大黄鱼线粒体分子标记及用于养殖群体与野生种群的鉴别.pdf

大黄鱼线粒体分子标记及用于养殖群体与野生种群的鉴别。鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群的线粒体分子标记为4个碱基的差异。鉴别步骤为设计合成一对保守引物L14841：5′－CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA－3′；H15149：5′－GCCCCTCAGAATGATATTTGT CCTCA－3′；对养殖与野生种群的线粒体DNA中细胞色素B(cyt b)基因进行PCR扩增；扩增结果经纯化；测序，对比测序结果。由4个群体大黄鱼mtDNA Cytb基因324bp序列排序结果可以看出大黄鱼养殖群体与野生群体存在4个碱基的差异，表现为1个颠换，3个转换。其结果稳定，可重复性强。3个野生群体的扩增结果一致。4个碱基的差异可作为区分养殖与野生群体的分子标记。鉴别方法简单。

1、  鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群的线粒体分子标记为
NDHY CTACTCGCCCTCTGTCTAGGCGCCCAAATCCTCACAGGACTCTTCCTCGCTATACACTAC 60
DDHY ************************************************************ 60
MDHY ************************************************************ 60
YDHY ********************************************************T*** 60
ruler 1.......10........20........30........40........50........60
NDHY ACATCCGACGTCACCATGGCCTTTTCATCTGTCGCACACATCTGCCGTGACGTAAACTAC 120
DDHY ************************************************************ 120
MDHY ************************************************************ 120
YDHY *****G****************************************************** 120
ruler ........70........80........90.......100.......110.......120
NDHY GGGTGACTCATCCGAAATCTCCACGCTAATGGTGCCTCTTTCTTTTTCATCTGCCTCTAC 180
DDHY ************************************************************ 180
MDHY ************************************************************ 180
YDHY ************************************************************ 180
ruler .......130.......140.......150.......160.......170.......180
NDHY CTCCATATTGGCCGAGGCCTCTACTATGGCTCCTATCTTTACAAAGAGACATGAAACATC 240
DDHY ************************************************************ 240
MDHY ************************************************************ 240
YDHY ******************************************C***************** 240
ruler.......190.......200.......210.......220.......230.......240
NDHY GGAGTCGTACTCTTTCTCCTTGTAATAATGACCGCTTTTGTTGGCTATGTGTTACCTTGA 300
DDHY ************************************************************ 300
MDHY ************************************************************ 300
YDHY **************************************************A********* 300
ruler.......250.......260.......270.......280.......290.......300
NDHY GGACAAATATCATTCTGAGGGGCA 324
DDHY ************************ 324
MDHY ************************ 324
YDHY ************************ 324
 ruler.......310.......320....
其中“*”表示相同的碱基序列位点，NDHY：海南沿海硇洲族野生大黄鱼；DDHY：浙江、江苏沿海岱衢族野生大黄鱼；MDHY：福建、广东东部沿海闽粤东族野生大黄鱼；YDHY：闽粤东族养殖大黄鱼。 

2、  鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群的方法，其特征在于其步骤为
1)、设计合成一对保守引物L14841：5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’；H15149：5’-GCCCCTCAGAATGATATTTGT CCTCA-3’；
2)、对大黄鱼养殖群体与野生种群的线粒体DNA中细胞色素B(cyt b)基因进行PCR扩增，扩增程序为95℃ 5min→(94℃60sec→55℃60sec→72℃80sec)×35 cycles→72℃5min→4℃∞；
3)、扩增结果经纯化；
4)、测序，对比测序结果。

3、  如权利要求2所述的鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群的方法，其特征在于所说的PCR扩增的反应体系组成为：

0.  2mL PCR薄壁管中依次加入：10×buffer 5μL，Mg²⁺(25mM)3.5μL，dNTP(2.5mM)4μL，模板(100ug/mL)1μL，Ex Taq(5U/mL)0.25μL，Primer(20μM)各1μL，无菌水定容至50mL。

