醇的直接电化学本发明涉及到酶的电化学，特别是羟化酶的电化学。
羟化酶是许多底物氧化时的催化剂，例如甲烷单加氧酶就是甲烷被
分子氧氧化成唯一产物甲醇的有效催化剂。
文献中已有对羟化酶结构及电化学机理的研究报道。
甲烷单加氧酶有二种形式，可溶型(sMMO)和颗粒型(pMMO)。
荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)中的可溶型酶包括一个羟
化酶(250.5 kDa)，一个还原酶(38.5 kDa)，及一个调节组分，蛋
白B(15.9 kDa)，三种成分都是活性所必需的。羟化酶由两个处于
a262g2排列中的助催化剂组成，并且其X-ray晶体结构也已解出。发孢
甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b中的可溶性的甲烷单
加氧酶也有相似的结构。对其了解得也较为清楚。sMMO的活性中心是
位于羟化酶亚基中的双铁中心，当酶处于静息态时，两个铁离子由一个
酰位羟基连接起来。NADH中的还原力通过还原酶中的F2S2和FAD中
心转移到活性中心。蛋白B不含铁离子或辅基，其调节作用细节仍不清
楚。当酶处于静息态时，铁离子处于高铁状态(Fe(Ⅲ)Fe(Ⅲ))，该双
铁中心还有两种氧化状态，即混合价态(Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ))和全部亚铁状态
(Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ))。正是羟化酶的亚铁状态在反应中与O2反应，激活O2。
荚膜甲基球菌(Bath)和发孢甲基弯菌OB36中双铁中心的氧化还
原电势已经三家独立的研究测出。Fe(Ⅲ)Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ)和
Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ)/Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)电偶的Eo′值是一些争论的焦点。从这二种不
同微生物来源的sMMO已经研究得很透彻了。以前的研究用氧化还原指
示剂滴定法和分光光度法来确定还原态的浓度。本研究中使用了具有氧
化还原活性的介体(mediator)对羟化酶中的双铁中心进行了间接滴
定，混合价态和全亚铁状态羟化酶的浓度用EPR或EPR加极低温
Moessbauer光谱法测定(4.2-18°K)。
在蛋白电化学领域，含巯基或二硫键的有机化合物被发现是极好的
修饰剂。因为它们可以通过很强的gold-surfer键进行化学吸附，因此
可以在电极表面形成一层稳定覆盖物，相关氨基酸也可以以这种方式进
行化学吸附，提高了电极表面的电化学能力。已经有人对使用含巯基及
功能氨基酸(如Arg,lys,his)的多肽作为蛋白电化学的促进剂进行了研
究。
然而，与蛋白化学领域相反，不借助介质对氧化还原酶进行直接电
化学测量并非一件微不足道的小事。一个主要的困难是氧化还原中心常
埋在蛋白内部，远离表面，电子必须迁移很长的距离才能到达电极以致
于电子迁移速率降低至可忽略的水平。同样，大部分氧化还原酶比非氧
化还原酶大，结构更松散，在电极表面它们更易于发生形变，失去活性。
羟化酶的电化学在有介体存在时变得复杂化了，因为羟化酶和介体
之间可能会有相互作用，当温度与酶反应温度不同时，介体可能会影响
浓度的测定。
避免上述不足是本发明的一个目标。
根据本发明的一个方面，本发明是在一个电化学过程中电极和酶之
间的电子转移包括使酶吸附在电极上的方法。
这种转移优选是直接的。
根据本发明的另一个方面，酶的电化学方法包括不需要介体的直接
电化学。
在本发明的一个实施方案中，这个酶是单加氧酶。
在本发明的另一个实施方案中，这个酶是P450或修饰后的P450。
本发明的另一个实施方案中，这个酶是甲烷单加氧酶。
本发明的另一个实施方案中，这个酶是羟化酶。
这个羟化酶可能是可溶的甲基单加氧酶。
这个酶可能包含一个以双铁离子为中心的活性位点，或者这个酶包
