交叉反应活性提高的抗体的制备和使用方法.pdf

本发明涉及对感染性生物免疫原类型变异所产生的抗原交叉反应活性提高的抗体的制备方法。所述方法包括用衍生自该感兴趣抗原的免疫原制品免疫动物。本发明也包括利用交叉反应活性提高的抗体的方法、和利用这种抗体的试验和试剂盒。

1.  至少一种对存在一种以上免疫原类型的感染性生物的交叉反应活性提高的抗体的制备方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型，所述方法包括以下步骤：
a)提供衍生自所述至少一种抗原变异的多免疫原制品；
b)用所述多免疫原制品免疫至少一种动物；
c)从所述经免疫的至少一种动物选择至少一种抗体；其中，相对于用衍生自所述至少一种感染性生物的单免疫原免疫动物所得的抗体，所选择的至少一种抗体对所述感染性生物的交叉反应活性提高。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择的至少一种抗体是多克隆抗体。

3.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择的至少一种抗体是单克隆抗体。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择的至少一种抗体是抗体片段。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种动物是哺乳动物。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种动物是鸟类。

7.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是家兔。

8.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是小鼠。

9.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是山羊。

10.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是绵羊。

11.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是马。

12.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是非人灵长类动物。

13.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。

14.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述感染性生物是未分型流感嗜血菌。

15.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述多免疫原制品得自多种未分型流感嗜血菌OMP2免疫原类型的OMP2蛋白。

16.  如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括分离自细胞外膜的OMP2蛋白。

17.  如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括不是分离自细胞外膜蛋白的OMP2蛋白。

18.  如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括至少一种OMP2蛋白片段。

19.  如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括重组蛋白。

20.  如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括融合蛋白。

21.  如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括模拟表位。

22.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述多种未分型流感嗜血菌OMP2菌株包括2到4种菌株。

23.  如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述多种未分型流感嗜血菌OMP2菌株包括5种或5种以上菌株。

24.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，还提高了所述选择的至少一种抗体对所述感染性生物的亲和力。

25.  如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述提高包括采用亲和分离。

26.  如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述提高包括采用展示技术。

27.  检测存在一种以上免疫原类型的感染性生物的方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型，所述方法包括以下步骤：
a)提供怀疑含有所述至少一种抗原变异的样品；
b)提供至少一种通过权利要求1所述方法产生的抗体；
c)在允许所述至少一种抗体与所述至少一种抗原变异结合形成复合物的条件下，使所述样品与所述至少一种抗体接触；
d)检测所述复合物，其中如果所述样品中所述感染性生物的浓度大于或等于参比浓度，则所述检测为阳性，如果所述样品中所述感染性生物的浓度小于参比浓度，则所述检测为阴性。

28.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述选择的至少一种抗体是多克隆抗体。

29.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述选择的至少一种抗体是单克隆抗体。

30.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述选择的至少一种抗体是抗体片段。

31.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述至少一种动物是哺乳动物。

32.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述至少一种动物是鸟类。

33.  如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是家兔。

34.  如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是小鼠。

35.  如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是山羊。

36.  如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是绵羊。

37.  如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是马。

38.  如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是非人灵长类动物。

39.  如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。

40.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述感染性生物是未分型流感嗜血菌。

41.  如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述多免疫原制品衍生自多种未分型流感嗜血菌OMP2免疫原类型的OMP2蛋白。

42.  如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括分离自细胞外膜的OMP2蛋白。

43.  如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括不是分离自细胞外膜蛋白的OMP2蛋白。

44.  如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括至少一种OMP2蛋白片段。

45.  如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括重组蛋白。

46.  如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括融合蛋白。

47.  如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述OMP2蛋白包括模拟表位。

48.  如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述多种未分型流感嗜血菌OMP2菌株包括2到4种菌株。

49.  如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述多种未分型流感嗜血菌OMP2菌株包括5种或5种以上菌株。

50.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，还提高了所述选择的至少一种抗体对所述感染性生物的亲和力。

51.  如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述提高包括采用亲和分离。

52.  如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述提高包括采用展示技术。

53.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，以多种形式采用所述至少一种抗体。

54.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗体包含可检测标记。

55.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗体包含官能基团。

56.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗体还能与模拟衍生自所述感染性生物的所述至少一种抗原变异的至少一种模拟表位结合。

