编码新胞子虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶的DNA 本发明属于动物健康领域，涉及疫苗组合物和疾病诊断方法。更具体地说，本发明涉及含有编码新胞子虫(Neospora)二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子，该多核苷酸分子在抗新胞子虫病(neosporosis)的疫苗生产中是很有用的，并可用作诊断试剂。
新胞子虫是动物的一种病原性原生动物寄生虫，已发现它是导致哺乳动物流产、新生儿死亡、先天性感染和脑炎疾病的主要原因(Dubey和Lindsay,1996，兽医寄生虫学,67:1-59；Dubey和Lindsay,1993，今日寄生虫学，9:452-458)。N.caninum(Neospora caninum)可感染狗，并可先天性地感染小狗，通常会导致瘫痪。已经从天然感染的小狗内分离出了N.caninum的速殖体(Lindsay和Dubey,1989，寄生虫学杂志，75:163-165)。新胞子虫是导致奶牛场中牛流产的主要原因。在山羊、绵羊和马中也已有新胞子虫相关性疾病即新胞子虫病病例的报道。
尽管N.caninum表面上看起来与病原鼠弓形体(Toxoplasmagondii)类似，但N.caninum与鼠弓形体在抗原性和超微结构方面都互不相同(Dubey和Lindsay,1993，文献同上)。另外，从流产的牛胎儿脑中分离出的并在体外持续培养的新胞子虫样原生动物寄生虫与鼠弓形体和Hammondia hammondi在抗原性和超微结构方面都存在明显差异，而与N.caninum最为相似(Conrad等，1993，寄生虫学，106:239-249)。而且，对核小亚基核糖体RNA基因的分析结果表明分离自牛和狗的新胞子虫株系之间无核苷酸差异，但新胞子虫和鼠弓形体之间存在一致的差异(Marsh等，1995，寄生虫学杂志，81:530-535)。
已经证实新胞子虫牛分离物在牛流产和先天性疾病中具有黄化作用(Barr等，1994，兽医诊断与研究杂志，6:207-215)。利用感染有N.caninum的近交BALB/c小鼠已建立了中枢神经系统新胞子虫病的啮齿类动物模型(Lindsay等，1995，寄生虫学杂志，81:313-315)。另外，分别由Cole等，1995，寄生虫学杂志，81:730-732，及Long等，1996，寄生虫学杂志，82:608-611描述了用于研究远交和近交孕鼠中N.caninum地跨胎盘传播的模型。而且，已证实N.caninum矮小山羊实验模型与天然获得的新胞子虫诱导性牛流产非常相似(Lindsay等，1995，美国兽医研究杂志，56:1176-1180)。
在原生动物如鼠弓形体和新胞子虫中，已知必需的代谢酶类：二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷酸合成酶(TS)位于同一蛋白质分子内两个不同的酶促结构域即“DHFR结构域”和“TS结构域”中。据报道，鼠弓形体中DHFR和TS结构域由一个约70个氨基酸的连接区所隔离(Roos,1993，生物化学杂志，162:6269-6280)。至少在一种寄生虫种类中已将此双功能蛋白质用作缺失靶点以产生弱毒株系而用于活体疫苗中。因此，Titus等，1995，美国国家科学院院报，92:10267-10271描述了通过同源重组对来源于原生动物寄生虫大型利什曼原虫的DHFR-TS基因进行定位缺失，以产生DHFR-TS-无效突变体细胞从而用于抗大型利什曼原虫强致病株的疫苗中。
本发明提供了含有编码新胞子虫DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。在一个优选实施方案中，该新胞子虫DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No.209512)内的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。在一个非限制性的实施方案中，该分离的多核苷酸分子含有所说的新胞子虫DHFR-TS基因的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，含有新胞子虫DHFR-TS基因的核苷酸序列的该分离的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:1中从大约第2405nt至大约第8199nt的核苷酸序列，或与存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。在另一个非限制性的实施方案中，所述编码DHFR-TS蛋白的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
本发明还提供了与含有一定核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的分离的多核苷酸分子，其中所说的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DHFR-TS基因从大约第2405nt至大约第8199nt的核苷酸序列，或存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No.209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
本发明还提供了含有编码与新胞子虫DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸分子，其中所述新胞子虫DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
本发明还提供了由任一种前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子。在一个优选实施方案中，所述多核苷酸分子由编码任一种前述新胞子虫DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段(如由DHFR-TS蛋白的DHFR结构域或TS结构域所组成的多肽)的核苷酸序列所组成。
除了任一种前述DHFR-TS相关性多核苷酸分子的核苷酸序列外，本发明的多核苷酸分子还含有或其组成可为N.caninum中DHFR-TS基因原位天然侧翼的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示的旁侧核苷酸序列或其部分。
本发明还提供了用于克隆和表达本发明的多核苷酸分子的组合物和方法，包括诸如克隆载体、表达载体，以及含有所述载体的转化宿主细胞。在一个非限制性的实施方案中，本发明提供了含有具N.caninum NC-1株系的DHFR-TS基因的核苷酸序列的多核苷酸分子的克隆载体，如命名为λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的λ噬菌体克隆载体。
本发明还提供了含有新胞子虫DHFR-TS蛋白的氨基酸序列的部分或基本上纯化好的蛋白质。在一个非限制性的实施方案中，所述蛋白质含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)内的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。本发明还提供了与新胞子虫DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽。本发明还提供了任一种前述蛋白或多肽的肽片段(如由分离的新胞子虫DHFR或TS结构域所组成的多肽)。
本发明还提供了可抗新胞子虫DHFR-TS蛋白或可抗所述蛋白质的肽片段的抗体。
本发明还提供了含有任一种前述多核苷酸分子的遗传构建体，该多核苷酸分子比如是含有SEQ ID NO:1中从大约第2405nt至大约第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列或存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)中的核苷酸序列的多核苷酸分子；或者是由任一种所述核苷酸序列的基本部分的核苷酸序列所组成，但已被修饰而在其中具有一个或多个核苷酸缺失、插入和/或取代的多核苷酸分子，或是含有N.caninum中DHFR-TS原位天然侧翼的一种或多种核苷酸序列的多核苷酸分子，从而一旦该多核苷酸分子插入于野生型DHFR-TS基因中或用于取代其中一部分时，所产生的修饰型DHFR-TS基因序列将编码部分无效或完全无效的蛋白质，或者根本不编码或产生任何蛋白质。这类遗传构建体可有效用于产生修饰型新胞子虫细胞，这种细胞中DHFR-TS基因或其中一部分已被部分或全部失活，导致产生的细胞表现出dhfr-或ts-或dhfr--ts-突变体表型(本文此后总称为dhfr--ts-表型)。
本发明还提供了经修饰的活新胞子虫细胞，其天然DHFR-TS基因或其中一部分已被部分或完全失活。在一个优选实施方案中，由于新胞子虫细胞与本发明的遗传构建体之间发生了同源重组，导致DHFR-TS基因的破坏，从而使该细胞表现dhfr--ts-突变体表型。在保护哺乳动物以抗新胞子虫病的疫苗组合物中，这类经修饰的活新胞子虫细胞具有很大的用处。本发明还提供了所述经修饰的活新胞子虫细胞的制备方法。
