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1、(10)申请公布号 CN 103421796 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103421796 A *CN103421796A* (21)申请号 201310348006.3 (22)申请日 2013.08.09 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 7/01(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 苏州吉凯基因科技有限公司 地址 215316 江苏省苏州市昆山市玉山镇北 门路 757 号 (72)发明人 曹跃琼 朱向莹 金杨晟 (74)专利代。
2、理机构 上海光华专利事务所 31219 代理人 张艳 (54) 发明名称 一种降低人 OPN 基因表达的 siRNA 及其相关 药物 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 针 对 人 OPN 基 因 用 于 肿 瘤 基 因 治 疗 的 短 的 干 扰 核 糖 核 酸 （shortinterferingRNA， siRNA） 。该 siRNA 使用 RNA 干扰技术， 利用短片段的双链 RNA 促使 OPN 基因的 mRNA 降解来高效、 特异的阻断该基因的表 达， 诱使细胞表现出 OPN 基因沉默的表型， 被研究 人员应用到疾病治疗领域。通过实验证明本发明 提供的OPN基因小干扰RN。
3、A， 能高效率地抑制靶细 胞中 OPN 基因的表达， 进而抑制肿瘤细胞的生长， 促进肿瘤细胞凋亡， 在肿瘤治疗中具有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103421796 A CN 103421796 A *CN103421796A* 1/1 页 2 1. 一种降低 OPN 基因表达的小干扰 RNA， 包括正义链和反义链， 序列如下 ： 正义链 ： 5 -CCAUUCUGAUGAAUCUGAUT。
4、T-3 SEQ ID NO:6 ； 反义链 ： 5 -AUCAGAUUCAUCAGAAUGGTT-5 SEQ ID NO:7。 2. 如权利要求 1 所示的小干扰 RNA， 其特征在于， 所述小干扰 RNA 针对的 OPN 基因 RNA 干扰靶序列如 SEQ ID NO:1 所示。 3. 一种降低 OPN 基因表达的 shRNA， 所述 shRNA 包括正义链片段和反义链片段， 以及连 接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构， 所述正义链片段和所述反义链片段的序列互 补， 并且所述正义链片段含有 SEQ ID NO ： 6 所示序列的核苷酸片段。 4.一种OPN基因干扰慢病毒载体， 含有编码权。
5、利要求3所述降低OPN基因表达的shRNA 的基因片段， 能表达所述 shRNA， 并剪切获得如 SEQ ID NO ： 6-7 所示序列的 siRNA。 5. 一种 OPN 基因干扰慢病毒， 由权利要求 4 所述 OPN 基因干扰慢病毒载体在慢病毒包 装质粒、 细胞系的辅助下， 经过病毒包装而成。 6. 权利要求 1-2 任一权利要求所述降低 OPN 基因表达的小干扰 RNA、 权利要求 3 所述 降低OPN基因表达的shRNA、 权利要求4所述OPN基因干扰慢病毒载体以及权利要求5所述 OPN 基因干扰慢病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。 7. 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 所述。
6、抗肿瘤药物为胃癌治疗药物。 8. 一种胃癌治疗药物， 其有效成分为权利要求 1 或 2 任一权利要求所述降低 OPN 基因 表达的 siRNA。 9. 一种用于治疗胃癌的药物组合物， 其有效物质含有权利要求 1-2 任一权利要求所述 降低 OPN 基因表达的小干扰 RNA， 权利要求 3 所述降低 OPN 基因表达的 shRNA， 以及权利要 求 5 所述 OPN 基因干扰慢病毒中的至少一种。 权 利 要 求 书 CN 103421796 A 2 1/5 页 3 一种降低人 OPN 基因表达的 siRNA 及其相关药物 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种降低人 OPN 。
