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1、(10)申请公布号 CN 103421898 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421898 A *CN103421898A* (21)申请号 201310344659.4 (22)申请日 2013.08.08 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/14(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/445(2006.01) (71)申请人 广东出入境检验检疫局检验检疫技 术中心 地址 510623 广东省广州市珠江新城花城大 道 66 号 B1405 室 (72)发明人 袁慕云 许龙岩 张旺 王志强 阳静 陈碧玲 (74)专利代。
2、理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (54) 发明名称 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测引物、 探针、 检测试剂盒和检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌三重实时荧光 PCR 检测引物、 探针、 检测试剂盒 和检测方法。本发明根据 nuc、 mecA 和 femA 基因 序列分别设计引物和探针， 利用该检测引物和检 测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧 光 PCR 检测， 在一次扩增反应中完成对待测样品 的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性检测， 从 而简便、 快速、 准确的对待检样品中是否含有耐甲 氧西林金黄。
3、色葡萄球菌进行判断。按照本发明的 方法对样品进行三重实时荧光 PCR 检测， 检测快 速， 8-10 小时可以完成从制备样品到出具检测结 果的过程， 不受假阳性和交叉污染等干扰， 结果可 靠， 且灵敏度高、 特异性强， 为耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌进行流行病学调查提供了有利工具。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103421898 A CN 103421898 A *CN103421898A* 1/2 。
4、页 2 1. 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测引物， 其特征在于， 所述的 检测引物如下所示 ： 针对 nuc 基因 ： 5-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3 ； 5-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3 ； 针对 mecA 基因 ： 5-GAAGGTGTGCTTACAAGTGC-3 ； 5-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3 ； 针对 femA 基因 ： 5-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-3 ； 5-TCACTGGACCGCGATTTG-3。 2. 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 。
5、检测探针， 其特征在于， 所述的 检测探针如下所示 ： nuc 基因的探针 ： 5-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3 ； mecA 基因的探针 ： 5-TTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCC-3 ； femA 基因的探针 ： 5-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3 ； 探针的5端标记有荧光报告基团， 3端标记有荧光淬灭基团， 三探针的5端标记的荧 光报告基团是不同的荧光报告基团。 3. 根据权利要求 2 所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测探针， 其 特征在于， 所述的荧光报告基团为 TET、 HEX 或 FAM。