本发明还提供了抗新胞子虫病的疫苗，其中含有免疫有效量的本发明经修饰的活新胞子虫细胞，以及兽医可接受性载体。本发明还提供了保护哺乳动物以抗新胞子虫病、以及任选地一种或多种会折磨哺乳动物的其它疾病或病理状态的联合疫苗，这种联合疫苗含有免疫有效量的第一组分、免疫有效量的第二组分以及兽医可接受性载体，其中所说的第一组分含有本发明经修饰的活新胞子虫细胞，所说的第二组分可引发对折磨哺乳动物的疾病或病理状态的保护性反应。本发明还提供了本发明的疫苗的制备方法，包括联合使用免疫有效量的本发明经修饰的活新胞子虫细胞和兽医可接受性载体。本发明还提供了对哺乳动物进行疫苗接种以抗新胞子虫病的方法，包括对哺乳动物施用本发明的疫苗。
本发明还提供了用于对哺乳动物进行疫苗接种以抗新胞子虫病的试剂盒，其中包括两种容器：第一种容器中具有含免疫有效量的本发明经修饰的活新胞子虫细胞的组合物，第二种容器中具有兽医可接受性载体或稀释剂。
编码新胞子虫DHFR-TS的多核苷酸分子
本发明提供了：(ⅰ)含有编码新胞子虫DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子，包括含有新胞子虫DHFR-TS基因的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子；(ⅱ)与前述任一种多核苷酸分子基本上同源的分离的多核苷酸分子；(ⅲ)含有编码与新胞子虫DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子；以及(ⅳ)由任一种前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子，包括由编码任一种前述新胞子虫DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子。
如本文所用，术语“基因”、“多核苷酸分子”、“核苷酸序列”、“编码序列”和“编码区”意指包括单链或双链的DNA和RNA分子。也如本文所用，术语“基因”、“编码序列”和“编码区”意指与适当的调控元件有效相连时，能在宿主细胞表达系统中转录并翻译(DNA)成或翻译(RNA)成下述多肽或肽的多核苷酸分子；新胞子虫DHFR-TS蛋白，或与新胞子虫DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽，或前述新胞子虫DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段。该多核苷酸分子可包括但不限于一种或多种原核序列、真核序列、cDNA序列、基因组DNA序列(外显子或内含子)，以及化学合成的DNA和RNA序列，或上述序列的任意组合。
本发明的分离的多核苷酸分子可具有来源于新胞子虫任一种或株系的核苷酸序列，但优选来源于新胞子虫的病原性种类如N.caninum。可用于分离或衍生本发明的多核苷酸分子的N.caninum株系的一个非限制性实例是NC-1株系，该株系存在于宿主MARC-145猴肾细胞，以NO.CRL-12231保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),12301Parklawn Drive,Rockville,MD20852,USA。Dubey等，1988，美国兽医医学协会杂志(J.Am.Vet.Med.Assoc.)，193:1259-63中也记载了NC-1株系，该出版物引入本文作为参考。或者可利用常规分离技术如上述出版物中所记载的那些技术，从被感染动物的器官、组织或体液中分离出可用于实施本发明的新胞子虫病原性株系或品种。
本发明提供了含有编码新胞子虫DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。在一个优选实施方案中，该新胞子虫DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或含有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。在一个非限制性的实施方案中，该分离的多核苷酸分子含有新胞子虫DHFR-TS基因的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，该分离的多核苷酸分子含有N.caninum NC-1株系的DHFR-TS基因的核苷酸序列，该核苷酸序列含有SEQ ID NO:1中约第2405nt至约第8199nt的核苷酸序列，或含有与存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。SEQ ID NO:1中，由约第2405nt至约第4664nt间的核苷酸序列编码DHFR-TS基因推断的DHFR结构域，由约第4665nt至约第8199nt之间的核苷酸序列编码DHFR-TS基因推断的TS结构域。在另一个非限制性的实施方案中，编码DHFR-TS蛋白的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列，其中由约第1nt至约第969nt编码推断的DHFR结构域，由约第970nt至约第1836nt编码推断的TS结构域。
本发明还提供了与含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的分离的多核苷酸分子：SEQ ID NO:1中从大约第2405nt至大约第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQID NO:2的核苷酸序列。术语“基本上同源”用于指DHFR-TS相关性多核苷酸分子时，是指具有下述核苷酸序列的多核苷酸分子：(a)与下述核苷酸序列编码相同蛋白质的核苷酸序列：SEQ ID NO:1中从大约第2405nt至大约第8199nt的DHFR-TS基因或存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或由于遗传密码的简并性而在核苷酸序列中发生了一个或多个沉默改变的SEQ ID NO:2的核苷酸序列；或是(b)在中度严格条件下即在65℃、于0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中对结合于滤膜上的DNA进行杂交，在0.2×SSC/0.1％SDS中，42℃下洗涤(参见Ausubel等(编)，1989，分子生物学现代方法，第1卷，Green PublishingAssociates,Inc.，和John Wiley & Sons,Inc.,New York，第2.10.3页)的条件下，跟具有与下述核苷酸序列编码相同蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸分子的互补体可杂交、并可用于实施本发明的核苷酸序列：SEQ IDNO:1中大约第2405nt至大约第8199nt的DHFR-TS基因或存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，所述基本上同源的多核苷酸分子在高度严格条件下即在65℃下，0.5MNaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中对结合于滤膜上的DNA进行杂交，在68℃下，0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，出处同前)的条件下，跟具有与下述核苷酸序列编码相同蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸分子的互补体可杂交，并可用于实施本发明：SEQ ID NO:1所示大约第2405nt至大约第8199nt的DHFR-TS基因或存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
如本文所用，多核苷酸分子“可用于实施本发明”是指如下文4.4所述，可将该多核苷酸分子用作诊断试剂以检测来自新胞子虫感染动物的体液或组织样品中新胞子虫特异性多核苷酸的存在，或者可利用该多核苷酸分子构建遗传构建体以有效用于制备本发明经修饰的活新胞子虫细胞。
本发明的基本上同源的多核苷酸分子不包括具有编码鼠弓形体来源的DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子。
本发明还提供了含有编码与新胞子虫DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸分子，所述新胞子虫DHFR-TS具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。如本文所用，涉及多肽时，术语“基本上同源”是指具有下述氨基酸序列的多肽：(a)与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或具有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列优选有至少约70％、更优选有至少约80％、最优选有至少约90％相同的氨基酸序列，并且该基本上同源的多肽可有效用于实施本发明；和/或(b)其内存在于新胞子虫DHFR-TS蛋白中的一个或多个氨基酸残基已由不同的氨基酸残基保守取代的氨基酸序列，该多肽可有效用于实施本发明，所述新胞子虫DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)内的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。
