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1、(10)申请公布号 CN 103421719 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421719 A *CN103421719A* (21)申请号 201310349722.3 (22)申请日 2013.08.13 CGMCC No.6993 2012.12.14 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/16(2006.01) C12P 13/06(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 沈阳药科大学 地址 110016 辽宁省沈阳市沈河区文化路 103 号 (72)发明人 张怡轩 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限。
2、 公司 21207 代理人 李宇彤 (54) 发明名称 一株放线菌波卓链霉菌及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一株生产磷脂酶 D 的放线菌株 及其应用， 属于生物技术领域。本发明所述的一 株放线菌， 经发酵后产生的磷脂酶 D 可催化大 豆磷脂酰胆碱和 L- 丝氨酸通过转酯反应高效 生成磷脂酰丝氨酸。该菌株采自辽宁省盘锦市 大洼县东风镇 1066#井口， 经鉴定为波卓链霉菌 （Streptomycesbottropensis)， 在辽宁省新药筛 选重点实验室保藏， 保藏编号为 SYP-A-6632 ； 在 CGMCC 的保存编号为 CGMCC No.6993。本菌主要 通过以下筛选方法获得 ：。
3、 (1) 待筛选菌株的活化。 (2)筛选平板的制备。 (3)平板法筛选分解卵磷脂 菌株。(4) 转脂活性的检测。本发明的操作工艺 简单、 实施条件温和， 可以高效、 快速生物转化制 备磷脂酰丝氨酸， 为未来实现磷脂酰丝氨酸生产 的工业化奠定基础。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103421719 A CN 103421719 A *CN103421719A* 1/1 页 2 1. 一株放线菌菌株波卓链霉菌 。
4、（Streptomyces bottropensis） ， 其特征在于 ： 其保藏 编号为 ： CGMCC.6993。 2. 权利要求 1 所述的波卓链霉菌在生产磷脂酶 D 中的应用。 3. 一种制备磷脂酶 D 的方法， 其特征在于， (1) 菌株的活化 用竹签将筛选出的高产菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面培养基， 于 2032培养箱中静置培养 314d ； (2) 摇瓶种子的制备 用接种铲从固体斜面铲取约 0.15cm2菌苔到种子培养基， 于自动旋转摇瓶机上， 温 度 2032、 转速 50300 rpm， 培养 1672 h ； (3) 摇瓶或 5L 发酵罐发酵液的制备 摇瓶微生物。
5、发酵 ： 将种子以 315% 接种量转种， 于自动旋转摇瓶机上， 温度 2032、 转速 50300 rpm， 培养 48144 h ； 发酵罐微生物发酵 ： 将种子以 315 % 接种量转种， 于 5L 发酵罐上， 温度 2032， 搅拌转速 50300 rpm， 通气比 0.52 vvm， 培养 24120 h ； (4) 发酵液的后处理 将上述发酵液于超声破碎仪进行细胞破碎， 超 3s， 停 5s， 总时长 120 min， 之后离 心， 即获得含有磷脂酶 D 的上清液。 4.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述的高氏一号固体斜面培养基为: 100mL 中含 Nacl 0.。