57.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述阳性检测任选至少是半定量检测。

58.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法还包括同时或平行检测多种感染性生物。

59.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗原变异是经修饰的。

60.  实施权利要求27所述方法的试剂盒。

61.  对存在一种以上免疫原类型的感染性生物的交叉反应活性提高的抗体的选择方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型，所述方法包括以下步骤：
a)提供衍自所述至少一种抗原变异的多免疫原制品；
b)免疫多组动物，其中所述每组包括至少一只动物，每只所述动物用单免疫原制品免疫；
c)从所述每组选择至少一种抗体；和
d)混合所述选择的抗体，
其中所选择抗体的混合物对所述感染性生物的交叉反应活性提高。

交叉反应活性提高的抗体的制备和使用方法
                            发明背景
发明领域
本发明总体上涉及免疫学和分子生物学领域，具体地说，涉及制备与感染性生物免疫原类型(immunotypic)变异的抗原具有交叉反应活性的抗体及其使用方法。
发明简述
本发明涉及对存在一种以上免疫原类型(immunotype)的感染性生物的交叉反应活性提高的抗体的制备和使用方法。具体地说，本发明涉及多免疫原制品的应用，其中所述免疫原源自感兴趣的感染性生物免疫原类型变异导致的抗原变异。本发明也公开了交叉反应活性提高的所选抗体的用法并要求了其权益。
本发明第一方面包括至少一种对存在一种以上免疫原类型的感染性生物交叉反应活性提高的抗体的制备方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型。
本发明的第二方面包括对存在一种以上免疫原类型的感染性生物的检测方法，其中由于至少一种抗原变异导致了所述免疫原类型。这些方法可采用本发明所述的交叉反应活性提高的合适抗体。
本发明的第三方面包括对存在一种以上免疫原类型的感染性生物的检测试剂盒。这种试剂盒采用了本发明的第二种方法。
本发明的第四方面包括对至少一种对存在一种以上免疫原类型的感染性生物交叉反应活性提高的抗体的第二种制备方法，其中由于至少一种抗原变异导致了所述免疫原类型。