保守氨基酸取代在本领域中是众所周知的。比如，有理由预计，可利用具有相似电荷、大小或极性的氨基酸残基保守地取代新胞子虫DHFR-TS蛋白的一个或多个氨基酸残基，所获得的多肽在实施本发明时仍是有用的。设计这类取代的规则包括由Dayhof,M.D.,1978，国家生物医学研究基金(Nat.Biomed.Res.Found.),Washington,D.C.，第5卷，Sup.3等所描述的那些规则。更具体地说，保守氨基酸取代是通常在其侧链上相关的一个氨基酸家族内发生的那些取代。通常将遗传编码的氨基酸分为四组：(1)酸性氨基酸——天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性氨基酸——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不带电的极性氨基酸——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。也可将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归类为芳族氨基酸。在任一特定组内发生的一个或多个替换，如由异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、由谷氨酸取代天冬氨酸、由丝氨酸取代苏氨酸，或由结构相关性氨基酸残基取代任一种其它氨基酸残基，通常不会显著影响所得多肽在实施本发明过程中的有效性。
如本文所用，若蛋白质或多肽可用于包括下述任意一种或多种用途，如可用于筛选特异地定向于新胞子虫DHFR-TS蛋白的两个酶促结构域之一的抑制性试剂，或可用于产生抗完整蛋白或其内两个酶促结构域之一的抗体，则将该蛋白质或多肽视为“在实施本发明过程中是有用的”。
本发明还提供了由任一种前述多核苷酸分子的“基本部分”的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子。如本文所用，任一种前述多核苷酸分子的“基本部分”意指一种多核苷酸分子，其组成少于特定的DHFR-TS相关性多核苷酸分子的完整核苷酸序列、但含有DHFR-TS相关性多核苷酸分子之核苷酸序列的至少约30％、更优选至少约50％，并在实施本发明过程中有用处，如上述定义多核苷酸分子的有用处一样。在一个优选实施方案中，该多核苷酸分子具有的核苷酸序列编码任一种前述新胞子虫DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段，如由DHFR-TS蛋白的DHFR结构域或TS结构域所组成的多肽。如本文所用，术语“肽片段”是指由新胞子虫DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的全部氨基酸序列的一个或多个亚序列所组成的多肽，这些亚序列在长度上短于全长分子，并且由此产生的肽片段在实施本发明过程中是有用处的，如上述定义多肽的有用处一样。因此，若全长分子具有“n”个氨基酸残基，那么其肽片段可以是小于全长序列的任一种多肽，包括具有n-1个氨基酸残基的多肽，并且这类多肽在本发明实施过程中是有用处的。优选本发明的肽片段长度至少大约10个氨基酸残基。在一个非限制性的实施方案中，该肽片段由新胞子虫DHFR-TS蛋白的DHFR结构域或TS结构域所组成。
若肽片段由DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的一个以上亚序列所组成，则可优化编码该肽片段的多核苷酸分子以将全长蛋白或多肽中相应的不连续亚序列归于一处并使它们在肽片段中互相连续。另外，可优化编码肽片段的多核苷酸分子使含有肽片段的不同亚序列之间相对排列的次序与全长蛋白或多肽有所不同，或使所编码的肽片段含有多拷贝的特定亚序列。例如，该多核苷酸分子可编码多拷贝的DHFR结构域或TS结构域，选自其中的表位区，或其组合。
本发明除包括编码大于天然蛋白的多肽包括长度达到大约2n的多肽的多核苷酸之外，还包括编码全长(n)多肽的多核苷酸分子，该多肽中天然蛋白质的亚序列已互相发生了重排。这类多肽可含有多拷贝的完整蛋白质、单个结构域、表位区或它们的某种组合。
除了任一种前述的DHFR-TS相关性多核苷酸分子的核苷酸序列外，本发明的多核苷酸分子还可含有或者组成为选自N.caninum的DHFR-TS基因原位天然旁侧序列如SEQ ID NO:1所示的旁侧核苷酸序列或其部分的一种或多种核苷酸序列。
本发明的多核苷酸分子的序列还为构建寡核苷酸分子提供了必要的信息，所述寡核苷酸分子可在扩增技术中用作引物或在差异疾病诊断中用作探针，根据本文的公开内容，本领域技术人员可很方便地设计出来。优选这类寡核苷酸长度至少约15个核苷酸。利用恰当设计的寡核苷酸，通过应用标准技术如聚合酶链反应(PCR)可进行扩增。Innis等(编)，1995,PCR策略，Academic Press,Inc.,San Diego；和Erlich(编)，1992,PCR技术，牛津大学出版社，纽约等出版物中记载了聚合酶链反应，这些出版物引入本文作为参考。进行诊断时，可将本发明的寡核苷酸用于PCR扩增中以检测动物组织或体液样品中新胞子虫特异性多核苷酸分子的存在，这类样品的例子包括诸如脑组织、肺组织、胎盘组织、血液、脑脊髓液、粘液、尿液、羊水等。特异性扩增产物的存在可支持已发生新胞子虫感染的诊断结果，而缺乏扩增产物有可能表明未发生感染。通常对于PCR，可按照标准方法制备含有恰当设计的引物、含待扩增的核苷酸序列的模板以及适当的PCR酶和缓冲液的混合物，并进行反应以扩增该模板的特异性新胞子虫DHFR-TS多核苷酸分子或其部分。也可利用本领域已知的其它扩增技术，如连接酶链反应。
除非另外特别指出，以后凡涉及“多核苷酸分子”均指包括本发明的任一种前述多核苷酸分子，包括含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子：SEQ ID NO:1所示从大约第2405nt至大约第8199nt的DHFR-TS基因或存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)内的DHFR-TS基因的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；与含有下述核苷酸序列的多核苷酸分子基本上同源的多核苷酸分子：SEQ ID NO:1所示从大约第2405nt至大约第8199nt的DHFR-TS基因的核苷酸序列、或存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)的DHFR-TS基因的核苷酸序列、或SEQ ID NO:2的核苷酸序列；含有编码与新胞子虫DHFR-TS蛋白基本上同源的多肽的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中所述新胞子虫DHFR-TS蛋白具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或具有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列；以及由作为任一种前述多核苷酸分子的基本部分的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子，包括由编码任一种前述的新胞子虫DHFR-TS蛋白或基本上同源的多肽的肽片段的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子。
除非另外特别指出，以后凡涉及“DHFR-TS蛋白”、“蛋白质”或“多肽”均指包括具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或具有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列的蛋白质；与任一种前述蛋白质基本上同源的多肽；以及任一种前述蛋白质或多肽的肽片段。
对本发明的多核苷酸和寡核苷酸分子进行生产和操作的方法在本领域的技术范围内，并可按照已知的遗传技术进行，这些技术记载于Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，出处同前；Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等，1995(出处同前)；以及Erlich,1992(出处同前)等出版物中，上述文献引入本文作为参考。
重组表达体系
克隆和表达载体
本发明还提供了含有本发明多核苷酸分子的重组型克隆和表达载体。在一个非限制性的实施方案中，本发明所提供的克隆载体是噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)，其含有具N.caninum NC-1株系的完整DHFR-TS基因的核苷酸序列的多核苷酸分子。