6、05g， KNO3 0.1g， K2HPO4 0.05g， FeSO4 0.001g， MgSO47H20 0.05g， 琼 脂粉 2g ， pH:7.0， 121灭菌 30min ； 所使用的种子培养基为 ： 100mL 中含葡萄糖 1g， 黄豆饼粉 1g， 蛋白栋 0.3g， NaCl 0.25g， CaCO3 0.2g ， pH 7.0， 121灭菌 30min ； 所使用的发酵培养基为 ： 100mL 中含葡萄糖 1g， 黄豆饼粉 1g， 蛋白胨 0.3g， NaCl 0.25g， CaCO3 0.2g ， pH 7.0， 121灭菌 30min。 5.根据权利要求3或4所述的制备方法。
7、， 其特征在于， 固体斜面培养基还添加一定比例 的无机盐 ， 选自硝酸钾、 MgSO47H2O、 硫酸铵、 硫酸锌、 氯化钠、 碳酸钙、 磷酸二氢钾或磷酸 氢二钾。 6. 权利要求 1 所述的波卓链霉菌在合成磷脂酰丝氨酸中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 波卓链霉菌发酵分泌产生磷脂酶 D， 菌株 发酵液经超声破碎、 离心获得的上清液作为磷脂酶 D 粗酶液， 以大豆磷脂酰胆碱和 L- 丝氨 酸为原料合成磷脂酰丝氨酸。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于 ： 检测粗酶液中磷脂酶D活性的方法为 ： 大 豆来源的磷脂酰胆碱溶于 150 mg/mL 有机相氯仿中， 水。
8、相由菌株发酵粗酶液与 1500 mg/ mL 的 L- 丝氨酸， 体积比 0.15 % 的 L- 丝氨酸， 0.1200 mM CaCl2 混合而成， 有机相与水 相 1:1 震荡混合， 保温 110 h， 提取有机相 HPLC 检测磷脂酰丝氨酸的含量。 权 利 要 求 书 CN 103421719 A 2 1/6 页 3 一株放线菌波卓链霉菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物制药技术领域， 特别涉及放线菌波卓链霉菌 （Streptomyces bottropensis） 菌株及其应用， 具体涉及一株高产磷脂酶 D 的放线菌菌株及其应用。 背景技术 0002 磷脂酰丝氨酸 （phos。
9、phatidylserine， PS） 又称丝氨酸磷脂或二酰甘油酰磷酸丝氨 酸， 是一种天然磷脂， 1942 年由 Jordi Folch 首次提取并命名。磷脂酰丝氨酸并非单一成 分， 而是一组化合物， 这是由于不同来源的原料所提取的产品的脂乙酰残基的变化较大而 造成。 PS以甘油为主要骨架， 1、 2号碳原子上面连接脂肪酸， 构成它的非极性尾部， 3号碳原 子连接一个带丝氨酸的磷脂， 构成它的极性头部。 0003 磷脂酰丝氨酸的制备方法比较多， 其中主要以提取法和酶转化法为主。 0004 提取法主要是从植物细胞、 动物的脑和肝脏中提取的。由于植物中的 PS 含量较 少， 所以提取法以动物组织。
10、中提取为主。 从动物中提取主要是动物的大脑及内脏， 目前国外 大部分以牛、 羊、 兔、 马、 驴等家畜的动物脑为原料来提取PS。 磷脂酰丝氨酸存在于组织的脂 类物质里， 要想得到纯净的磷脂酰丝氨酸， 首先要把粗磷脂从组织中进行浓缩分离， 然后再 通过 TLC 法、 硅胶柱色谱法、 氨基键合硅胶柱色谱法、 高效液相色谱法等方法对粗磷脂再进 一步分离纯化。粗脂质的提取方法目前最常用的主要有氯仿 - 甲醇 - 水提取法、 己烷 - 异 丙醇提取法等。近年来由于疯牛病的原因， 利用动物大脑提取 PS 的方法获得的产品安全性 受到人们的怀疑， 此种方法现在已处于淘汰边缘。 0005 酶转化法主要以天然的。
11、卵磷脂为基质， 加入丝氨酸， 在磷脂酶 D 的作用下， 生成磷 脂酰丝氨酸。应用此种方法不但可以填补国内生产磷脂酰丝氨酸合成酶制剂的空白， 还可 以解决药物、 保健品开发对高品质磷脂及其衍生物的迫切要求， 对于发展高品质磷脂及其 衍生物制备技术， 支持国内关键药物技术脂质体靶向给药技术开发， 提高人民健康水平 具有重要的现实意义。 0006 磷脂酰丝氨酸 (PS) 可由人体利用丝氨酸合成产生， 它可影响脑内化学讯息的传 递， 并帮助脑细胞储存和读取资料， 是维持大脑正常记忆力、 反应和健康情绪的重要营养元 素。其药理作用表现在以下 5 方面 ： 改善记忆力、 延缓脑疲劳， 治疗老年痴呆症。治疗。