6、， 所述的荧光淬灭基团为 BHQ1。 4. 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测试剂盒， 包括实时荧光定量 PCR 反应液、 耐热 DNA 聚合酶、 检测引物和检测探针， 其特征在于， 所述的检测引物包括三对 ： 针对 nuc 基因 ： 5-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3 ； 5-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3 ； 针对 mecA 基因 ： 5-GAAGGTGTGCTTACAAGTGC-3 ； 5-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3 ； 针对 femA 基因 ： 5-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-。
7、3 ； 5-TCACTGGACCGCGATTTG-3 ； 所述的检测探针包括 ： nuc 基因的探针 ： 5-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3 ； mecA 基因的探针 ： 5-TTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCC-3 ； femA 基因的探针 ： 5-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3 ； 探针的5端标记有荧光报告基团， 3端标记有荧光淬灭基团， 三探针的5端标记的荧 光报告基团是不同的荧光报告基团。 5. 一种非疾病的诊断和治疗目的的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检 测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （。
8、1） 对样品进行增菌培养， 提取增菌液中菌体的基因组 DNA 作为模板 ； （2） 使用权利要求 1 所述的针对 nuc 基因、 mecA 基因和 femA 基因的检测引物和权利要 求 2 所述的针对 nuc 基因、 mecA 基因和 femA 基因的检测探针， 与实时荧光 PCR 扩增用的反 应液及耐热 DNA 聚合酶混合形成扩增反应体系 ； （3） 将扩增反应体系在荧光 PCR 仪上进行实时荧光 PCR 反应， 反应结束后， 根据探针标 权 利 要 求 书 CN 103421898 A 2 2/2 页 3 记的荧光报告基团记录的荧光信号， 读取并记录各检测样品的 PCR 扩增循环次数 （C。
9、t） ； （4） 根据各样品的 Ct 值， 按照建立的判断标准， 判断样品中是否含有耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌。 6. 根据权利要求 5 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的步骤 （2） 的扩增反应体系为 ： 模板 DNA4L 10TaqMan 缓冲液5L 5mmol/L MgCl22L 2.5mmol/L dNTPs3L 20mol/L TaqMan 探针三种探针各 1L（共 3L） 20mol/L 检测引物六条引物各 1L（共 6L） 0.55U UNG 酶0.2L 2.5U/L Taq 聚合酶3L 去离子水3.8L 7. 根据权利要求 5 所述的检测方法， 其特征在于， 步骤 （3） 。
10、的进行实时荧光 PCR 反应， 其反应参数为 ： 95 30s、 95 5s、 60 30s、 40 个循环。 权 利 要 求 书 CN 103421898 A 3 1/6 页 4 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测引物、 探针、 检测试剂盒和检测方法 技术领域 ： 0001 本发明属于生物工程技术领域， 具体涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Meth icil lin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA) 的三重实时荧光 PCR 检测引物、 探针、 检测 试剂盒和检测方法。 背景技术 ： 0002 Jevons 于 1961 年在英国首次报。
11、道了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Meth icil lin-resistant S taphylococcus aureus,MRSA)， 现成为全球性的病原微生物， 与乙型肝 炎、 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)同时列为世界上最难解决的三大感染性顽症。 目前MRSA 耐药检测常用的方法有纸片扩散法、 肉汤稀释法、 琼脂筛选法、 分子生物学诊断方法等。 0003 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Meth icil lin-resistant S taphylococcus aureus,MRSA) 及 耐 甲 氧 西 林 凝 固 酶 阴 性 葡 萄 球 菌 (Methicillin-resist。