优选将本发明的表达载体构建成使该多核苷酸分子与转录和翻译必需的一种或多种调控元件有效相连。将表达载体用于表达体系如转化的宿主细胞中，以生产重组型表达的DHFR-TS蛋白。
如本文所用，术语“调控元件”包括但不限于编码下述元件的核苷酸序列：诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵基因，以及本领域已知可参与启动和/或调控多核苷酸编码序列表达的其它元件。如本文所用，若一种或多种调控元件可有效调控并提供DHFR-TS编码序列的转录、或其mRNA的翻译，或二者兼而有之时，该DHFR-TS编码序列即是与所说的调控元件“有效相连”。
本领域熟知可用于构建含有与适当的调控元件有效相连的特定编码序列的表达载体的方法，可利用这些方法实施本发明。这些方法包括如Maniatis等，1989(出处同前)；Ausubel等，1989(出处同前)；以及Sambrook等，1989(出处同前)等所记载的体外重组技术、合成技术和体内遗传重组。
本领域已知可用于表达本发明多核苷酸分子的编码序列的多种表达载体，包括含有DHFR-TS编码序列的重组型噬菌体DNA、质粒DNA和粘粒DNA以用于转化细菌或酵母，以及含有DHFR-TS编码序列的重组型病毒表达载体如杆状病毒以用于转染昆虫细胞，或含有DHFR-TS编码序列的腺病毒或痘苗病毒以用于转染哺乳动物细胞，等等。
可被加工成含有本发明的多核苷酸分子的典型原核表达载体质粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories,Richmond,CA)，以及pPL和pKK223(Pharmacia,Piscataway,NJ)，等等。
可被加工成含有本发明多核苷酸分子的典型真核生物表达载体包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达体系(Invitrogen,Carlsbad,CA)，基于巨细胞病毒启动子-增强子的体系(Promega,Madison,WI；Stratagene,LaJolla,CA；Invitrogen)；以及基于杆状病毒的表达体系(Promega)，等等。
在强度和特异性方面，这些和其它载体的调控元件可以各不相同。取决于所使用的宿主/载体体系，可以使用任何一种合适的转录和翻译元件。比如，当在哺乳动物细胞体系中进行克隆时，可使用分离自哺乳动物细胞基因组的启动子如小鼠金属硫蛋白启动子，或可使用分离自生长于这些细胞内的病毒的启动子，如痘苗病毒7.5K启动子或Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复序列。也可利用通过重组DNA或合成技术所获得的启动子以提供插入序列的转录。另外，在存在特定诱导物的情况下，来自某些启动子的表达可得到提高，比如锌和镉离子可提高金属硫蛋白启动子的表达。
转录调控区或启动子的非限制性实例包括用于细菌的β-gal启动子、T7启动子、TAC启动子、λ左向和右向启动子、trp和lac启动子、trp-lac融合启动子等；用于酵母的糖酵解酶启动子，如ADH-Ⅰ和ADH-Ⅱ启动子、GPK启动子、PGI启动子、TRP启动子等；用于哺乳动物细胞的SV40早期和晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子等。
为了足量翻译插入的DHFR-TS编码序列，还必需特定的起始信号。通常这些信号包括ATG起始密码子和邻接序列。当将本发明的多核苷酸分子连同其自身的起始密码子和邻接序列一起插入适当的表达载体中时，不再需要额外的翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列的一部分的情形下，可能需要外源的翻译控制信号，包括ATG起始密码子。这些外源翻译控制信号和起始密码子可得自多种来源，既可以是天然的，也可以是合成的。另外，起始密码子必须与DHFR-TS编码区的读框协调一致以确保整个插入片段读框一致地翻译。
可利用融合蛋白表达载体表达DHFR-TS融合蛋白。可利用已纯化的融合蛋白产生抗DHFR-TS蛋白的抗血清，研究DHFR-TS蛋白的生物化学特性，加工DHFR-TS融合蛋白使其具有不同的酶促活性，或协助进行表达的DHFR-TS蛋白的鉴定或纯化。可能的融合蛋白表达载体包括但不限于插入了编码下述多肽的序列的载体：β-半乳糖苷酶和trpE融合体、麦芽糖结合性蛋白融合体、谷胱甘肽-S-转移酶融合体和多组氨酸融合体(携带者区)。可利用本领域已知的方法构建编码这类DHFR-TS融合蛋白的表达载体。
如上所述，融合蛋白在协助进行表达蛋白的纯化方面是有用的。比如，利用直链淀粉树脂可纯化DHFR-TS-麦芽糖结合性蛋白融合体；利用谷胱甘肽-琼脂糖玻璃珠可纯化DHFR-TS-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白；利用二价镍树脂可纯化DHFR-TS-多组氨酸融合体。或者，可将抗载体蛋白或肽的抗体用于融合蛋白的亲和层析纯化。例如，可将编码单克隆抗体靶抗原决定基的核苷酸序列加工到表达载体中使其与调控元件有效相连，并且所处位置可使表达的表位与DHFR-TS蛋白相融合。例如，可通过标准技术，将编码FLAGTM表位标记(International BiotechnologiesInc.)这样一个亲水性标记肽的核苷酸序列插入表达载体中的某个位点，比如DHFR-TS蛋白的羧基末端。然后利用可商购的抗FLAGTM的抗体，可对表达的DHFR-TS蛋白-FLAGTM表位融合产物进行检测和亲和纯化。
也可将表达载体加工成含有编码特定蛋白酶切割位点的多接头序列，以便可通过特定蛋白酶处理而将表达的DHFR-TS蛋白从载体区或融合“搭挡”中释放出来。例如，融合蛋白载体中可包括编码凝血酶或Xa因子切割位点等的DNA序列。
通过已知方法，可将位于DHFR-TS编码区上游并与其读框一致的信号序列加工到表达载体中以指导表达蛋白质的运输和分泌。信号序列的非限制性实例包括来自α因子、免疫球蛋白、外膜蛋白、青霉素酶和T细胞受体等的那些信号序列。
为了协助筛选出已转化或转染了本发明表达载体的宿主细胞，可加工表达载体使其进一步含有报道基因产物或其它选择性标记的编码序列。如上述，优选这类编码序列与调控元件编码序列有效相连。在本发明中有用的报道基因在本领域中是众所周知的，它们包括编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白、荧火虫荧光素酶以及人生长激素等的报道基因。编码选择性标记的核苷酸序列在本领域中是众所周知的，它们包括编码赋予对抗生素或抗代谢物的抗性的基因产物或可提供营养缺陷型需要的基因产物的那些核苷酸序列。这类序列的例子包括编码胸苷激酶活性，或对氨甲喋呤、氨苄青霉系、卡那霉素、氯霉素、zeocin、乙嘧啶(pyrimethamine)、氨基糖苷或潮霉素抗性的那些序列，等等。
宿主细胞的转化
本发明提供了含有本发明多核苷酸分子或重组表达载体的转化宿主细胞，以及由此衍生的细胞系。在实施本发明过程中有用的宿主细胞可以是真核细胞，尽管优选的是原核细胞。这类转化宿主细胞包括但不限于微生物，如经重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；或经重组表达载体转化的酵母；或动物细胞，如经重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞，或经重组病毒表达载体(如腺病毒或痘苗病毒)感染的哺乳动物细胞，等等。
可将细菌细胞用作宿主细胞。比如，可利用大肠杆菌菌株，如DH5α菌株，该菌株可从ATCC,Rockville,MD,USA(保藏号31343)或从Stratagene(La Jolla,CA)获得。真核宿主细胞包括酵母细胞，尽管哺乳动物细胞如来自小鼠、仓鼠、牛、猴或人细胞系的细胞也可得到有效利用。可用于表达本发明重组蛋白质的真核宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(如ATCC保藏号CCL-61)，NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3(如ATCC保藏号CRL-1658)，Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞(ATCC保藏号CCL-22)，以及胸苷激酶缺陷型细胞，如L-M(TK-)(ATCC保藏号CCL-1.3)和tk--ts13(ATCC保藏号CRL-1632)。
优选将本发明的重组表达载体转化或转染到基本上均一的细胞培养物的一个或多个宿主细胞中。通常利用已知技术将表达载体导入宿主细胞，如磷酸钙沉淀、氯化钙处理、显微注射、电穿孔、通过与重组病毒接触进行的转染、脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖转染、转导、接合或微粒轰击等方法。可通过标准方法筛选转化体，如通过筛选表达与重组表达载体相关的选择性标记(如抗生素抗性)的细胞等方法。