含一个含卟啉的活性位点。
优选这种电化学过程中使用修饰过的金电极。
根据本发明的另一方面，修饰电极使之适于无介体时进行酶的电化
学的过程包括用肽处理电极。
优选这种酶是单加氧酶。
这个酶有双铁或含卟啉的活性中心是合适的。
这个肽包含一个六肽是方便的。
优选地这个六肽包含cys和lys。
这个六肽是lys-cys-thr-cys-cys-ala是合适的。
方便的话，这种处理包括在六肽溶液里进行伏安循环(cycling)处
理电极，同时避免电极的还原清洗。
根据本发明的另一个方面，底物在分子氧在有酶存在的情况下发生
氧化的过程包括在无介体情况下发生的直接电化学。
在本发明的一个实施方案中，这个酶是单加氧酶。
在本发明的另一个实施方案中，这个酶有一个含双铁中心或卟啉的
活性位点。
底物可能是甲烷(可氧化至甲醇)或是樟脑(被氧化至5-外-羟
基樟脑)，或底物包括多环芳香烃(可被氧化至5-外-羟基樟脑)。
这个羟化酶优选来自细胞色素P450cam。
半胱氨酸从反应介质中移去是很合适的。
我们发现电极表面被修饰后表面更均一以便酶吸附。
我们相信，对于荚膜甲基球菌(Bath)中羟化酶组分与电极之间的
电子传递来说，带正电的表面是更优选的。六肽中lys残基的ε氨基
据设想可以很好地完成这一任务。这种特定肽链电化学修饰过的电极与
化学吸附(将电极简单浸泡于肽溶液)的电极相比，肽层更稳定，表面
更均一。
电极可以是修饰后的金电极，例如，用六肽lys-cys-the-cys
-cys-ala修饰后的金电极。这种处理过程包括将电极在六肽溶液中循
环，同时避免电极的还原清洗。
蛋白B和蛋白B′对羟化酶溶液的电化学起着很重要的作用。混合价
态的EPR光谱分析表明蛋白B与羟化酶结合改变了双铁位点周围的环
境。在以前的每一个研究中也观察到了电势的迁移。
形成羟化酶·蛋白B复合物会改变双铁位点的性质，影响产物分布，
提高sMMO催化过程中某些中间体的形成速率。所有这些效应都可以归
结于蛋白B与羟化酶结合后会诱导其构象变化，从而导致活性位点的构
象变化。我们发现在蛋白B存在时羟化酶的氧化还原电势会改变，这一
点在以前的研究中也曾观测到。有人认为蛋白B结合后导致的氧化还原
电势的负迁移是因为离子的第一配位球的改变或是羟离子离子化状态的
改变。其他原因如蛋白B结合使得构象变化从而导致溶剂易达性或活性
位点周围环境结构的改变也可以引起电势的变化。我们估计Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)
复合物的Kd是2.06±0.23M，Fe(Ⅱ)Fe(Ⅲ)的Kd是7.01±0.45M。因
此氧化还原电势的降低可能仅仅是羟化酶与蛋白B之间亲合力下降的一
个反映，而亲合力又和前者的氧化状态有关。
在荚膜甲基球菌酶系统中，用常规方法纯化出二种调节蛋白B，它
们是全长和12aa缺失体，pr B′，用表面等离子体振子共振进行结合实
验表明pr B′也可以和全氧化羟化酶形成复合物，但稳定性比原复合物差
三倍。我们的研究表明，pr B′和pr B结合在羟化酶同一位点上，只是
pr B′的结合不能使之产生同样的构象改变，从而影响双铁中心的构象变
化，氧化还原电势的电位及其他一系列活性位点的性质。因此形成缺失
体pr B′可能在生物体内有某些调节作用。在某些情况下，pr B被降解
成pr B′，然后羟化酶的构象就发生了变化(紧跟着活性位点的性质也发
生了改变)，这样细胞在应急情况下就会保存有限的能源。我们已经发
现，用象可溶性甲烷单加氧酶一样大小的非电子传递蛋白进行不需介体
介入的直接电化学是可能的。
就象以前提到的，这个过程可能是甲烷氧化至甲醇或樟脑氧化至5
-外-羟基樟脑，特别是用细胞色素P450来源的羟化酶将樟脑氧化至5
外-羟基樟脑。在后一个过程中，我们发现从反应基质中去除cys是
很有益的。
在樟脑中培养的恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)中的含卟
啉的羟化酶是研究在分别位于两个蛋白中的两个氧还中心间进行电子传
递的理想模型。
细胞色素P450催化D-(+)-樟脑加氧生成5-外羟基樟脑，