12、 儿童多动症。缓解精神压力。治疗抑郁症。竞技运动营养。 0007 目前大规模生产磷脂酰丝氨酸的重要性不仅仅在于其生物学及工业化应用潜力 , 说 明 书 CN 103421719 A 3 2/6 页 4 同时也与其在保健、 营养方面的逐渐应用有关。然而从自然界分离提取磷脂酰丝氨酸以及 化学合成法生产过程都是十分复杂的 , 而且化学法合成也仅限于实验室规模。因此， 有待 于开发一种工艺简单， 方便的方法来实现磷脂酰丝氨酸的工业化。 发明内容 0008 本发明所解决的技术问题在于提供一种放线菌菌株， 该菌株能够高产磷脂酶 D， 进 而生物转化法制备高产磷脂酰丝氨酸， 本发明还提供了该菌株制备磷脂酰丝。
13、氨酸的方法。 0009 本发明通过如下技术方案实现 ： 本发明提供的新的微生物菌株为波卓链霉菌 （Streptomyces bottropensis） 6632。 0010 本发明菌株在不同培养基上的基本特征如下 ： 菌落形态 ： 参见图 1 菌丝形态 ： 参见图 2 生理生化特征 ： 以分子生物学手段， 提取上述菌株的 16s rDNA， 以 Primer(S)、 Primer(A) （Primer(S) ： 5 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3 ； Primer(A) ： 5 AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3 ） 为引物进行 PCR 扩增， 。
14、测序， 并将所测序列与 Genbank 中的 16s rDNA 同源序列比对， 选取 14株较高同源性的菌株， 利用软件Clustal X与Mega4.0构建菌种进化树。 菌株SYP-A-6632 与波卓链霉菌 （Streptomyces bottropensis） 同源性为 99%， 再结合形态学鉴定结果， 该菌 株被鉴定为波卓链霉菌 （Streptomyces bottropensis） ， 该菌具有高产磷脂酶 D 的功能， 其 分泌产生的磷脂酶 D 能够催化磷脂酰胆碱和 L- 丝氨酸进行转酯反应， 生成磷脂酰丝氨酸。 参见图 3。 0011 本发明的高产磷脂酶 D 的放线菌菌株的快速筛选。
15、方法， 按以下步骤进行 ： (1) 菌株的活化 用竹签将筛选出的高产菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面培养基， 于 2032培养箱中静置培养 314d ； (2) 摇瓶种子的制备 用接种铲从固体斜面铲取约 0.15cm2菌苔到种子培养基， 于自动旋转摇瓶机上， 温 度 2032、 转速 50300 rpm， 培养 1672 h ； (3) 摇瓶或 5L 发酵罐发酵液的制备 摇瓶微生物发酵 ： 将种子以 315% 接种量转种， 于自动旋转摇瓶机上， 温度 2032、 转速 50300 rpm， 培养 48144 h ； 说 明 书 CN 103421719 A 4 3/6 页 5 发酵罐微。
16、生物发酵 ： 将种子以 315 % 接种量转种， 于 5L 发酵罐上， 温度 2032， 搅拌转速 50300 rpm， 通气比 0.52 vvm， 培养 24120 h ； (4) 发酵液的后处理 将上述发酵液于超声破碎仪进行细胞破碎， 超 3s， 停 5s， 总时长 120 min， 之后离 心收集， 即获得含有磷脂酶 D 的上清液。 0012 其具体操作如下 ： (1) 筛选用菌株的活化 用竹签分别将筛选用菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面， 于 28培养箱中 静置培养 7d。 0013 (2) 筛选平板的制备 将灭菌后的高氏培养基 200mL 倒入无菌的检定盘中， 制成下层平板 。
17、； 在灭菌后冷却至 55左右的 100mL 分离培养基中加入 2mL10% 的底物卵磷脂溶液， 使其终浓度为 0.2%， 混匀 后倒入上述检定平板中， 制成上层平板。 0014 (3) 平板筛选分解卵磷脂菌株 将培养好的新鲜斜面用竹签点种于筛选平板上， 每株菌重复做两次， 28培养箱中静 置培养 57d， 观察水解圈的大小。 0015 本发明提供的高产磷脂酶 D 的菌株培养条件及发酵液后处理得到粗酶液按以下 操作步骤进行 ： (1) 筛选出的高产菌株的活化 用竹签将筛选出的高产菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面， 于 28培养箱 中静置培养 7d。 0016 (2) 摇瓶种子的制备 用接。