一旦已将表达载体引入宿主细胞，则可通过标准技术，比如Southern杂交分析、限制性酶分析、PCR分析包括逆转录酶PCR(rt-PCR)，或通过免疫测定以检测预期蛋白质产物的存在等技术，证实本发明的多核苷酸分子的整合和维持情况(或者是在宿主细胞基因组中，或者是以附加体形式存在)。可通过至少四条常规途径中的任一种鉴定含有和/或表达本发明多核苷酸分子的宿主细胞，这几条途径在本领域中是众所周知的，它们包括：(ⅰ)DNA-DNA、DNA-RNA、DNA-反义RNA杂交；(ⅱ)检测“标记”基因功能的存在；(ⅲ)通过测量宿主细胞中诸如DHFR-TS特异性mRNA转录物的表达确定转录水平；或(ⅳ)比如通过免疫测定或通过检测DHFR酶促活性如由NADPH氧化所催化的二氢叶酸转变为四氢叶酸，或检测TS酶促活性如脱氧尿苷一磷酸转变为脱氧胸苷一磷酸等方法，检测成熟多肽产物的存在，如同本领域所知的那样。
重组多肽的表达和纯化
一旦已将本发明的多核苷酸分子稳定引入适当的宿主细胞内，则克隆性地增殖该经转化的宿主细胞，并在有助于最大量生产编码的DHFR-TS蛋白的条件下培养由此获得的细胞。这样的条件通常包括培养经转化的细胞至高密度。若表达载体中含有诱导型启动子，则给予所需的适当诱导条件以诱导表达，诱导条件的例子比如有温度变动、营养衰竭、加入义务诱导物(如碳水化合物的类似物，比如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、过量代谢副产物的累积等等。
若表达的DHFR-TS蛋白被保留于宿主细胞内，则收集和裂解该细胞，并在本领域已知可将蛋白质降解减到最小的提取条件下如4℃下，或在存在蛋白酶抑制剂时，或同时具备这两个要求的条件下，从裂解物中纯化该产物。若表达的DHFR-TS蛋白已从宿主细胞内分泌出来了，则可简单地收集已耗尽养分的培养基，并从中分离该蛋白质。
适当时，可利用标准方法，从细胞裂解物或培养基中纯化表达的DHFR-TS蛋白，这些方法包括但不限于下述方法中的一种或多种：硫酸铵沉淀、大小分级分离、离子交换层析、HPLC、密度离心，以及亲和层析。若表达的DHFR-TS蛋白表现出酶促活性，如具有由NADPH氧化所催化的将二氢叶酸转变为四氢叶酸的能力(DHFR)，或具有将脱氧尿苷一磷酸转变为脱氧胸苷一磷酸的能力(TS)，则如本领域所知，通过使用适当的测定法，可在纯化过程中的每一步骤检测制备物的纯度提高程度。若表达的蛋白质缺乏生物活性，则可基于诸如大小、或与特异于DHFR-TS蛋白的抗体的反应性，或通过融合标记的存在情况而对其进行检测。为了应用于本发明实施过程中，该重组型表达的DHFR-TS蛋白可以是产生在培养物中或存在于细胞裂解物中的未纯化状态，或者已从其中部分地或基本上得到了纯化。
因此本发明提供了一种制备DHFR-TS蛋白的方法，该方法包括在有利于DHFR-TS蛋白表达的条件下培养转化了重组表达载体的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收DHFR-TS蛋白，所说的重组表达载体含有与一种或多种调控元件有效相连的本发明多核苷酸分子。
本发明还提供了含有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的分离的新胞子虫DHFR-TS蛋白，或含有由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCCNo:209512)中的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列的蛋白质；与这些蛋白质基本上同源的多肽；以及前述蛋白质或多肽的肽片段。比如，本发明的肽片段可以由新胞子虫DHFR-TS蛋白的DHFR结构域或TS结构域所组成。新胞子虫DHFR-TS蛋白的推定DHFR结构域的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中约第1位氨基酸残基至约第323位氨基酸残基，推定TS结构域的氨基酸序列为约第324位氨基酸残基至约第612位氨基酸残基。
DHFR-TS蛋白的用途
一旦已获得足够纯的DHFR-TS蛋白，则可通过标准方法对其进行表征，这些标准方法包括SDS-PAGE、大小排阻层析、氨基酸序列分析、生物活性等等。可利用亲水性分析(参见如Hopp和Woods,1981，美国国家科学院院报，78:3824)或相似的软件系统对DHFR-TS蛋白作进一步表征，以鉴定出疏水区和亲水区。可进行结构分析以鉴定出DHFR-TS蛋白中表现特定二级结构的区域。通过各种生物物理方法，如X-射线结晶学(Engstrom,1974，生物化学与实验生物学(Biochem.Exp.BioL),11:7-13)、计算机模型分析(Fletterick和Zoller(编),1986，分子生物学现代通信，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)以及核磁共振(NMR)等，可确定和分析DHFR-TS蛋白与其任一种底物之间相互作用的位点。可利用由上述研究得到的信息设计出更为有效的缺失突变体和疫苗组合物，或者设计或筛选出可在体内特异性阻断新胞子虫DHFR-TS蛋白的DHFR或TS结构域的酶促活性的治疗用或药用化合物。
本发明分离的DHFR-TS蛋白，不管是重组型的或其它形式的，都可用于多种目的。比如，可利用该蛋白质筛选出能特异性阻断DHFR或TS结构域的酶促活性的抑制剂。这样的筛选方法在本领域中是众所周知的。也可将本发明的DHFR-TS蛋白用作抗原以产生可与该蛋白质特异性反应的多克隆或单克隆抗体，正如下文所述。可将这样的抗体用作亲和试剂，以纯化天然或重组型DHFR-TS蛋白，或用作诊断试剂，以通过诸如ELISA或Western印迹测定等方法检测动物细胞、组织或体液样品中新胞子虫特异性DHFR-TS蛋白的存在。
可利用已知方法制备抗DHFR-TS蛋白的抗体。可利用该部分或基本上纯化好的抗原免疫多种宿主动物，包括猪、牛、马、兔、山羊、绵羊和小鼠。可利用诸如下述的佐剂以提高抗体产量。通过标准方法可从被免疫动物的血清中获取多克隆抗体，并测定其抗DHFR-TS蛋白的特异性。或者，通过培养的连续细胞系，利用可提供抗体分子生成的任何一种技术，可制备抗DHFR-TS蛋白的单克隆抗体。这些技术包括但不限于最初由Kohler和Milstein(自然，1975,256:495-497)所记载的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，今日免疫学，4:72；Cote等，1983，美国国家科学院院报，80:2026-2030)，以及EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss,Inc.，第77-96页)。可对记载为用于生产单链抗体的技术(参见如美国专利4,946,778)作适当改进使其适合用于生产DHFR-TS抗原特异性单链抗体。这些出版物引入本文作为参考。
本发明也包括含有DHFR-TS抗原特异性结合位点的抗体片段，它们可通过已知技术产生。这样的片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化完整抗体分子而产生的F(ab′)2片段，以及通过还原这些F(ab′)2片段的二硫桥而产生的Fab片段。或者，可构建Fab表达文库(Huse等，1989，科学，246:1275-1281)以便快速鉴定出具有所需的对DHFR-TS抗原特异性的Fab片段。
生产单克隆抗体和抗体片段的技术在本领域中是众所周知的，并且还记载于Harlow和Lane,1988，抗体:实验室手册，冷泉港实验室，和J.W.Goding,1986，单克隆抗体：原理和实践，Academic Press,London等处，这些文献引入本文作为参考。
新胞子虫DHFR-TS基因的定向突变
遗传构建体
基于本发明公开的多核苷酸分子，可制备出能用于失活新胞子虫DHFR-TS基因的遗传构建体。联合使用适当设计的遗传构建体和目前已知的或即将开发的遗传技术，可失活新胞子虫DHFR-TS基因。比如，利用本发明的具有以下功能的遗传构建体，可失活新胞子虫DHFR-TS基因：(a)可缺失全部或部分DHFR-TS基因；或(b)可以一段不同的核苷酸序列置换DHFR-TS基因的一部分；或(c)可将一个或多个核苷酸、或者可能含有新胞子虫或其它来源的核苷酸序列的寡核苷酸分子或多核苷酸分子插入DHFR-TS基因中。
若与DHFR-TS基因未被失活的同一株系新胞子虫细胞相比，DHFR-TS基因的失活降低了携有已失活的DHFR-TS基因的新胞子虫细胞的病原性，并且携有已失活的DHFR-TS基因的新胞子虫细胞可用于疫苗组合物、特别是经修饰的活疫苗中以诱导哺乳动物中抗新胞子虫病的保护性反应，则其内DHFR-TS基因已经失活的新胞子虫细胞在实施本发明过程中是有用的。
在一个非限制性的实施方案中，可利用本发明的遗传构建体，通过用突变的新胞子虫DHFR-TS基因或其部分置换野生型DHFR-TS基因或其部分，从而失活野生型新胞子虫DHFR-TS基因。可通过各种已知方法制备能用于这样的遗传构建体中的突变新胞子虫DHFR-TS基因序列，这些方法包括易错聚合酶链反应，或盒式诱变等。例如，可应用寡核苷酸介导的诱变方法，以确定的方式改变野生型新胞子虫DHFR-TS基因的ORF序列，比如将移框或终止密码子引入序列内特定区域中。另一方面或者额外地，通过将一个或多个核苷酸、寡核苷酸分子或多核苷酸分子插入新胞子虫DHFR-TS基因中，或以一个或多个核苷酸、寡核苷酸分子或多核苷酸分子置换新胞子虫DHFR-TS基因的一部分，可制备出能用于本发明遗传构建体的突变核苷酸序列。这样的寡核苷酸分子或多核苷酸分子可得自任何天然来源，或可以是合成的。插入序列可以是仅用于破坏新胞子虫DHFR-TS基因的读框，或还可以编码异源基因产物如选择标记。也可利用随机诱变法产生突变新胞子虫DHFR-TS基因序列以用于本发明的遗传构建体中。可利用任何一种已知的或即将开发的技术完成随机诱变，这样的技术比如是将携有新胞子虫DHFR-TS基因的细胞暴露于紫外线照射或X-射线，或化学诱变剂如N-甲基-N′-亚硝基胍、乙基甲磺酸、亚硝酸或氮芥类，然后筛选出在其DHFR-TS基因内携有突变的细胞。有关诱变技术的综述参见如Ausubel,1989，出处同前。