这个过程需要两个还原力。通过FAD-黄素蛋白假单孢氧还蛋白还原酶
和假单孢蛋白铁硫蛋白的联合作用，电子从NADH传递到P450血红素
铁上。Mossbauer及EPR研究表明，樟脑结合后导致血红素光谱剧烈变
化是因为高铁血红素中铁的自旋状态从无底物的低自旋转为底物结合的
高自旋。而且樟脑结合后导致的自旋改变使氧化还原电势从-540 mV
变为-414 mV(相对于饱和甘汞电极)。血红素还原电势的迁移是P450
催化循环中的关键，这样可从使假单孢氧还蛋白释放出第一个电子而开
启整个催化循环。
我们发现阴极峰电流对结合有樟脑的P450cam的扫描速率(scan
rate)的平方根表现出线性相关，表明这个过程是受扩散控制的。
然而在不含樟脑的酶中也观察到对线性的偏离，这可能有两个原
因，一是酶在电极表面的吸附，二是电子传递的不均一性使该过程不再
受扩散控制。第一种原因不大可能，因为含樟脑和不含樟脑的球形结构
都很相似，因此对电极有相似的亲合力。因此这就暗示了向不含樟脑的
形式的不均一电子传递速率要比向含樟脑的慢。这可能要部分归结于从
六配位，低自旋的不含樟脑的酶转化为五配位高自旋的亚铁状态所需的
高度组织状态，这一点会导致血红素结合的水的丢失。这一点和肌红蛋
白的还原很相似，和在Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)状态有六个配位铁的细胞色素还
原相比，肌红蛋白有较高的重组能。
在含樟脑的P450cam中，Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)型中都含有5个配位键，
高自旋的血红素铁，所以均质和异质电子传递的重组障碍都应该较低。
P450cam在带负电的裸电极表面的电化学反应提示，尽管蛋白(pl
=4.55)在pH 7.4带负电荷，带正电的表面氨基酸的特定排列仍然有利
于酶与电极表面的相互作用，使得异质电子传递能够发生。计算机模拟
及突变研究表明在P450与假单孢氧还蛋白形成的复合物中P450cam表
面的碱性氨基酸Arg-72,Arg-112,Arg-364,Lys-344和
P450表面的酸性氨基酸相互作用。从P450高分辨率的晶体结构看，这
些残基都在血红素的近侧端，位于酶当中最靠近(大约10A)血红素的
表面。既然电子传递速率常数通常会因为供受体分离而下降，那么我们
就可以这样推想，P450cam表面这个区域既是假单孢氧还蛋白的结合位
点，也是和电极相互作用的区域。这就说明了这些带正电荷的残基也参
与了P450cam和裸cpg电极之间的相互作用。
这样一个刨边石墨电极在向P450cam最初电子传递中，可以取代(生
理)电子传递蛋白链，这种直接电子传递是底物依赖的。
这个发明还将进一步阐明，主要通过例子来说明，相关例子与图表
附后。
图1显示用lys-cys-thr cys-cys-ala修饰的电极，在40mM
MOPS,pH 7.0,23.6mM羟化酶的差异伏安图(背景电流已经去除)。
图2A、2B逐渐升高的pr B(1)pr B′(2)对第一，第二电子传递电
势的影响，羟化酶浓度=21mM,[MOPS]=40mM,pH 7.0，电极在测
量前已经测量过。
图3A、3B显示在有pr B′存在时，逐渐升高的pr B的浓度时第一，
第二电子传递电势的影响，羟化酶浓度=21mM,[B′]=4mM,40mM,
pH 7.0。
图4显示细胞色素P450cam的循环伏安图。
图5显示阴极峰电流对结合樟脑和不结合樟脑的细胞色素P450的电
势扫描率的依赖。
实施例
(Ⅰ)酶的生产
荚膜甲基球菌(Bath)的培养如文献所述，Pilkington,S.J.&
Delton,H.(1990)“来自荚膜甲基球菌的甲烷单加氧酶(Bath)”,
酶学方法，188,181-190，
在羟化酶和蛋白B纯化过程中，使用了下述修改方法：在最初离子
交换后，羟化酶再用Superdex 200进行凝胶过滤，最后一步纯化是将纯
羟化酶从Mono Q离子柱上用0-30％梯度的1M MaCl洗脱下来。
pr B用相同的方式洗脱下来，只是凝胶过滤填料改为Superdex 75。
(ⅱ)电极的改进
金电极用如下方法修饰。将电极浸泡于5mM六肽溶液(lys-cys