附图简述
图1描述了在变性条件下电泳分离未分型(non-typeable)流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)不同菌株分离的外膜蛋白(OMP2)制备物的银染色聚丙烯酰胺凝胶的代表性例子。如凝胶左侧的分子量所示，泳道1和9含有分子量标记。泳道2含有菌株19418的OMP2。泳道3、5、7、8和10含有菌株49401的OMP2。泳道4含有菌株53600的OMP2。泳道6含有菌株51997的OMP2。
图2描述了用包被有8种流感嗜血菌菌株细菌全细胞的板进行ELISA滴定试验的结果，包括已分型(typeable)的流感嗜血菌9006(a型)、9008(d型)、10211(b型)和51654(b型)。测试血液取自2003年7月7日。在针对8种流感嗜血菌菌株的全细胞滴定试验中比较了对每种免疫方案应答反应最强的3只家兔的抗血清反应。51997/49401/49766 OMP2多免疫原方案所产生的抗体观察到的总体滴度和总体交叉反应活性高于51997 OMP2单一免疫原方案所产生抗血清观察到的。
图3描述了一种浓度(每毫升0.5微克)的从2003年7月5日测试血液中亲和纯化的抗-OMP2抗体的代表性ELISA试验结果。用包被有6种NTHi菌株(51997、49766、49401、53600、19418和43163)纯化OMP2蛋白(20纳克每孔)的Immulon-4板进行ELISA试验。使亲和纯化的抗-OMP2抗体与固定的抗原结合，用偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗-家兔IgG检测结合的抗-OMP2抗体。用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色板孔并检测630nm吸光度。51997/49401/49766OMP2多免疫原方案所产生的抗体观察到的总体信号高于51997OPM2单一免疫原方案。
图4描述了从2003年7月5日测试血液中亲和纯化的抗体的ELISA试验结果。用未分型流感嗜血菌全细胞(菌株49766、53600和49401)包被微量滴定板。细胞浓度为每孔约10⁷到10⁸个细胞时，51997/49401/49766OMP2多免疫原方案所产生的抗体观察到的信号高于51997 OPM2单一免疫原方案所产生抗体。细胞浓度为每孔约10⁴到10⁶个细胞时，抗体过量，导致所观察到的信号大致相当。
                            发明详述
引言
本发明认识到某些感染性生物存在一种以上免疫原类型，其中由于至少一种感染性生物的抗原中发现的变异导致所述多种免疫原类型。免疫原类型变异可导致难于通过免疫化学方法检测是否存在这种感染性生物或测定其水平，因为其抗体通常不具有足够的交叉反应活性或敏感性而检测出样品中可能存在的所有或基本上所有的感兴趣免疫原类型菌株。然而常需要检测或监测这种感染性生物的存在与否或水平，而无论样品中免疫原类型的异质性。免疫原类型变异也可导致难于开发针对存在多种免疫原类型或能较快地从一种免疫原类型突变为另一种免疫原类型的病原体疫苗。出于这些原因，有效地产生对多种免疫原类型具有所需交叉反应活性和敏感性的抗体制备物是令人感兴趣的。这种抗体可用于免疫化学诊断、抗原的亲和分离、或抗原标记(例如，原位标记)、抗原变异、进化或流行病学研究，疫苗开发或预防或治疗对象的感染性疾病。患者感染性疾病状态的免疫化学诊断特别需要利用这种交叉反应活性和敏感性提高的抗体。
本发明提供对存在多种免疫原类型的感染性生物交叉反应活性提高的抗体的制备和选择方法，以及检测这种感染性生物的方法和试剂盒。
作为本发明内容的非限制性介绍，本发明总体上包括几个有用的方面，包括：
1)至少一种对存在一种以上免疫原类型的感染性生物交叉反应活性提高的抗体的制备方法，其中由于至少一种抗原变异导致了所述免疫原类型，所述方法包括以下步骤：(a)提供衍生自所述至少一种抗原变异的多免疫原制品；(b)用该多免疫原制品免疫至少一种动物；和(c)选择经此免疫的至少一种动物所产生的至少一种抗体；其中相对于用衍生自至少一种感染性生物的一种免疫原免疫动物所得的抗体，所选择的至少一种抗体对该感染性生物的交叉反应活性提高。
2)检测存在一种以上免疫原类型的感染性生物的方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型，所述方法包括以下步骤：(a)提供怀疑含有至少一种抗原变体的样品；(b)提供至少一种通过本发明第一种方法所产生的抗体；(c)在允许所述至少一种抗体与所述至少一种抗原变体结合并形成复合物的条件下使该样品与所述至少一种抗体接触；和(d)检测所述复合物，如果样品中感染性生物的浓度大于或等于参比浓度，则检测为阳性，如果样品中感染性生物的浓度小于参比浓度，则检测为阴性。
3)用于实施本发明第二种方法检测存在一种以上免疫原类型的感染性生物的试剂盒。
4)对存在一种以上免疫原类型的感染性生物交叉反应活性提高的抗体的选择方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型，所述方法包括以下步骤：(a)提供衍生自所述至少一种抗原变异的多免疫原制品；(b)免疫多组动物，其中每组包括至少一只动物，用单免疫原制品免疫每只动物；(c)选择每组动物产生的至少一种抗体；和(d)混合所选择的抗体，其中所选择抗体混合物对感染性生物的交叉反应活性提高。本发明第四种方法所产生的抗体可用于本发明检测感染性生物的方法和试剂盒中。
随着本文的进一步描述并结合附图可明白本发明的其它目的和优点。为完全了解本发明的范围，还应知道可以联合本发明的各方面内容以实现本发明理想的实施方案。