12、ant coagulase-nega tive staphy lococci,MRCNS) 现已成为医院和社区感染的常见病原菌， 发病率有逐年上升趋势。mecA(Methicillin determ inant A) 是 MRSA 的耐药决定基因， 编码与-内酰胺类抗生素亲和力极低的PBP2a， 促进细菌胞壁合成而耐药， 现已明确mecA 基因只存在于葡萄球菌中， 位于一个由不同整合子、 转座子等组成的可移动元件上， 因此， mecA 基因可作为耐甲氧西林葡萄球菌的分子标志， 但 mecA 基因存在于所有耐甲氧西林葡 萄球菌中， 且特异和保守， 所以只检测 mecA 基因不能确定为 MRSA。。
13、femA 是甲氧西林耐药的 辅助基因， femA 插入失活， 将导致 - 内酰胺类抗生素敏感性上升， femA 基因可用于 MRSA 与 MRCNS 间鉴别。Francois 等将拭子标本中的 MRSA 增菌后， 采用实时荧光 PCR 方法分别扩 增目标 FemA 和 mecA 基因， 用于鉴定样本中是否含有 MRSA， 方法的灵敏度优于 CLSI 推荐方 法。耐热核酸酶 nuc 是金黄色葡萄球菌的特异性酶， 通过编码耐热核酸酶的 nuc 基因的特 异扩增可鉴定金黄色葡萄球菌有非常好的特异性。 发明内容 ： 0004 本发明的目的是提供一种快速、 可靠、 灵敏度高、 特异性强的耐甲氧西林金黄色。
14、葡 萄球菌三重实时荧光 PCR 检测引物、 探针、 检测试剂盒和检测方法， 通过一次反应就能完成 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性检测， 还可检测 MRCNS 及甲氧西林敏感金黄色葡萄球 菌。 0005 本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测引物， 其特征在于， 所述的检测引物如下所示 ： 0006 针对 nuc 基因 ： 5-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3 ；（如 SEQ ID NO.1 所示） 0007 5-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3 ；（如 SEQ ID NO.2 所示） 0008 针对 mecA 基因 ： 5-GAAGGTG。
15、TGCTTACAAGTGC-3 ；（如 SEQ ID NO.3 所示） 0009 5-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3 ；（如 SEQ ID NO.4 所示） 说 明 书 CN 103421898 A 4 2/6 页 5 0010 针对 femA 基因 ： 5-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-3 ；（如 SEQ ID NO.5 所示） 0011 5-TCACTGGACCGCGATTTG-3 ；（如 SEQ ID NO.6 所示） 0012 本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测探针， 其特征在于， 所述的检测探针如下所示 ： 001。
16、3 nuc 基因的探针 ： 5-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3 ；（如 SEQ ID NO.7 所示） 0014 mecA基因的探针 ： 5-TTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCC-3 ；（如SEQ ID NO.8所示） 0015 femA 基因的探针 ： 5-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3 ；（如 SEQ ID NO.9 所示） 0016 探针的5端标记有荧光报告基团， 3端标记有荧光淬灭基团， 三探针的5端标记 的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。 0017 所述的荧光报告基团优选为 TET、 HEX 或 FAM， 所述的。
17、荧光淬灭基团优选为 BHQ1。 0018 本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测试剂盒， 包括实时荧 光定量 PCR 反应液、 耐热 DNA 聚合酶、 检测引物和检测探针， 其特征在于， 0019 所述的检测引物包括三对 ： 0020 针对 nuc 基因 ： 5-GATACACCTGAAACAAAGCATCC-3 ；（如 SEQ ID NO.1 所示） 0021 5-GACCTTTGTCAAACTCGACTTC-3 ；（如 SEQ ID NO.2 所示） 0022 针对 mecA 基因 ： 5-GAAGGTGTGCTTACAAGTGC-3 ；（如 SEQ ID NO.3 所。