7、基因表达的小分子干扰核糖 核酸 （siRNA） 及其相关药物。 背景技术 0002 RNAi 的高度特异性和相对宽松的设计条件， 使 RNAi 不仅可以应用于基因功能研 究， 更广泛的， RNAi 将被应用到基于基因组序列的核酸药物研究和药物靶标验证中。 0003 截止 2000 年末， 共计 215 个基于基因水平治疗的药物在研， 其中 87 个为基因治疗 药物， 62 个 DNA 疫苗， 35 个为针对 RNA 的反义核酸和核酶。具体数据见下表 ： 0004 0005 截止 2000 年底， 基于基因组的在研药物分布表 0006 由上表可见， RNA 攻击核酸制药迄今为止是以反义核酸为主，。
8、 核酶技术为辅的一个 领域。1997 年 ISIS 制药公司的抗病毒反义核酸药物在美国医药食品管理局的批准， 为反 义核酸药物的发展提供了先例。 今年高等动物功能基因组研究正在以更快的速度为反义核 酸药物的发展提供靶基因， 使反义核酸药物的适用范围从癌症向传染病， 心血管疾病， 炎症 及自身免疫等多方面扩张。2001 年 8 月 ISIS 将蛋白激酶 C 的反义核酸药物以 2 亿美元的 高价转让给大制药公司 Elililly， 2002 年 4 月， 世界第二大反义核酸药物公司 Genta 将其 bcl-2 的反义核酸药物以 4.8 亿美元的高价转让给大制药公司 Aventis 标志了反义核酸。
9、药 物的发展走向成熟并进入制药业的主流。这不仅是反义核酸的成功， 而更重要的是 RNA 攻 击为手段的制药思路和领域的成功。与反义核酸药物相比， siRNA 在体外显示出了非常优 越的性质。SiRNA 和非常好的反义核酸对基因表达抑制都可以达到 80-90% 以上， 但筛选这 样的 siRNA 要相对容易的多。而且， 达到同样水平的表达抑制所需的 siRNA 比反义核酸浓 度低 10-100 倍。不仅如此， siRNA 对基因表达抑制的有效时间也比反义核酸有较大的延长 （从 2 天延长到 5-7 天） 。SiRNA 在体外显示的这些优越性性质， 如果能在 RNA 攻击制药中体 说 明 书 CN。
10、 103421796 A 3 2/5 页 4 现出来， 将为这一领域注入强大的生命力和价值。从哲学的角度， siRNA 这一有效的基因操 作手段和 RNA 攻击这一成熟的制药领域的结合是不可避免的。 0007 siRNA 一旦进入制药， 首先在病毒性传染病如 HIV 和癌症如白血病的治疗方面形 成巨大的经济效益。中国在这两个方面有以百亿的市场， 世界在癌症和病毒性传染病的治 疗方面在存在大的空白， siRNA 的介入可以产生很好的社会作用。如果中国在这一领域实 现突前发展， 对提高我国制药业在加入 WTO 后的竞争力有重要意义。 发明内容 0008 本发明的目的在于提供一种针对人 OPN 基因。
11、， 能抑制人 OPN 基因表达的 siRNA 用 于肿瘤基因治疗， 来抑制肿瘤细胞的生长， 促进肿瘤细胞凋亡。 0009 本发明首先提供了一种降低 OPN 基因表达的小干扰 RNA （siRNA） ， 包括正义链和反 义链， 序列如下 ： 0010 正义链 ： 5 -CCAUUCUGAUGAAUCUGAUTT-3 （SEQ ID NO:6） ； 0011 反义链 ： 5 -AUCAGAUUCAUCAGAAUGGTT-5 （SEQ ID NO:7） 。 0012 进一步的， 本发明所述小干扰RNA针对的OPN基因RNA干扰靶序列如SEQ ID NO:1 所示。 0013 本发明第二方面公开了一种。
12、降低OPN基因表达的shRNA， 所述shRNA包括正义链片 段和反义链片段， 以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构， 所述正义链片段和 所述反义链片段的序列互补， 并且所述正义链片段含有 SEQ ID NO ： 6 所示序列的核苷酸片 段。 0014 进一步的， 所述降低 OPN 基因表达的 shRNA 可剪切成含有如 SEQ ID NO ： 6 所示正 义链以及 SEQ ID NO ： 7 所示反义链的 siRNA。 0015 优选的， 所述茎环结构的序列可选自以下任一 ： UUCAAGAGA、 AUG、 CCC、 UUCG、 CCACC、 CTCGAG、 AAGCUU 和 CCA。