如上所述，用于生成在实施本发明过程中有用处的经修饰的新胞子虫细胞的突变可发生在新胞子虫DHFR-TS基因内的任何地方，包括ORF内、启动子区内，或该基因或ORF旁侧的任何其它序列内。这样的新胞子虫细胞是突变体，其内可能产生由新胞子虫DHFR-TS基因所编码的该蛋白质的修饰形式，或者根本不产生这样的蛋白质。在一个优选实施方案中，这样的新胞子虫细胞表现出dhfr-或ts-或dhfr--ts-突变体表型(以下总称为dhfr--ts-表型)。此外，这样的新胞子虫细胞也可以是无效突变体、条件突变体或渗漏突变体。
或者本发明的遗传构建体可含有如选自SEQ ID NO:1所示的旁侧序列之类的新胞子虫DHFR-TS基因或ORF的原位天然旁侧核苷酸序列，其中仅存在极少数或根本没有该基因本身的编码序列的核苷酸序列。这样的遗传构建体可能在诸如缺失整个基因或ORF的工作中有用处。
在一个优选实施方案中，本发明的遗传构建体中含有可用于失活新胞子虫DHFR-TS基因的多核苷酸分子，其中含有：(a)具有与编码N.caninum的DHFR-TS蛋白的核苷酸序列差不多相同、但其中还含有一个或多个失活突变的核苷酸序列的多核苷酸分子；或(b)由新胞子虫DHFR-TS基因的ORF的天然原位旁侧的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子。一旦转化至新胞子虫株系的细胞中，该遗传构建体的多核苷酸分子能通过诸如同源重组等特异地定位到新胞子虫DHFR-TS基因，由此替换该基因或其中一部分或者插入该基因中。此重组事件的发生导致本是新胞子虫特定株系的天然的新胞子虫DHFR-TS基因发生了失活。
在寄生性原生动物中进行同源基因替换的方法在本领域中是已知的，并描述于Cruz和Beverly,1990，自然，348:171-173；Cruz等，1991，美国国家科学院院报，88:7170-7174；Donald和Roos,1994，分子生物化学和寄生虫学，63:243-253；以及Titus等，1995，美国国家科学院院报，92:10267-10271等文献中，所有这些文献均引入本文作为参考。
为通过同源重组进行定位基因突变，优选该遗传构建体是含有上述突变的核苷酸序列的环状或线性质粒。在一个非限制性的实施方案中，尽管长度更短的核苷酸也可能是有效的，但使用了突变序列中至少约200个核苷酸以将本发明的遗传构建体特异地定位于新胞子虫DHFR-TS基因，从而进行同源重组。此外，该质粒优选包含编码报道分子基因产物或其它选择标记的额外核苷酸序列，其构建方式将使其可插入至新胞子虫基因组中与天然新胞子虫DHFR-TS基因的调控元件编码序列有效相连。可用于实施本发明的报道基因在本领域中是众所周知的，包括编码CAT、绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶等的那些报道基因。编码选择标记的核苷酸序列在本领域中也是众所周知的，包括编码可赋予对抗生素或抗代谢物的抗性、或可提供营养缺陷型需要的基因产物的那些核苷酸序列。这样的序列的例子包括编码乙嘧啶抗性或新霉素磷酸转移酶(可赋予对氨基糖苷类的抗性)或潮霉素磷酸转移酶(可赋予对潮霉素的抗性)的那些序列。
可用于制备本发明遗传构建体的方法在本领域中是众所周知的，包括体外重组技术、合成技术以及体内遗传重组等，这些方法描述于Maniatis等，1989(出处同前)；Ausubel等，1989(出处同前)；以及Sambrook等，1989(出处同前)等出版物中。
可将本发明遗传构建体与已知技术如电穿孔法联用从而对新胞子虫细胞进行转化或转染。转化体的筛选可利用标准方法，如通过筛选可表达与构建体相关的选择标记的细胞。可通过遗传分析如Southern印迹分析，或通过Northern分析检测编码DHFR-TS蛋白的mRNA转录物的缺乏，或通过新表型的出现如病原性降低，或通过如免疫分析确定的缺乏DHFR-TS蛋白的细胞的出现，或其中的一些组合方法而鉴定出已成功地完成了重组事件并且特定靶基因已被失活的转化体。
可按照本发明进行修饰的新胞子虫细胞优选是速殖体，但也可以是慢殖体或卵母细胞。尽管在新胞子虫生命周期的某些阶段的细胞是二倍体，但速殖体是单倍体。因此，由于速殖体仅需要一次成功的重组事件来破坏特定的新胞子虫基因，故而优选利用速殖体产生表现适当突变体表型的经修饰的新胞子虫细胞。或者，在新胞子虫的二倍体细胞中，对各个基因来说都必须破坏两个等位基因。这可以通过利用含有两个不同的选择标记的遗传构建体依次导向第一个等位基因和第二个等位基因而完成。
在另一个非限制性的实施方案中，本发明遗传构建体还额外含有从新胞子虫或可感染动物的不同病原来源的不同基因或编码区，该基因或编码区编码的抗原可用于在接种了本发明经修饰的活新胞子虫细胞的动物中诱导分别的且截然不同的保护性免疫反应。可进一步加工所说的额外基因或编码区，使其含有信号序列，所说的信号序列可促使所编码的抗原从该经修饰的活新胞子虫细胞中分泌出来，从而使该抗原可展示于接种动物的免疫系统内。
本发明因而提供了其内DHFR-TS基因已被破坏的经修饰的活新胞子虫细胞。此外，本发明提供了制备经修饰的活新胞子虫细胞的方法，该方法包括：(a)用本发明遗传构建体转化新胞子虫细胞；(b)筛选出其内DHFR-TS基因已被该遗传构建体破坏的转化细胞；以及(c)从步骤(b)的细胞中筛选出可用于疫苗中以保护哺乳动物以抗新胞子虫病的那些细胞。
培养新胞子虫细胞
通过按照本领域所描述的已知技术，利用速殖体感染任何受体细胞系、优选哺乳动物细胞系，可在体外培养和维持新胞子虫细胞以用于本发明中。可用于培养新胞子虫的速殖体的哺乳动物细胞系包括诸如人包皮成纤维细胞(Lindsay等1993，美国兽医研究杂志，54:103-106)、牛心肺主动脉内皮细胞(Marsh等，1995，出处同前)，牛单核细胞(Lindsay和Dubey,1989，出处同前)和猴肾细胞等。例如，可在Hs68人包皮成纤维细胞(ATCC No.CRL-1635)的单层中培养N.caninum的速殖体(Lindsay等，1993，出处同前)；可用于本发明的感染了N.caninumNC-1株系的速殖体的MARC145猴肾细胞被保藏于ATCC中(保藏号为ATCCNo.12231)。可类似地对慢殖体进行培养和操作。
可在本领域所记载的多种类型培养基的任何一种中培养哺乳动物细胞培养物，维持已感染了新胞子虫的细胞培养物。例如，可在补加了10％(V/V)热灭活胎牛血清(FBS)或成年马血清(ES)、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素以及50μg/ml链霉素的Dulbecco′s基本培养基(DMEM,Gibco Laboratories,N.Y.)中培养感染了N.caninum的速殖体的牛心肺主动脉内皮细胞的稳定单层培养物(Conrad等，1993，出处同前)。可在含有2％(V/V)FBS、1.0mM丙酮酸钠、1×104U/ml青霉素、1×104μg/ml链霉素、5×10-2mM 2-硫基乙醇和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的RPMI 1640(维持培养基)中维持Hs68人包皮成纤维细胞。可在相同的培养基中维持感染了新胞子虫的Hs68人包皮成纤维细胞的单层培养物，但要求该培养基中FBS水平提高到10％(V/V)(生长培养基)。
通常在标准组织培养条件下比如37℃、5％CO2中维持感染了新胞子虫的哺乳动物细胞单层培养物。若培养物中70-90％的哺乳动物细胞已被感染(这可以利用标准技术显微观察而确定)，则通常将速殖体传代到未感染的单层培养物中。通过利用任何一种标准方法裂解宿主细胞并通过诸如过滤或离心等方法收集速殖体，可以从被感染的哺乳动物细胞培养物中收获速殖体。
可按照上述方法，在含有胸苷的培养基中，于哺乳动物细胞内培养本发明的已被修饰并表现出dhfr--ts-表型的新胞子虫细胞。
抗新胞子虫的疫苗
本发明提供了抗新胞子虫病的疫苗，其中含有免疫有效量的经修饰的活新胞子虫细胞如前述的dhfr--ts-无效突变体，以及兽医可接受性载体。
本发明还提供了制备可保护哺乳动物以抗新胞子虫病的疫苗的方法，其中包括制备经修饰的活细胞如上述制备的表现dhfr--ts-表型的那些细胞，并以适于哺乳动物施用的形式将免疫有效量的经修饰的活细胞与兽医可接受性载体组合起来。
如本文所用，术语“免疫有效量”是指经一次施用或分多次施用后，一种哺乳动物的一个成员被施用的本发明经修饰的活新胞子虫细胞的量足以诱导抗新胞子虫病的保护性反应。