18、示） 0023 5-TCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAA-3 ；（如 SEQ ID NO.4 所示） 0024 针对 femA 基因 ： 5-GCCACTATGAGTTAAAGCTTGC-3 ；（如 SEQ ID NO.5 所示） 0025 5-TCACTGGACCGCGATTTG-3 ；（如 SEQ ID NO.6 所示） 0026 所述的检测探针包括 ： 0027 nuc 基因的探针 ： 5-AGGTGTAGAGAAATATGGCCCTGAAGC-3 ；（如 SEQ ID NO.7 所示） 0028 mecA基因的探针 ： 5-TTATGGCTCAGGTACTGCTAT。
19、CCACCC-3 ；（如SEQ ID NO.8所示） 0029 femA 基因的探针 ： 5-ACGAGGTCATTGCAGCTTGCTTACT-3 ；（如 SEQ ID NO.8 所示） 0030 探针的5端标记有荧光报告基团， 3端标记有荧光淬灭基团， 三探针的5端标记 的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。 0031 本发明的非疾病的诊断和治疗目的的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光 PCR 检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 0032 （5） 对样品进行增菌培养， 提取增菌液中菌体的基因组 DNA 作为模板 ； 0033 （6） 使用上述针对 nuc 基因、 mecA 基因和 。
20、femA 基因的检测引物及其检测探针， 与 实时荧光 PCR 扩增用的反应液及耐热 DNA 聚合酶混合形成扩增反应体系 ； 0034 （7） 将扩增反应体系在荧光 PCR 仪上进行实时荧光 PCR 反应， 反应结束后， 根据 探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号， 读取并记录各检测样品的 PCR 扩增循环次数 （Ct） ； 0035 （8） 根据各样品的 Ct 值， 按照建立的判断标准， 判断样品中是否含有耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌。 0036 所述的步骤 （2） 的扩增反应体系优选为 ： 0037 说 明 书 CN 103421898 A 5 3/6 页 6 模板 DNA4L 10TaqMa。
21、n 缓冲液5L 5mmol/L MgCl22L 2.5mmol/L dNTPs3L 20mol/L TaqMan 探针三种探针各 1L（共 3L） 20mol/L 检测引物六条引物各 1L（共 6L） 0.55U UNG 酶0.2L 2.5U/L Taq 聚合酶3L 去离子水3.8L 0038 0039 所述步骤 （3） 的进行实时荧光 PCR 反应， 其反应参数优选为 ： 95 30s、 95 5s、 60 30s、 40 个循环。结果判断标准 ： 如果出现待测基因的扩增反应曲线， 且 Ct 值小于 35， 则判断为阳性， 如果 35Ct37， 判断为可疑， 可以加大模板量， 重复扩增， 如。
22、果得到相同的实 验结果， 则判断为阳性， 否则为阴性， 如果 Ct 值为 0 或 37， 则判断为阴性。 0040 本发明根据 nuc、 mecA 和 femA 基因序列分别设计引物和探针， 建立了基于 Taqman 探针三重荧光PCR检测MRSA的方法。 试验结果显示， MRSA扩增出nuc、 mecA和femA基因， 而 14 株表皮葡萄球菌等对照菌株未扩增出上述基因。基于 TaqMan 探针的最佳荧光 PCR 扩增 体系， 扩增效率应在 90% 105% 之间， 线性关系数 R2在 0.98 以上。本发明建立的三重荧光 PCR 扩增体系， nuc、 mecA 和 femA 的扩增效率均在。
23、 90% 以上， 线性关系数 R2均超过 0.99， 表 明设计的引物和探针特异性强、 体系的优化效果也较佳， 而且能检测 MRSA， 也可检测 MRCNS 及甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。 0041 本发明根据 nuc、 mecA 和 femA 基因序列分别设计引物和探针， 采用 blast 分析 扩增产物的序列特异性， 以保证无同源或序列一致性生物基因信息， 并充分考虑能否在同 一体系中扩增三个靶基因的特异性序列， 而进行精心优化和反复测试而获得本发明的检测 引物和检测探针， 利用该检测引物和检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光 PCR 检测， 在一次扩增反应中完成对待测样品的耐甲。