13、CACC。 0016 本发明第三方面公开了一种 OPN 基因干扰慢病毒载体， 含有编码前述降低 OPN 基 因表达的 shRNA 的基因片段， 能表达所述 shRNA， 并剪切获得如 SEQ ID NO ： 6-7 所示序列的 siRNA。 0017 所述 OPN 基因干扰慢病毒载体是将编码前述 OPN 基因 shRNA 的 DNA 片段克隆入已 知载体获得， 所述已知载体多为慢病毒载体， 所述 OPN 基因干扰慢病毒载体经过病毒包装 成为有感染力的病毒颗粒后， 感染肿瘤细胞， 进而转录出所述 shRNA， 通过酶切加工等步骤， 最终获得所述 OPN 基因小干扰 RNA， 用于特异性沉默 OP。
14、N 基因的表达。 0018 进 一 步 的，所 述 慢 病 毒 载 体 可 以 选 自 ： pLKO.1-puro、 pLKO.1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、 pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、 pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、 pLKO-pur。
15、o-IPTG-1xLacO、 pLKO-puro-IPTG-3xLacO、 pLP1、 pLP2、 pLP/VSV-G、 pENTR/U6、 pLenti6/BLOCK-iT-DEST、 pLenti6-GW/U6-laminshrna、 pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、 pLenti6.2/ N-Lumio/V5-DEST、 pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。 0019 本发明第四方面公开了一种 OPN 基因干扰慢病毒， 由前述 OPN 基因干扰慢病毒载 说 明 书 CN 103421796 A 4 3/5 页 5 体在慢病。
16、毒包装质粒、 细胞系的辅助下， 经过病毒包装而成。 0020 本发明第五方面公开了前述降低OPN基因表达的小干扰RNA、 降低OPN基因表达的 shRNA、 OPN 基因干扰慢病毒载体以及 OPN 基因干扰慢病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。 0021 优选的， 所述抗肿瘤药物为胃癌治疗药物。 0022 本发明第六方面公开了一种胃癌治疗药物， 其有效成分为前述降低 OPN 基因表达 的 siRNA。 0023 本发明最后公开了一种用于治疗胃癌的药物组合物， 其有效物质含有前述降低 OPN基因表达的小干扰RNA， 降低OPN基因表达的shRNA， 以及OPN基因干扰慢病毒中的至少 一种。 0024 。
17、进一步的， 本发明所述药物或药物组合物含有 1 99wt% 所述小干扰 RNA、 shRNA、 基因干扰核酸构建体和 / 或基因干扰慢病毒， 以及药学上可接受的载体、 稀释剂或赋形剂。 0025 制备药物时， 通常将有效成分与赋形剂混合， 或用赋形剂稀释， 或包在可以胶囊或 药囊形式存在的载体中。 当赋形剂起稀释剂作用时， 它可以是固体、 半固体或液体材料作为 赋形剂、 载体或活性成分的介质。因此， 组合物可以是片剂、 丸剂、 粉剂、 溶液剂、 糖浆剂、 灭 菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括 : 乳糖、 葡萄糖、 蔗糖、 山梨醇、 甘露醇、 淀粉、 微晶 纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、 纤维素。