词语“足以诱导保护性反应”在此处广泛使用，包括由于疫苗接种而在动物中诱导或增强任一种基于免疫的反应(包括抗体，或细胞介导的免疫反应，或两种情况兼而有之)，这样的反应可保护被接种动物以抗新胞子虫病。此处所用的术语“保护性反应”和“保护”不仅指与同一种类的未被接种的感染动物相比，接种动物内可绝对避免新胞子虫病或可绝对避免导致新胞子虫病的病原的感染，还指其中这类病原感染的程度或速率有任何可测的降低，或该疾病的严重程度、或由于该抗原感染导致的任何症状或状态方面存在任何可测的降低，包括诸如在一种或多种组织中损伤的形成速率和绝对数量方面有任何可测的降低，或在流产发生、从怀孕哺乳动物到其胎儿或从哺乳动物亲本到其后代的感染传播等方面都存在任何可测的降低。
疫苗可简单地含有小份培养液，所说的培养液中含有经修饰的活新胞子虫细胞，该细胞或者游离存在于培养基中，或者存在于哺乳动物宿主细胞中，或者是它们的组合。这种疫苗可对哺乳动物直接施用；或代之以含有联合使用了选自本领域所知的适于施用途径的那些载体中的一种兽医可接受性载体的经修饰的活新胞子虫细胞。较好是疫苗组合物中经修饰的活新胞子虫细胞仍保留了至少一定程度活性。例如，可利用标准缓冲液、载体、稳定剂、稀释剂、保存剂和/或溶剂按照通用方法将本发明的疫苗组合物制成制剂，也可以制成制剂以便于持续性释放。稀释剂可以包括水、盐溶液、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂可包括白蛋白等。在经修饰的活疫苗中特别有用的合适的其它疫苗赋形剂和添加剂对本领域的技术人员来说是已知的，或者是显而易见的。参见如Remington的药物科学，第18版，1990,Mack Publishing，该书引入本文作为参考文献。
可用于本发明疫苗中的经修饰的活新胞子虫细胞优选是速殖体，但也可以是慢殖体或卵母细胞，或它们的某种组合。
只要该疫苗组合物中经修饰的活新胞子虫细胞仍保持了至少一定程度的活性，则本发明疫苗中还可含有一种或多种额外的免疫调节组分如佐剂或细胞因子等。可用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性例子有RIBI佐剂系统(Ribi Inc.,Hamilton,MT)，明矾、矿物质凝胶比如氢氧化铝凝胶、水包油乳剂、油包水乳剂比如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA),QS-21(Cambridge Biotech Inc.,CambridgeMA)和SAF-M(Chiron,Emeryville CA)，AMPHIGEN佐剂，皂苷、QuilA或其它皂苷组分，单磷酸类酯A和Avridine脂胺佐剂。在本发明疫苗中有用的水包油乳剂的非限制性的几个特殊例子包括改进的SEAM62和SEAM 1/2配方。改进的SEAM62是一种水包油乳剂，其中含有5％(V/V)角鲨烯(Sigma)，1％(V/V)SPAN85去污剂(ICI Surfactants),0.7％(V/V)TWEEN80去污剂(ICI Surfactants),2.5％(V/V)乙醇，200μg/ml QuilA,100μg/ml胆甾醇以及0.5％(V/V)卵磷酯。改进的SEAM 1/2是一种水包油乳剂，其中含有5％(V/V)角鲨烯，1％(V/V)SPAN85去污剂，0.7％(V/V)TWEEN80去污剂，2.5％(V/V)乙醇，100μg/ml QuilA，以及50μg/ml胆甾醇。疫苗中可包含的其它免疫调节剂包括诸如一种或多种白细胞介素、干扰素或其它已知的细胞因子。可将疫苗冷冻贮存，施用前再融化。
只要疫苗组合物中经修饰的活新胞子虫细胞仍保留有至少一定程度的活性，则可任选地将本发明的疫苗配制成可使已经修饰的活新胞子虫细胞持续性释放的形式。这种持续性释放剂型的例子包括联合使用经修饰的活新胞子虫细胞与生物适应性聚合物的组合物，比如聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物(poly(Lactic-co-glycolic acid)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。药物传递赋形剂中可降解性聚合物的结构、选择和使用在一些出版物中都有综述，包括A.Domb等，1992，用于高等技术的聚合物，3:279-292，该文引入本文作为参考文献。选择和在药物剂型中使用聚合物的其它规则可见于M.Chasin和R.Langer(编),1990，“生物降解性聚合物用作药物传递系统”，药物和医药科学一书第45卷，M.Dekker，纽约，该文也引入本文作为参考文献。另一方面或额外地，只要疫苗组合物中经修饰的活新胞子虫细胞仍保持了至少一定程度的活性，则可微囊包装经修饰的活新胞子虫细胞以提高施用和效力。微囊包装抗原的方法在本领域中是众所周知的，包括如美国专利3137631、美国专利3959457、美国专利4205060、美国专利4606940、美国专利4744933、美国专利5132117以及国际申请公开号WO95/28227等所记载的技术，所有这些出版物均引入本文作为参考文献。
只要疫苗组合物中经修饰的活新胞子虫细胞仍保持了至少一定程度的活性，也可使用脂质体以促使本发明经修饰的活新胞子虫细胞持续性释放。有关如何制备和使用脂质体剂型的细节可见于美国专利4016100、美国专利4452747、美国专利4921706、美国专利4927637、美国专利4944948、美国专利5008050和美国专利5009956，所有这些均引入本文作为参考文献。
本发明还提供了一种联合疫苗，以用于保护哺乳动物以抗新胞子虫病和任选地会折磨哺乳动物的一种或多种其它疾病或病理状态，该联合疫苗含有免疫有效量的第一组分、免疫有效量的第二组分，以及兽医可接受性载体，所说的第一组分含有经修饰的活新胞子虫细胞，第二组分能诱导保护性反应以抗一些会折磨哺乳动物的疾病或病理状态。
如本领域所知，联合疫苗的第二组分的选择是基于其能够诱导保护性反应以抗新胞子虫病或会折磨哺乳动物物种成员的其它疾病或病理状态。只要在所获得的疫苗组合物中经修饰的活新胞子虫细胞仍保留有至少一定程度的活性，则已知可用于特定哺乳动物物种的疫苗组合物中的任何一种免疫组合物均可用于该联合疫苗的第二组分中。这样的免疫组合物包括但不限于可提供抵抗病原的保护性反应的那些组合物，所说的病原选自牛疱疹病毒(与“感染性的牛鼻气管炎”同物异名)，牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹泻病毒，Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型副流感病毒，钩端螺旋体、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、支原体、克雷伯氏菌、沙门氏菌、轮状病毒、冠形病毒、狂犬病病毒、溶血巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、梭状芽孢杆菌属种类(Clostridia spp.),Tetanus toxoid，大肠杆菌，隐孢子虫属种类(Cryptosporidium spp.)，艾美球虫属种类，毛滴虫属种类，以及其它真核生物寄生虫等等。
只要该疫苗组合物中所说的细胞仍保留有活性，则如上所述，本发明的联合疫苗还可含有一种或多种额外的免疫调节组分，包括诸如佐剂或细胞因子。可冷冻贮存该联合疫苗的抗原，在施用前再将其融化。
本发明还提供了保护哺乳动物以抗新胞子虫病的方法，包括给哺乳动物施用一种疫苗，该疫苗中含有免疫有效量的本发明经修饰的活新胞子虫细胞以及兽医可接受性载体。优选经胃肠外方式施用该疫苗，如皮下注射或肌肉内注射。然而，该疫苗的施用方式也可以是腹膜内或静脉内注射，或其它途径，包括诸如通过口腔、鼻内、直肠、阴道、眼内等途径，或这些途径的组合，也可通过本领域已知的延迟释放器械等。本领域技术人员懂得如何按照选用的途径制备疫苗组合物。
可通过常规途径确定有效剂量，即先使用低剂量经修饰的活新胞子虫细胞，然后提高剂量并测定效果。确定每只动物的最佳剂量时，应考虑各种因素。最基本的是该动物的品种、大小、年龄和一般状态，动物内是否存在其它药物、该动物接种疫苗所抗的具体新胞子虫品种或株系的毒性，等等。最好是参考其它动物的研究结果后再确定实际剂量。
也可依据上述因素选择疫苗的接种方法。取决于一系列因素，包括诸如其它动物中暴发新胞子虫病的时间等，可在特定动物一生中的任何时间施用本发明的疫苗。该疫苗可施用给处于断奶年龄或更年幼的动物，也可施用给更成熟的动物，如作为繁殖前疫苗以抗与新胞子虫相关的先天性疾病或流产。为达到有效保护，可能仅需要原始疫苗接种，或也可能需要一次或多次辅助性疫苗接种。检测是否已获得了适当免疫保护的一种方法是在接种疫苗后测定动物中的血清转变和抗体滴度。最好由兽医根据对所有相关因素(其中一些在前文已有叙述)的分析来确定接种疫苗的时间和辅助剂的数量(如果有的话)。
疫苗中经修饰的活新胞子虫细胞的量优选为约1×103-1×108/ml，更优选为约1×105-1×107/ml。适当的剂量大小为大约0.5ml-10ml，更优选为大约1ml-5ml。
在保护哺乳动物以抗新胞子虫病方面，本发明的疫苗有所用处。如本文所用，术语“哺乳动物”是指可利用本发明疫苗得到保护而抗新胞子虫病的任何一种哺乳动物物种，包括狗、牛、山羊、绵羊和马等等。该疫苗在怀孕和未怀孕哺乳动物的保护中都有用处。
本发明还提供了用于对哺乳动物接种疫苗以抗新胞子虫病的试剂盒，所说的试剂盒中包含两种容器，第一种容器中含有免疫有效量的本发明经修饰的活新胞子虫细胞，第二种容器中含有兽医可接受性载体或稀释剂。可以冷冻形式贮存该试剂盒中经修饰的活细胞，在施用前再使其融化。
