， 能很快提高。
34、机体的免疫能力。 0086 表 5 二免后 14d 猪瘟抗体检测结果 0087 0088 从表 5 可知， 二免后 14d 采血测抗体状况， 添加了草分支杆菌免疫增强剂的 C 组、 D 组、 E 组的抗体水平明显高于未添加草分支杆菌免疫增强剂的 B 组。 0089 实施例 10 ： 草分枝杆菌免疫增强剂与猪伪狂犬病弱毒疫苗的使用效果 0090 选取30头生长状况一致健康的28天龄断奶仔猪进行草分枝杆菌免疫增强剂与猪 伪狂犬病灭活疫苗使用的效果试验。将这 30 头猪随机分成 A、 B、 C 三组， 每组各 10 头。其 中 A 组为对照组， B 组、 C 组为试验组， 各试验组中每头猪注射的猪瘟。
35、疫苗的含量相同， 选用 说 明 书 CN 103396958 A 9 8/9 页 10 实施例 4 制备得到的草分枝杆菌免疫增强剂进行试验。具体实验设计见表 6。 0091 表 6 草分枝杆菌免疫增强剂与猪伪狂犬病弱毒疫苗实验设计 0092 组别实验处理 （每头） 对照组 A 不注射猪伪狂犬病弱毒疫苗和草分枝杆菌免疫增强剂 试验组 B 注射猪伪狂犬病弱毒疫苗 试验组 C 注射猪伪狂犬病弱毒疫苗 +0.05mg 草分枝杆菌免疫增强剂 0093 0094 所有试验仔猪于免疫前 1d、 免疫 14d 及 21d 前腔静脉采血 , 制备血清， 使用 BioChek 猪伪狂犬 gB 抗体检测试剂盒检测。。
36、结果判定 ： 如果被检样本的 S/P 大于或等于 0.500， 该样本被判定为阳性 （有PRV gB抗体存在） ， 并记录下阳性头数。 如果被检样本的S/ P 大于或等于 0.499， 该样本被判定为阴性 （无 PRV gB 抗体存在） ， 并记录下阴性头数。 0095 免疫前 1d 检测结果均为阴性。免疫 14d 及 21d 猪伪狂犬抗体水平的测定结果见 表 7、 表 8。 0096 表 7 免疫 14d 猪伪狂犬抗体 gB 检测结果 0097 0098 表 8 免疫 21d 猪伪狂犬抗体 gB 检测结果 0099 0100 从表 7 和表 8 可知 ： 免疫 14d 采血测抗体状况 ： B。
37、 组的抗体检测阳性率只有 20%。 而添加了草分枝杆菌免疫增强剂的 C 组的抗体检测阳性率达到 60% ； 免疫 21d 采血测抗体 说 明 书 CN 103396958 A 10 9/9 页 11 状况 ： B 组的抗体检测阳性率只有 60%。而添加了草分枝杆菌免疫增强剂的 C 组的抗体检测 阳性率已经全部达到 100%。这两个表的数据说明添加了草分枝杆菌免疫增强剂， 能很快提 高机体的免疫能力。 0101 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 CN 103396958 A 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 103396958 A 12 。