-thr-cys-cys-ala)的还原电势中进行循环，当进行还原循环时
注意勿超过-0.85V，因为质子被还原至氢原子具有还原性清洗金表面
的效应。因此十个循环就够了。用来修饰金电极的六肽从Sigma Chemical
Company,Poole,Dorset购买。
(ⅲ)氧化还原电势测定
羟化酶双铁中心的氧化还原电势用差异脉冲伏安法(DPV)测定。
用DPV法对sMMO羟化酶进行测定，在阴极扫描中产生两个峰4±
10(图1的峰1)及-386±144 mV(图1的峰2)。这两个峰可以归
结为转移至羟化酶双铁中心的第一和第二个电子。
DPV测量法是用常用静态多晶全圆盘电极(4mm)在小体积(300
-400ml)三电极，两分隔的玻璃小槽中进行。饱和甘汞电极
(Radiometer K-401)作为参比电极。所有实验均在40mM MOPS,
pH 7.0,23℃进行。
(ⅳ)蛋白B和B′的作用
而且对蛋白B和B′在氧化还原中的效应也进行测定。
进一步的实验在溶液中加入了蛋白B，用差异伏安法测定了蛋白B
存在时对羟化酶直接电化学的影响。在这些实验中，蛋白B：羟化酶最
高比例2∶1，再高的比例导致这二个峰电流均降至可忽略的水平，可能
是由于电极的污染。电极在测量前用各种不同浓度的蛋白B进行修饰以
保证最大的均一性及对电极的新鲜覆盖。正如图2所示，提高蛋白B的
浓度导致第一，二峰电势向更负方向移动。然而每个电势迁移不同，第
一个电势的总迁移为29mV，第二个是47mV。这是由羟化酶双铁中心
在混合价态或全还原状态时对蛋白B不同结合常数导致的。按照Klotz,I.
M.和Hunston,D.L.(1970)“多类结合位点的特征图示”Biochem,
10,3065-3069报道的方法分别测定了pr B对Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ)和
Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)二种形式羟化酶的解离常数。这一点可从图2看出来，加入
pr B′这种突变形式的pr B对sMMO羟化酶的电化学没有影响。然而在
B+B′混合物中，pr B对电势迁移的效应变得不太显著，对两种还原状
态的Kd值均观察到了些许升高。在pr B′存在下，混合价态羟化酶-蛋
白B的Kd=3.49±0.17M，全还原状态为Kd=8.50±0.20M。这个发
现表明在B+B′混合物中，羟化酶的还原受到限制。在不同研究条件
下羟化酶蛋白B的还原电势，结合常数均列于表1。
表1
sMMO羟化酶(来源于～)的还原电势(mV相对于饱和甘汞电板)
和结合常数。实验条件如材料方法中所述。
组成成分
E′(mV)
E″(mV)
kd,mMFe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)
kd,mMFe(Ⅱ)Fe(Ⅱ).B
羟化酶23mM
+4±10
-386±14
2.06±0.23
7.01±0.45
羟化酶17mM+
蛋白B 8mM+
-25±14
-433±8
2.06±0.23
7.01±0.45
羟化酶17mM+
蛋白B 8mM+
蛋白B′4mM
-13±17
-430±9
3.49±0.17
8.50±0.20
以前的sMMO中羟化酶组分的氧还属性的研究对每个电子传递步
骤，给出了很宽的氧化还原电势的范围。荚膜甲基球菌(Bath)的表观
氧化还原电势用氧化还原指示剂滴定法和EPR光谱法进行了测定。还原
程度的监测全部用混合价态特征EPR谱的自旋定量进行。Woodland等
报道值是E′=-106mV,E″=-26mV,Liu的结果是E′=-196mV,E″
=-379mV，最近测量E′=-144mV,E″=-344mV。
在发孢甲基弯菌OB3b sMMO的研究中，Mossbauer光谱法作为
EPR光谱法的平行对照来确定还原态的浓度。发孢甲基弯菌OB3b
sMMO滴定测得表观电势为E′=-168mV,E″=-233mV。
这些sMMO羟化酶的氧化还原电势值列于表2。在本研究中，每一
个电子传递的氧化还原电势都用修饰的金电极用直接电化学法进行了测