18、、 水等。 制剂还可包括 ： 湿润剂、 乳化剂、 防腐剂(如羟基苯 甲酸甲酯和丙酯 )、 甜味剂等。 0026 本发明的所述抑制人OPN基因表达的siRNA， 通过人工合成或/和质粒载体表达形 成， 其生产和制备属于现有技术。 0027 本发明提供的 siRNA 能特异性抑制 OPN 基因的表达， MTT 分析实验结果表明本 siRNA 能抑制胃癌细胞的增殖。该 siRNA 及其表达载体可用于制备高效、 特异性强、 副作用 小的抗肿瘤药物。 附图说明 0028 图 1 ： RT-PCR 检测 siRNA 对 OPN 基因的沉默效率 0029 图 2 ： MTT 分析 siRNA 对胃癌 SGC。
19、7901 细胞生长的影响 具体实施方式 0030 下面结合实施例进一步阐述本发明。 应理解， 实施例仅用于说明本发明， 而非限制 本发明的范围。 实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条 件， 如 美 Sambrook.J 等著 ； 黄培堂等译。分子克隆试验指南， 第三版。北京 ： 科学出版社 2002 中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。 0031 实施例 1 抑制人 OPN 基因表达的 siRNA 序列的合成 0032 从 Genebank 调取 OPN 基因 (NM_00582.2) 信息， 用吉凯基因的设计软件设计针对 OPN 基因设计可能有效的 siR。
20、NA 靶点， 筛选得到最有效的 siRNA。筛选的 siRNA 靶点序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 （5 -CCATTCTGATGAATCTGAT-3 ） ， 针对该靶点设计的 OPN-siRNA 序列如 下 ： 0033 正义链 ： 5 -CCAUUCUGAUGAAUCUGAUTT-3 （SEQ ID NO ： 6） ； 0034 反义链 ： 5 -AUCAGAUUCAUCAGAAUGGTT-3 （SEQ ID NO ： 7） 。 说 明 书 CN 103421796 A 5 4/5 页 6 0035 选取与基因组中的任何序列都没有连续 16 个碱基的同源性的靶序列作为阴性对 照 。
21、NC， 具体序列如下 ： 0036 正义链序列 ： 5 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 （SEQ ID NO ： 8） ； 0037 反义链序列为 ： 5 -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 （SEQ ID NO ： 9） 0038 所述 OPN-siRNA 和 NC 序列中的 A、 G、 C、 U 分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、 鸟嘌呤核 糖核苷酸、 胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸， T 表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。 0039 序列设计好后由上海吉凯基因化学技术有限合成， 本发明实用的 siRNA 双链的纯 度大于 99%。用 DEPC 处理过的双蒸水溶解， 就可。
22、直接用于转染。 0040 实施例 2 实时荧光定量 RT-PCR 法检测 siRNA 对 OPN 基因的沉默效率 0041 使 用 Invitrogen 的 lipofectamine2000 脂 质 体 进 行 转 染， 所 有 操 作 均 按 Invitrogen提供的操作规程。 将处于对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞进行胰酶消化， 制 成细胞悬液 （细胞数约为 5104/ml） 接种于 6 孔板中， 培养至细胞融合度达到约 40% 即可 用于转染。将 siRNA 粉末溶解于无 RNA 酶的无菌水中， 配置终浓度为 20pmol/L 的 siRNA 溶 液。 0042 转染时， 分别。
23、取 10uL 的上述 siRNA 溶液和 5uL 的 lipofectamine2000 分别稀释 于 250uL 无血清培养液 （Opti-MEM） 中， 并在室温下孵育 5 分钟， 然后将上述 siRNA 溶液和 lipofectamine2000 溶液混合， 复合物与室温下静置 20 分钟后， 把 500uL 的 siRNA- 脂质体 复合物与 1.5mL 无血清 DMEM 培养基混合后， 加到细胞培养板中， 6 小时后换为 1-%FBS-DMEM 培养基， 于 48 小时后收集细胞进行 RT-PCR 检测。根据 Invitrogen 公司的 Trizol 操作说 明书， 抽提总 RNA。