24、氧西林金黄色葡萄球菌的特异性检测， 从而简便、 快速、 准确的对待检样品中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行判断。 以本 发明的检测引物及探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光 PCR 检测， 检测快速， 8-10 小时可以完成从制备样品到出具检测结果的过程， 不受假阳性和交叉污染等干扰， 结 果可靠， 且灵敏度高、 特异性强， 为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行流行病学调查提供了有 利工具。适合于食品和水的检验、 疾病控制中心、 质量监督部门使用。 附图说明 ： 说 明 书 CN 103421898 A 6 4/6 页 7 0042 图 1 是实施例 1 的 MRSA 样品 Nuc、 me。
25、cA、 femA 基因三重荧光 PCR 扩增图 ； 0043 图 2 是 实 施 例 1 的 MRSA 梯 度 稀 释 三 重 荧 光 PCR 扩 增 图， 6 ： 2.2107cfu/ mL， 5 ： 2.2106cfu/mL， 4 ： 2.2105cfu/mL， 3 ： 2.2104cfu/mL， 2 ： 2.2103cfu/mL， 1 ： 2.2102cfu/mL。 具体实施方式 ： 0044 以下是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0045 一、 引物和探针的设计和合成。 0046 根据 GenBank 公布的金黄色葡萄球菌 nuc gene(GenBank:EF5296。
26、07.1)、 mecA gene(GenBa nk:JN108029.1) 和 femA gene(GenBank:DQ352463.1)， 用 NCBI 上的 BLAST 功 能和 DNAman 软件反复比对， 再用 Oligo5.0 软件设计引物和 TaqMan 探针， 委托宝生物工程 （大连） 有限公司合成， 引物和探针序列见表 1。 0047 表 1 ： 荧光 PCR 引物和探针序列 0048 0049 0050 nuc 探针 5 端标记 TET、 mecA 探针 5 端标记 HEX、 femA 探针 5 端标记 FAM， 3 端 标记有荧光淬灭基团 BHQ1。 0051 实施例 1 。
27、： 0052 将 MRSA 标准菌株 ATCC33591 接种到质量分数 7.5% 胰蛋白胨大豆肉汤， 37震荡 培养过夜。 取2mL培养物， 12000r/min离心3min去上清， 用1mL去离子水漂浮沉淀， 12000r/ min 离心 2min 去上清， 重复两次， 最后加 200L 去离子水在核酸提取仪上提取 DNA 用于荧 光 PCR 扩增。 0053 实时荧光PCR扩增体系 ： 反应体系30l， 模板DNA4l、 10TaqMan缓冲液5l、 5mmol/LMgCl22l、 2.5mmol/L dNTPs3l、 TaqMan 探 针 20mol/l 各 1l（包 括 femA、 。
28、说 明 书 CN 103421898 A 7 5/6 页 8 mecA、 nuc 基因的探针各 1l， 共 3l） 、 引物 20mol/l 各 1l（包括 femA、 mecA、 nuc 基 因的检测引物共 6 条引物， 共 6l） 、 UNG 酶 0.55U0.2l、 Taq 聚合酶 2.5U/l3l、 去离 子水 3.8l。实时荧光 PCR 反应参数为 95 30s、 95 5s、 60 30s、 40 个循环。 0054 检测结果如图 1 所示， 从图 1 中可以看出， 经本实施例的实时荧光 PCR 扩增， 同时 出现了 femA、 mecA、 nuc 基因扩增曲线， femA、 me。
29、cA、 nuc 三个扩增曲线指数期明显， 扩增曲 线之间互不干扰， ct 值为小于 35， 则判断为阳性， 表明测试菌株为耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌， 这与 MRSA 标准菌株 ATCC33591 的本身性质是相符的。由此表明本发明的测试方法是 可行的。 0055 经平板菌落计数， 原始浓度为 2.2107cfu/mL 的 MRSA 标准菌株 ATCC33591 培养 液， 进行 10 倍梯度稀释 , 从每个稀释度中取 1mL 培养液， 按照上述方法提取 DNA， 并且按照 上述方法中的三重荧光 PCR 反应体系进行荧光 PCR 扩增。实时荧光 PCR 仪上选择标准品模 式， 仪器自动绘制标准。
30、曲线。每个稀释液均用平板分离法进行对照。 0056 结果如图 2 和表 2 所示， MRSA 初始模板浓度与 Ct 值之间也出现良好的线性关系， femA、 mecA、 nuc 的线性系数为别为 0.999、 0.994、 0.998， 扩增效率分别为 104%、 90.3%、 98%， 最低检测浓度达到 220cfu/mL（图 2、 表 2） 。表明设计的引物和探针特异较高， 扩增体系优 化效果也较佳。 0057 表 2 ： 三重荧光 PCR 扩增体系评价 0058 0059 二、 特异性实验 0060 1、 特异性实验 1 ： 0061 阴性对照菌株 14 株， 分别为表皮葡萄球菌 AT 。