下述实施例仅是举例说明，并不用来限制本发明的范围。
实施例：新胞子虫DHFR-TS基因的分离
扩增N.caninum的DHFR结构域的外显子1
依据已公开的鼠弓形体DHFR-TS基因的序列(Roos,1993，生物化学杂志，268:6269-6280)，设计并合成特异于鼠弓形体DHFR-TS基因外显子1 DNA序列5′和3′末端的长度为20个碱基的寡核苷酸引物。使用GNOMETM试剂盒(Bio 101,La Jolla,CA)，利用生产商提供的试剂和方法，制备N.caninum的NC-1株系的基因组DNA。PCR反应中使用了0.5μg基因组DNA，引物Tgdhfrexon 1-5′(5′-ATGCAGAAACCGGTGTGTCT)(SEQ ID NO:4)和Tgdhfrexon1-3′(5′-AGGGAAGAGGAAACGACGAT)(SEQ ID NO:5)各120pmol,dATP、dGTP、dCTP和dTTP(Perkin-Elmer,Norwalk,CT)各2.5mM,PCR缓冲液(Perkin-Elmer)，以及AMPLITAQTMDNA聚合酶(Perkin-Elmer)1.5单位。PCR循环设置为94℃1分钟进行1个循环，94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟进行29个循环。
由上述得到约0.3kb的PCR片段，未经进一步处理，利用T4 DNA连接酶将该片段克隆到pCRⅡ载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。通过双脱氧链末端终止测序法对该克隆的0.3kb片段进行测序，并已确定该序列与鼠弓形体相应的DHFR-TS基因外显子1的序列同源性大于85％。
新胞子虫DHFR-TS基因的克隆和测序
在噬菌体载体λDASHⅡ(Stratagene,La Jolla,CA.)中构建N.caninum NC-1株系的基因组DNA文库。用α-32p-dCTP放射性标记上述的约0.3kb的片段，并通过噬菌斑杂交，对大约5×105个噬菌体克隆进行筛选以获得对所说的标记片段具有反应性的克隆。经三轮筛选以富集反应性克隆后，鉴定出12个可与该约0.3kb的片段反应的噬菌体克隆。
利用λDNA分离系统(Qiagen,Chatsworth,CA)，按照生产商提供的方法，从所说的12个阳性克隆中的3个内制备噬菌体λ克隆的DNA。利用NotⅠ消化已定名为λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)(也被定名为4C13或λCY50)的这些λ噬菌体克隆之一的DNA，以释放出11kb的DNA片段，并按照Sambrook等，1989(出处同前)所述的方法对该片段进行亚克隆。利用下述寡核苷酸，对含有该11kb DNA片段的质粒亚克隆的DNA进行PCR，这些寡核苷酸是依据DHFR-TS序列而设计的，序列分别为：
5′-CCCCTCGTGGACCGGCTGAATA(SEQ ID NO:6)；
5′-TCCGTG CGTGCCAAGAGACTG(SEQ ID NO:7)；
5′-ATGGAGATGGCGATGGGAGGAC(SEQ ID NO:8)；
5′-AGTATGTACACGAAGCCTCAAT(SEQ ID NO:9).在PCR反应中以下述组合使用寡核苷酸：SEQ ID NO:6与8,SEQ IDNO:6与9；SEQ ID NO:7与8；以及SEQ ID NO:7与9。经PCR得到了特异性产物，表明该11kb片段内存在新胞子虫DHFR-TS基因。对含有该11kb片段的质粒亚克隆进一步的限制性分析表明在一个NotⅠ位点的1.5kb范围内存在一个不对称的HindⅢ位点。然后利用双脱氧链末端测序方法，通过引物步行技术，确定从一侧的NotⅠ位点到另一侧的HindⅢ位点(约9.6kb)间的DNA序列。利用计算机软件系统DNASTARTM(DNASTAR Inc.,Madison,WI)，对上述获得的DNA序列进行分析。
上述测序片段的长度为9603bp(SEQ ID NO:1)，其中含有来自N.caninum NC-1株系的完整DHFR-TS基因的序列。将此新胞子虫DHFR-TS基因的核苷酸序列与已公开的鼠弓形体DHFR-TS基因序列相比较以推测外显子与内含子的位置，以及DHFR和TS结构域的边界。推测该新胞子虫DHFR-TS基因含有10个外显子和9个内含子，位置如下：外显子1——由2405之前至2724；外显子2——由3212至3348；外显子3——由3925至4262；外显子4——由4491至4737；外显子5——由5214至5307；外显子6——由5678至5750；外显子7——由6129至6270；外显子8——由6685至6777；外显子9——由7264至7574；以及外显子10——由8116至8199以后。在内含子-外显子连接处存在一致的剪切信号。根据其与已公开的鼠弓形体DHFR-TS序列的结构相似性，推测DHFR结构域为从大约第2405nt至大约第4664nt，推测TS结构域为从大约第4665nt至大约第8199nt。
推测的编码来自N.caninum NC-1株系的DHFR-TS蛋白的开放阅读框(ORF)长度为1839bp(SEQ ID NO:2)。编码推测的DHFR结构域的ORF是从大约第1nt至大约第969nt，编码推测的TS结构域的ORF是从大约第970nt至大约第1836nt。N.caninum NC-1株系的DHFR-TS蛋白推断的氨基酸序列长度为612个氨基酸(SEQ ID NO:3)。含有推测的DHFR结构域的推断氨基酸序列为从大约第1位氨基酸残基至大约第323位氨基酸残基；含有推测的TS结构域的推断氨基酸序列为从大约第324位氨基酸残基至大约第612位氨基酸残基。序列分析表明，N.caninum推断的氨基酸序列和推测的鼠弓形体DHFR-TS序列之间，在DHFR结构域内存在73个氨基酸差异，在TS结构域内存在15个氨基酸差异。
生物材料保藏
于1997年12月3日将下述生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,20852，美国，并给予了下述保藏号：
噬菌体λNcIDHFRTS ATCC No.209512
上面所举例的所有专利、专利申请和出版物均全文引入本文作为参考文献。
本发明并不限于本文所描述的特定实施方案的范围，这些实施方案仅用于举例说明本发明的各个方面。任何功能等同的组合物和方法也在本发明的范围内。事实上，根据前述的说明，对本领域的技术人员来说，除了本文所示和记载的那些外，本发明的各种改进也是显而易见的。这样的改进也落入所附权利要求的范围内。
序列表<110>Krishnan,B.Rajendra
Yoder,S.Christine
Durtschi,Becky A.<120>编码新胞子虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶的DNA<130>DHFR-TS<140><141><150>60/067,507<151>1997-12-04<160>序列数：9<170>Patent In Ver.2.0-beta<210>SEQ ID NO:1信息<211>9603<212>DNA<213>Neospora caninum<220><221>基因<222>(2405)..(8199)<400>SEQ ID NO:1gcggccgccg gcacaatgcc gagggcagcg cagggaaaaa ccggtcgaag ctgcttcacg 60tgtctgaaaa tagagccagc gctactgtcg cttcaaagaa cgagacttcc gcgccacaaa 120tcggtagtga cggtggccgg aagcgaaaat tttacgacga gcagctgcca gtcggtgtgt 180accgtcacca gcagaagtat gtcgcgaact gggtagatcc gaaaacccgg agacaaatca 240aggtctgttt ccccatcgac gtgtgGggag actctcaagc tcgcaacatg gctgccgttg 300cgaggcgtga gcgctgcgtg gatgctgacg aggtggctgc tattttcaat cgtgaagagc 360gcaccaagac atcaggacgt catccgagtc cttcgaggga tgacagcaaa cagacagcgt 420ctttcaatag tgctgttagg atgccagcag tccagggtgt ggattcaaaa acggagacgc 480actcggctcc ggcgctcgaa agcgcgtaga gcctgaggcc acaccacttc tggttttcag 540agagggcgtc gcactcacaa tttttttcga cttctttccg cacactgggg ccgtgtgctc 600gaacactttt tacccgtgtg accatgtgcc cgaacacttt ttatccgtgt gaccatgtgc 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