本申请提及了各种出版物。这些出版物的内容全文纳入本申请作为参考。引用这些文献并非承认它们中的任一份为相关的现有技术。这些文献的日期的所有声明或对内容的表述根据申请人可得到的信息，并非承认这些文献公开的日期或内容正确。
除非另有定义，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。总体上，本文所用的术语和下文所述的制备方法或实验室方法是本领域熟知常规使用的。如各种技术字典所示例的，本文所用的技术术语具有它们所应用领域中的常规含义。当某术语以单数给出时，本发明人也考虑了该术语的复数。本文所用的术语和下文所述的方法是本领域熟知且常规使用的。当纳入本文作为参考的参考文献的术语和定义中有差异时，本申请所用术语具有本文所给的定义。如各种技术字典(例如，《钱伯斯科技字典》(Chambers Dictionary of Science and Technology)，Peter M.B.Walker(编)，Chambers Harrap Publishers，Ltd.，Edinburgh，UK，1999，第1325页)所示例的，本文所用的技术术语具有它们所应用领域中的常规含义。如各种技术字典所示例的，本文所用的其它技术术语具有它们所应用领域中的常规含义。本发明人不想(将本发明)局限于作用机制或实施方式。所提供的参考文献只是为了说明目的。
I.制备交叉反应活性提高的抗体的方法
本发明包括对存在一种以上免疫原类型的感染性生物交叉反应活性提高的至少一种抗体的制备方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型，所述方法包括以下步骤：(a)提供衍生自至少一种抗原变异的多免疫原制品；(b)用该多免疫原制品免疫至少一种动物；和(c)选择经此免疫的至少一种动物所产生的至少一种抗体；其中相对于用至少一种感染性生物产生的一种免疫原免疫动物所得的抗体，所选择的至少一种抗体对感染性生物的交叉反应活性提高。
本发明的第一种方法可应用于存在一种以上免疫原类型的任何感染性生物。合适的感染性生物包括细菌(包括支原体)、病毒和真核病原体，例如但不限于：病原性真菌和原生动物。本发明的第一种方法更适宜应用于感染脊椎动物、无脊椎动物或植物的病原体。该方法最适宜应用于感染人、哺乳动物、鸟类、鱼、昆虫或植物的病原体。
免疫原类型指可通过免疫学方法测定，即可用抗体鉴别的感染性生物的类型、亚型、菌株或变体。免疫原类型包括但不限于血清学变体或“血清变型”，其中通常对整个生物进行血清学区分。可对整个或完整的生物、破裂的或裂解的生物或在生物的分离组分(例如，对分离的细胞组分或分离的碳水化合物或蛋白质抗原)进行免疫原类型测定。可对天然产生的抗原或对需要化学、物理、生物学或酶学修饰而(例如)能与抗体相互作用的抗原进行免疫原类型测定。
由于至少一种抗原变异，即在感染性生物的至少一种抗原中发现的变异导致免疫原类型变异。因此，所述的至少一种抗原变异导致至少两种不同的免疫原类型。抗原可包括但不限于：肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、糖蛋白、糖脂、脂蛋白、脂多糖、核酸和它们的组合。抗原可包括完整的分子、分子片段和多分子的复合物。由于至少一种抗原的某特性的一种或多种差异导致了抗原变体，所述特性例如有但不限于：分子量或大小、氨基酸的特定序列、多条氨基酸序列(无需是毗连的序列)的特定组合、糖基化、脂化、单体的缔合程度(例如，单体、二聚体、三聚体等)、磷酸化、电荷、膜的缔合程度、对抗体的可利用度或暴露程度、是否存在辅助因子等。在一些情况中，所述抗原变体可能是由于至少一种抗原的存在与否。在一些情况中，可利用存在一种以上抗原变异的一种抗原(例如，一种存在多种抗原性氨基酸序列的蛋白质或存在不同糖基化模式的抗原)来测定一种感染性生物的免疫原类型。在一些情况中，可利用一种以上的抗原（例如，数种表位、肽、蛋白质、碳水化合物或其它抗原的组合)来测定一种感染性生物的免疫原类型。
以下是感染性生物的免疫原类型的非限制性例子：
1.可利用主要的外膜蛋白，OMP2(一种表面抗原)的抗原性差异来测定未分型流感嗜血菌菌株的免疫原类型(Haase等，(1994)，Infect.Immun.，62：3712-3722；Groeneveld等，(1989)，Infect.Immun.，57：3038-3044)。
2.可利用荚膜多糖抗原的抗原性变体或肺炎球菌表面蛋白A(PsPA)的抗原变体来测定肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的免疫原类型(Crain等，(1990)，Infect.Immun.，58：3293-3299)。
3.可利用蛋白I的抗原性变体来测定淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的免疫原类型(Kohl等，(1990)，Eur.J.Epidemiol.，6：91-95)。
4.可利用脂多糖(LPS)的抗原变体来测定脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)的免疫原类型(Jennings等，(1999)，Microbiol.，145：3013-3021)。
5.可利用外膜蛋白F的抗原变体(Hughes等，(1992)，Infect.Immun.，60：3497-3503)或脂多糖O侧链的抗原变体(Goldberg等，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：10716-10720)来测定铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的免疫原类型。