大黄鱼线粒体分子标记及用于养殖群体与野生种群的鉴别
技术领域
本发明涉及一种动物的标记，尤其是大黄鱼线粒体分子标记以及用于鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群。
背景技术
目前用于鉴别野生和养殖大黄鱼的方法还没有见正式报道。渔民一般根据大黄鱼地体色以及眼睛直径的大小等经验来判断大黄鱼是养殖的或是野生的。一般消费者是根据价格来判断，野生的1斤120～260元不等，养殖的1斤20元左右。由于经验也常出错，价格存在欺诈，因此这两种方法不能作为区别养殖和野生大黄鱼的可靠标准，特别是存在纠纷的情况下，就需要一种稳定可靠的鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群的线粒体分子标记。
本发明的另一目的在于提供一种鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群的方法。
本发明所说的鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群的线粒体分子的标记为：
NDHY CTACTCGCCCTCTGTCTAGGCGCCCAAATCCTCACAGGACTCTTCCTCGCTATACACTAC 60
DDHY ************************************************************ 60
MDHY ************************************************************ 60
YDHY ********************************************************T*** 60
ruler 1.......10........20........30........40........50........60
NDHY ACATCCGACGTCACCATGGCCTTTTCATCTGTCGCACACATCTGCCGTGACGTAAACTAC  120
DDHY *************************************************************  120
MDHY ************************************************************* 120
YDHY *****G*******************************************************120
ruler ........70........80........90.......100.......110.......120
NDHY GGGTGACTCATCCGAAATCTCCACGCTAATGGTGCCTCTTTCTTTTTCATCTGCCTCTAC 180
DDHY ************************************************************ 180
MDHY ************************************************************ 180
YDHY ************************************************************ 180
ruler .......130.......140.......150.......160.......170.......180
NDHY CTCCATATTGGCCGAGGCCTCTACTATGGCTCCTATCTTTACAAAGAGACATGAAACATC 240
DDHY ************************************************************240
MDHY ************************************************************ 240
YDHY ******************************************C*****************240
ruler.......190.......200.......210.......220.......230.......240
NDHY GGAGTCGTACTCTTTCTCCTTGTAATAATGACCGCTTTTGTTGGCTATGTGTTACCTTGA 300
DDHY ************************************************************ 300
MDHY ************************************************************ 300
YDHY **************************************************A********* 300
ruler.......250.......260.......270.......280.......290.......300
NDHY GGACAAATATCATTCTGAGGGGCA  324
DDHY ************************  324
MDHY ************************  324
YDHY ************************  324
ruler.......310.......320....
其中“*”表示相同的碱基序列位点，NDHY：海南沿海硇洲族野生大黄鱼；DDHY：浙江、江苏沿海岱衢族野生大黄鱼；MDHY：福建、广东东部沿海闽粤东族野生大黄鱼；YDHY：闽粤东族养殖大黄鱼。
本发明所说的鉴别大黄鱼养殖群体与野生种群的方法为：
1、设计合成一对保守引物L14841：5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’；H15149：5’-GCCCCTCAGAATGATATTTGT CCTCA-3’；
2、对大黄鱼养殖群体与野生种群的线粒体DNA中细胞色素B(cyt b)基因进行PCR扩增，扩增程序为95℃5min→(94℃ 60sec→55℃ 60sec→72℃ 80sec)×35 cycles→72℃5min→4℃∞；
3、扩增结果经纯化；
4、测序，对比测序结果。
所说的PCR扩增的反应体系组成可为：
0.2mL PCR薄壁管中依次加入：
10×buffer                        5μL
Mg²⁺(25mM)                       3.5μL
dNTP(2.5mM)                       4μL
模板(100ug/mL)                    1μL
Ex Taq(5U/mL)                     0.25μL
Primer(20μM)                     各1μL
无菌水定容至50mL。
由4个群体大黄鱼mtDNA Cytb基因324bp序列排序结果可以看出大黄鱼养殖群体与野生群体存在4个碱基的差异，表现为1个颠换，3个转换，分别为第57(C→T)、223(A→C)、291(G→A)碱基是转换，第66碱基是颠换(C→G)。其结果稳定，可重复性强。大黄鱼3个野生群体(硇洲族野生大黄鱼、闽粤东族野生大黄鱼、岱衢族大野生黄鱼)的扩增结果一致，表现出高度的一致性。因此这4个碱基的差异可以作为区分大黄鱼养殖群体与野生群体的分子标记。同时，鉴别方法简单。
具体实施方式
实施例1：选用硇洲族野生大黄鱼与市场养殖大黄鱼，设计合成一对保守引物L14841：5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’；H15149：5’-GCCCCTCAGAATGATATTTGT CCTCA-3’；对其线粒体DNA中细胞色素B(cyt b)基因进行PCR扩增，扩增程序为95℃ 5min→(94℃ 60sec→55℃ 60sec→72℃ 80sec)×35 cycles→72℃ 5min→4℃∞；扩增结果经纯化、测序，对比测序结果。
实施例2：与实施例1类似，其不同在于野生大黄鱼选用闽粤东族野生大黄鱼。
实施例3：与实施例1类似，其不同在于野生大黄鱼选用岱衢族大野生黄鱼。
由实施例1-3的测序结果表明，大黄鱼的3个野生群体的扩增结果一致，结果稳定，可重复性强。