18、种铲从固体斜面铲取约 1cm2菌苔到种子培养基， 于自动旋转摇瓶机上， 温度 28、 转速 200rpm， 培养时间 48h。 0017 (3) 摇瓶和 5L 发酵罐发酵 摇瓶微生物发酵 ： 将种子以 10% 接种量转种， 于自动旋转摇瓶机上， 温度 28、 转速 200rpm， 培养 96h。 0018 发酵罐微生物发酵 ： 将种子以 10% 接种量转种， 于 5L 发酵罐中， 温度 28， 转速 200rpm， 通气比 0.7vvm， 培养 96h。 0019 (4) 发酵液的后处理 将上述发酵液于超声破碎仪进行细胞破碎， 超3s， 停5s， 总时长5min， 之后4000rpm 离心 1。
19、5min， 得到的上清液即为粗酶液。 0020 本发明提供的高产磷脂酶 D 的菌株， 检测其发酵粗酶液中磷脂酶 D 的方法为 ： 大 豆来源的磷脂酰胆碱溶于色谱纯氯仿 （1.6mg/mL 或 5mg/mL） ， L- 丝氨酸 （50mg/mL） ， Triton X-100(v/v， 2.4%)， CaCl2(80mM)， 菌株发酵粗酶液 10mL， 有机相与水相 1:1 混合， 摇床中 60rpm 震荡 6h， 提取有机相 HPLC 检测。 0021 本发明的高氏一号固体斜面培养基 （100mL） 如下 : Nacl 0.05g， KNO3 0.1g， K2HPO4 0.05g， FeSO4。
20、 0.001g， MgSO47H20 0.05g， 琼 脂 粉 2g ， pH:7.0， 121 灭 菌 30min ； 说 明 书 CN 103421719 A 5 4/6 页 6 本发明的种子培养基 （100mL）如下 ： 葡萄糖 1g， 黄豆饼粉 1g， 蛋白胨 0.3g， NaCl 0.25g， CaCO3 0.2g ， pH 7.0， 121灭菌 30min。 0022 本发明的发酵培养基 (100mL) 如下 ： 葡萄糖 1g， 黄豆饼粉 1g， 蛋白胨 0.3g， NaCl 0.25g， CaCO3 0.2g ， pH 7.0， 121灭菌 30min。 0023 本发明的培养方。
21、法如下 ： 种子培养基接入微生物波卓链霉菌进行培养， 培养温度 28， pH 7.0， 培养48h小时得到种子液， 种子液按10%转种量接入发酵培养基中， 培养温度 28， pH 7.0， 在通风搅拌条件下培养， 培养时间 96h。 0024 本发明的磷脂酶 D 活性检测方法如下 ： 大豆来源的磷脂酰胆碱溶于氯仿 （1.6mg/ mL 或 5mg/mL） ， L- 丝氨酸 （50mg/mL） ， Triton X-100(v/v， 2.4%)， CaCl2(80mM) 溶解于菌株 发酵粗酶液中， 有机相与水相 1:1 混合， 2045震荡 110 h， 提取有机相 HPLC 检测。 0025 。
22、本发明涉及到的菌种培养及酶转化操作工艺简单、 实施条件温和， 可以高效、 快速 实施 PS 的生物转化， 为未来实现磷脂酰丝氨酸的工业化生产奠定基础。 0026 本发明所用的波卓链霉菌 （Streptomyces bottropensis） 已保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物 研究所， 保藏编号为 CGMCC.6993， 保藏日期为 2012 年 12 月 14 日。 附图说明 0027 图 1 为波卓链霉菌菌落形态 ； 图 2 为波卓链霉菌菌丝形态 ； 图 3 为菌株依据其 16s rDNA 的系统进化树 ； 图 4。
23、 为底物 PC 对照品图谱 ； 图 5 为 PS 对照品图谱 ； 图 6 为转化产物图谱。 具体实施方式 0028 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明， 但不以任何方式限制 本发明。 实施例 1 本发明所述用于发酵制备磷脂酶 D 的微生物菌种波卓链霉菌 （Streptomyces bottropensis） 特征 ： 该菌在培养基上培养 7d， 根据其培养特征， 菌丝形态学确定该菌株为波卓链霉菌 （Streptomyces bottropensis） 。 0029 本发明所述高产磷脂酶 D 菌株筛选的具体步骤 ： 说 明 书 CN 103421719 A 6 5/6 页 7 (。