定。Fe(Ⅲ)Fe(Ⅲ)还原至Fe(Ⅱ)Fe(Ⅲ)的电势为4±10mV，而形成完全
还原态的电势为-368±10mV。这些数值和以前报道的有差异，如前所
述，这些数值之间也有差异(表2)。现在对这些差异的原因还没有一
个明确的解释。可能的因素有不同的样品制备方法，样品纯度，蛋白活
性以及发孢甲基弯菌OB3b和荚膜甲基球菌(Bath)羟化酶形态上的差
异。然而从这二种生物来源的羟化酶有十分相同的光谱学特性，相似的
同源性及相似的底物特异性。因此必须得考虑导致电化学结果差异的其
他原因。有人建议仅以sMMO羟化酶中的三种还原状态中的一种的EPA
谱的绝对测量值作为全部还原程度的指标可能是错误来源之一。另一个
差异来源可能在于方法本身。以前的多组分反应混合物包括一系列氧化
还原染料(以校准电势轴)，以连二亚硫酸盐或还原的甲基紫精作为还
原剂，二茂铁羧酸做氧化剂。蛋白及这些组分之间的相互作用可能会影
响氧化还原电势，已有氧化还原指示剂和羟化酶相互作用的报道。而且
温度也会影响电势。EPR和Mossbauer测量在4.2-18K进行。
表2
报道的sMMO羟化酶组分的还原电势的总结
蛋白来源
E′mV(vs NHE)
E″,mV(vs NHE)
参考文献
荚膜甲基球菌(Bath)
+106(+350)
-269(-25)
6
荚膜甲基球菌(Bath)
-144(+100)
-344(-100)
1
荚膜甲基球菌(Bath)
-196(+48)
-379(-135)
7
发孢甲基弯菌OB3b
-168(+76)
-223(+21)
8
荚膜甲基球菌(Bath)
+4(+248)
-386(-142)
本工作
表1显示了当双铁中心处于不同的氧化状态时的氧化还原电势与结
合于羟化酶中蛋白B的关系。虽然荚膜甲基球菌(Bath)和发孢甲基弯
菌OB3b的还原电势有差异(表2)，但是这两种Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ).B复合
物的解离常数是相似的，前者Kd=2.06mM，后者Kd=1.7mM。然
而Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ).B复合物的解离常数却差异很大，荚膜甲基球菌
(Bath)Kd=7.01mM,OB3b Kd=500mM。
在将进行电化学还原的羟化酶溶液中加入蛋白B′出现了有趣的现
象。蛋白B′本身对羟化酶的氧化还原电势无任何影响，然而在蛋白B′存
在时，蛋白B的结合变弱，Kd值升高，Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ)复合物Kd=3.49
±0.17M，Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)复合物为8.5±0.2M。这说明蛋白B′也可以结合
羟化酶，但结合不牢固，这与SPR结果相一致。
(ⅴ)电化学
sMMO羟化酶双铁中心的不需介导的直接电化学用修饰后的金电极
进行。
(ⅵ)细胞色素P450cam的应用
图4显示了刨边石墨电极的循环伏安图，(1)15M细胞色素pH 7.4
(2)18M细胞色素P450cam,40mM K3PO4,pH 7.4,1mM D-(+)-
樟脑。结合有樟脑的酶在-390±10mV时产生相似形状的反映(图4)。
图5显示了结合有樟脑和未结合樟脑的细胞色素P450cam的阴极峰电流
对电势扫描率的依赖。条件如图1，温度为18℃。阴极峰电流对结合樟
脑的P450cam扫描率的平方根显示了线性依赖，说明全过程是由扩散决
定的。
(ⅶ)樟脑到5-外(exo)-羟基樟脑的转化
已经了解了细胞色素P450cam的电化学，所以该酶用于将樟脑转化
为5-外-羟基樟脑。用Eastman膜AQ40将该酶局限于电极表面，电
势从±0.2V缓慢变至-0.8V，变化速率为50mV/s，分子O2加入溶液
中间隔地对体系中的5-外-羟基樟脑进行分析。2小时后，5-外-羟
基樟脑达到100％。
尽管现在这些说明包括关于一些这里进行的反应的机理的理论推
断，这并不表明本发明就被局限于这些论断中。