24、。根据 Promega 公司的 M-MLV 操作说明书， 将总 RNA 逆转录获得 cDNA（逆 转录反应体系见表 1， 42反应 1h， 然后在 70水浴锅中水浴 10min 使逆转录酶失活） 。 0043 采用 TP800 型 Real time PCR 仪 （TAKARA） 进行实时定量检测。OPN 基因的引物如 下 ： 0044 上游引物 5 -GTTATGAAACGAGTCAGCTG-3 （SEQ ID NO ： 2） ； 0045 下游引物 5 -TTAATTGACCTCAGAAGATG-3 （SEQ ID NO ： 3） 。 0046 以管家基因-actin为内参， 内参引物序列。
25、如下， 按表2中的比例配置反应体系。 0047 上游引物 ： 5 -AGCGGGAAATCGTGCGTG-3 （SEQ ID NO ： 4） ； 0048 下游引物 ： 5 -AGGGTACATGGTGGTGCC-3 （SEQ ID NO ： 5） 。 0049 表 1 逆转录反应体系 0050 试剂体积 (l) 5RT buffer4.0 10mM dNTPs2.0 RNasin0.5 M-MLV-RTase1.0 说 明 书 CN 103421796 A 6 5/5 页 7 DEPC H2O3.5 Total11.0 0051 表 2 Real-time PCR 反应体系 0052 试剂体。
26、积 (l) SYBR premix ex taq:10.0 上游引物 （2.5M） ：0.5 下游引物 （2.5M） ：0.5 cDNA1.0 ddH2O8.0 Total20.0 0053 PCR扩增程序为设定程序为两步法Real-time PCR ： 预变性95， 15s ； 之后每一步 变性95， 5s ； 退火延伸54， 30s ； 共进行45个循环。 每次在延伸阶段读取吸光值。 PCR结 束后， 95变性 1min， 然后冷却至 55， 使 DNA 双链充分结合。从 55开始到 95， 每一步 增加0.5， 保持4s,同时读取吸光值， 制作熔解曲线。 采用2-Ct分析法计算OPN m。
27、RNA 的表达丰度。与转染了阴性对照 siRNA （Scr-siRNA） 的细胞比较， 实验组中人胃癌 SGC-7901 细胞的 OPN mRNA 表达水平下降了 85.6%， 结果如图 1 所示。 0054 实施例 3 MTT 法分析 siRNA 对胃癌 SGC-7901 细胞生长的影响 0055 将处于对数生长期的 SGC-7901 细胞接种于 24 孔板中， 培养至细胞融合度达到约 40%， 进行细胞转染 （转染操作同前） 。 转染后于37， 5%CO2条件下培养2472小时， 于结束 前4h加入MTT 10uL/孔 （浓度为5mg/mL） ， 继续培养4h后弃上清液， 加入二甲基亚砜 。
28、（DMSO） 100uL/ 孔， 于振荡器上震荡 10min 左右， 酶标仪 490/750nm 检测 OD 值。以转染了阴性对照 siRNA 的 SGC7901 细胞作为阴性对照， 以未加任何小干扰 RNA 处理的 SGC-7901 细胞作为空 白对照， 检测结果见图 2。 0056 图 2 结果显示， 与转染阴性对照 siRNA 组相比， 转染 OPN-siRNA 后 SGC-7901 细胞 增殖速度显著降低， 提示 siRNA 可抑制 SGC-7901 细胞的生长。 说 明 书 CN 103421796 A 7 1/5 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103421796 A 8 2/5 页 9 0003 序 列 表 CN 103421796 A 9 3/5 页 10 0004 序 列 表 CN 103421796 A 10 4/5 页 11 0005 序 列 表 CN 103421796 A 11 5/5 页 12 序 列 表 CN 103421796 A 12 1/1 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103421796 A 13 。