31、CC14990、 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102、 粪链球菌 ATCC2921、 阪崎肠杆菌 ATCC29544、 大肠杆菌 ATCC25922、 伤寒沙门 氏菌 CMCC50071、 鲍氏志贺氏菌 CMCC51582、 宋内氏志贺氏菌 CMCC51334、 痢疾志贺氏菌 NICPBP51252、 福氏志贺氏菌 NICPBP51571、 小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52221、 假结核耶尔 森氏菌 CMCC53510、 单增李斯特氏菌 ATCC19115、 藤黄微球菌 CMCC2800， 购自中国食品药品 检定所、 中国普通微生物菌种保藏中心。所有菌株经 VITEK2 进行确证。 006。
32、2 分别参照实施例 1 的方法对上述菌株提取 DNA， 再进行三重实时荧光 PCR 扩增。 0063 实时荧光PCR扩增体系 ： 反应体系30l， 模板DNA4l、 10TaqMan缓冲液5l、 5mmol/LMgCl22l、 2.5mmol/L dNTPs3l、 TaqMan 探 针 20mol/l 各 1l（包 括 femA、 mecA、 nuc 基因的探针各 1l， 共 3l） 、 引物 20mol/l 各 1l（包括 femA、 mecA、 nuc 基 因的检测引物共 6 条引物， 共 6l） 、 UNG 酶 0.55U0.2l、 Taq 聚合酶 2.5U/l3l、 去离 子水 3.8。
33、l。实时荧光 PCR 反应参数为 95 30s、 95 5s、 60 30s、 40 个循环。 说 明 书 CN 103421898 A 8 6/6 页 9 0064 结果显示上述 14 株阴性对照菌株扩增结果阴性。 0065 2、 特异性实验 2 ： 0066 临床分离的金黄色葡萄球菌 9 株， 由华南理工大学食品学院赠送 ； 不同食品中分 离的金黄色葡萄球菌 60 株， 是中国检验检疫科学研究院食品所和广东检验检疫技术中心 保存菌株。所有菌株经 VITEK2 进行确证。 0067 分别参照实施例 1 的方法对上述菌株提取 DNA， 再进行三重实时荧光 PCR 扩增。 0068 实时荧光PC。
34、R扩增体系 ： 反应体系30l， 模板DNA4l、 10TaqMan缓冲液5l、 5mmol/LMgCl22l、 2.5mmol/L dNTPs3l、 TaqMan 探 针 20mol/l 各 1l（包 括 femA、 mecA、 nuc 基因的探针各 1l， 共 3l） 、 引物 20mol/l 各 1l（包括 femA、 mecA、 nuc 基 因的检测引物共 6 条引物， 共 6l） 、 UNG 酶 0.55U0.2l、 Taq 聚合酶 2.5U/l3l、 去离 子水 3.8l。实时荧光 PCR 反应参数为 95 30s、 95 5s、 60 30s、 40 个循环。 0069 结果显示。
35、， 9 株临床分离的金黄色葡萄球菌扩增出 femA、 mecA 和 nuc 扩增曲线， 60 株食源性分离的金黄色葡萄球菌扩增出 femA 和 nuc 扩增曲线， 未扩增出 mecA 基因。69 株 分离株中 femA、 nuc 基因阳性率为 100%， mecA 基因阳性率为 13.04%。 0070 采用 NCCLS 推荐的琼脂平皿对倍稀释法。MIC 判定标准参照 NCCLS2004 常 规标准 ,MIC 2ug/mL 为甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌 (methicillin-sensitive Staphylococcus aureua,MSSA)， 苯唑西林 MIC 4ug/mL 者为。
36、甲氧西林耐药的金黄色葡萄 球菌(methicillin-r esistant Staphylococcus aureus,MRSA)， 其中MIC64ug/mL者为 高耐菌株。 0071 苯唑西林药敏结果， 69 株金黄色葡萄球菌分离株中， 9 株临床分离的金黄色葡萄 球菌 MIC 值在 23.70ug/mL 97.10ug/mL， 60 株食源性分离的金黄色葡萄球菌 MIC 值在 0.03 0.25ug/mL 之间。因此 , 耐甲氧西林的基因 mecA 与耐甲氧西林表型表型符合率为 100%。这个结果也与利用本发明的检测方法检测的结果一致。 说 明 书 CN 103421898 A 9 1/3 页 10 0001 序 列 表 CN 103421898 A 10 2/3 页 11 0002 0003 序 列 表 CN 103421898 A 11 3/3 页 12 序 列 表 CN 103421898 A 12 1/2 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 103421898 A 13 2/2 页 14 图 2 说 明 书 附 图 CN 103421898 A 14 。