24、1) 筛选用菌株的活化。 0030 用竹签分别将筛选用菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面， 于 28培养 箱中静置培养 7d。 0031 (2) 筛选平板的制备 将灭菌后的高氏培养基 200mL 倒入无菌的检定盘中， 制成下层平板 ； 在灭菌后冷却至 55左右的100mL分离培养基中加入2mL 98%底物卵磷脂溶液， 使其终浓度为0.2%， 混匀后 倒入上述检定平板中， 制成上层平板。 0032 (3) 平板筛选分解卵磷脂菌株 将培养好的新鲜斜面用竹签点种于筛选平板上， 每株菌重复做两次， 28培养箱中静 置培养 57d， 观察水解圈的大小。 0033 本发明所述微生物发酵制备磷脂酶 D。
25、 的生产工艺 ： 一、 培养基 1、 高氏一号培养基 (%) 可溶性淀粉 2g NaCl 0.05g KNO3 0.1g K2HPO4 0.05g FeSO4 0.001g MgSO47H20 0.05g 琼脂粉 2g pH 7.0 121 灭菌 30min 2、 液体种子培养基 (%) 葡萄糖 1g 黄豆饼粉 1g 蛋白胨 0.3g NaCl 0.25g CaCO3 0.2g pH 7.0 121 灭菌 30min 3、 液体发酵培养基 (%) 葡萄糖 1g 黄豆饼粉 1g 蛋白胨 0.3g NaCl 0.25g CaCO3 0.2g pH 7.0 121 灭菌 30min 二、 发酵生产 。
26、1、 菌种的斜面活化 ： 打开菌种脱脂牛奶冻干管， 挑取少量粉末均匀涂布在上述灭过菌 的斜面上， 在 28温度下培养 5-7d， 冰箱 4保存。 0034 2、 摇瓶种子培养 ： 向种子培养基中分别接入 1cm3的新鲜菌苔， 于 28恒温振荡培 养， 摇床转速 220rpm， 培养 48h。 0035 3、 发酵 ： 发酵培养基配方如上， 灭菌后， 将培养好的种子， 按 10% 的转种量， 转入发 酵培养基， 于 28恒温振荡培养， 摇床转速 220rpm， 培养 96h。 0036 4、 终止发酵后， 将发酵液进行超声破碎、 离心， 取上清液作为粗酶液。 0037 实施例 2 本发明所述微生。
27、物发酵制备磷脂酶 D 转酯活性的检测 取适量大豆来源的磷脂酰胆碱 （PC） 溶于色谱纯氯仿 （终浓度 5mg/mL） 10 mL 为有机 相 ； 另取发酵粗酶液 10mL， 向其中加入 L- 丝氨酸 （终浓度 50mg/mL） ， Triton X-100 (v/v， 2.4%)， CaCl2 ( 终浓度 80mM) 为水相 ； 将有机相与水相 1:1 混合于三角瓶， 置于震荡摇床上 2045震荡110h， 进行生物转化。 反应结束后双液相静止分层， 磷脂酰丝氨酸存在于下层 氯仿层有机相中。取有机相进行 HPLC 检测。色谱条件 ： Kromasil 5 C18 色谱柱， 流动相 配比为甲醇 。
28、: 乙腈 : 水 =16:2:3， ELSD 蒸发光散射检测器， 漂移温度 80， N2流速 1.6mL/ min， 柱温30， 进样量20L， 利用外标法(以PS标准品为外标物)计算底物卵磷脂的转化 率。如下图 1-3 所示， 与 PC, PS 对照品的出峰时间比对， PC 对照品保留时间为 2.857min， 说 明 书 CN 103421719 A 7 6/6 页 8 PS 对照品保留时间为 3.440min， PLD 粗酶液催化 PC 转化产物出峰时间 3.407min， 出峰时 间与 PS 一致， 说明转化成功， 获得 PS 产物。利用外标法计算， PLD 粗酶液转化率为 90% 左 右。 说 明 书 CN 103421719 A 8 1/4 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103421719 A 9 2/4 页 10 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103421719 A 10 3/4 页 11 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103421719 A 11 4/4 页 12 图 6 说 明 书 附 图 CN 103421719 A 12 。