6.甲型流感病毒的一些血清型可利用它们的血凝素(Plotkin等，(2002)，Proc.Nat’l.Acad.Sci.，USA，99：6263-6368)和神经氨酸酶(Colman，(1992)，Immunol.Cell Biol.，70：209-214)表面糖蛋白抗原的差异来区分。
7.可利用包括120-kDa包膜糖蛋白(gp120)V3区域的几种肽表位抗原变体的多种抗原变体(Zolla-Pazner等，(1999)，J.Virol.，73：4042-4051)来测定I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)的免疫原类型。gp120 V3表位特异性的单克隆抗体在整个基因型进化支中显示了广泛的交叉反应活性，证明了HIV-1 gp120 V3免疫原类型不同于基因型分类。已观察到gp120的C5区表位和gp41的簇I区表位在整个HIV-1基因型中具有类似的抗原交叉反应活性(Nyambi等，(2000)，J.Virol.，74：10670-10680)。
上述例子中引用的所有参考文献全文纳入本文作为参考。
本发明的第一种方法包括提供由至少一种抗原变异所产生的多免疫原制品的步骤。“多免疫原制品”包括以下内容：(i)由于一种抗原中发生的至少一种变异导致免疫原类型变异时(例如，所述抗原是存在于一条以上氨基酸序列中的肽表位时)，对每种抗原变异可制备至少一种免疫原制品；(ii)由于一种以上抗原变体导致免疫原类型变异时(例如，由于两种不连续的表位、蛋白质或其它抗原的变异导致免疫原类型变异时)，对这些抗原变异可制备至少一种免疫原制品。对大多数感兴趣的抗原变异优选可制备至少一种免疫原制品，更优选对每种感兴趣的抗原变异可制备至少一种免疫原制品。
可如本领域所知制备并使用免疫原制品(参见例如全文纳入本文作为参考的《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，E.Harlow和D.Lane编，冷泉港实验室，1988，第726页；《单克隆抗体：实用方法》(MonoclonalAntibodies：A Practical Approach)，P.Shepherd和C.Dean编，牛津大学出版社，2000，第479页；和《鸡蛋黄抗体，产生与应用：IgY-技术，(Springer实验室手册)》(Chicken Egg Yolk Antibodies，Production and Application：IgY-Technology，(Springer LabManual)，R.Schade等编，Springer-Verlag，2001，第255页)。免疫原制品得自抗原变异，可包含至少一种完整的抗原变体(例如，完整的蛋白质)或抗原变体的至少一部分(例如，半抗原或不连续的表位)。
所述免疫原可包括利用天然产生的抗原变体的至少一种天然存在的、合成的、重组方法合成的、或生物学方法或重组方法产生的同源物。在一个实施方案中，所述免疫原可包含多个连续的免疫原性部分(例如免疫原性肽或碳水化合物序列)，其中每个免疫原性部分与相邻的免疫原性部分毗邻。在另一实施方案中，所述免疫原可包含通过间隔臂或接头部分共价相连，或非共价相连的多个不连续的免疫原性部分(例如免疫原性肽或碳水化合物序列)。在一非限制性例子中，当抗原是蛋白质或肽时，所述免疫原可包含重组同源物、抗原表位的模拟表位(mimotope)同源物(参见例如，Roccasecca等，(2001)，Mol.Immunol.，38：485-492；Frasca等，(2003)，Hepatology，38：653-663)、或是能结合抗原的至少一种抗体或抗体片段的抗独特型抗体或抗体片段(参见例如，Vogel等，(2000)，J.Mol.Biol.，298：729-735)。在另一非限制性例子中，当所述抗原包含碳水化合物时，所述免疫原可包含抗原某表位的模拟表位同源物(参见，例如Harris等，(2000)，Infect.Immun.，68：5778-5784；Monzavi-Karbassi等，(2003)，Vaccine，21：753-760)、或是能结合该抗原的至少一种抗体或抗体片段的抗独特型抗体或抗体片段(参见，例如Hutchins等，(1996)，Mol.Immunol.，33：503-510；Sacks等，(1985)，J.Immunol.，135：4155-4159)。本段所引用的所有参考文献全文纳入本文作为参考。
所述免疫原可包含化学、物理、生物或酶修饰。这种修饰包括但不限于：用化学试剂或酶处理该免疫原，加热或冷却，化学或物理电离，氧化或还原，或掺入脂质体、乳液或胶束制备物中。当某免疫原产生自膜相关分子时(例如，膜结合或膜相连的蛋白质、受体或碳水化合物)，该免疫原可包含膜相关分子或基本上或完全与膜相分离的分子，可只包含表面暴露或埋在膜中分子的一部分或多个部分。可通过连接标记物或化学部分，通过改变免疫原的构型(例如，通过诱导分子内键形成)，或通过与载体分子(例如但不限于：牛血清白蛋白、卵白蛋白或匙孔血蓝蛋白)交联来修饰该免疫原(参见，例如全文纳入本文作为参考的R.P.Haugland，《荧光探针和研究产物手册》(Handbook of FluorescentProbes and Research Products)，第9版，J Gregory(编)，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA，2002，第966页；Seitz和Kohler，(2001)，Chemistry，7：3911-3925；《皮尔斯技术手册》(Pierce Technical Handbook)，PierceBiotechnology，Inc.，1994，Rockford，IL；和Pierce，2003-2004，《应用手册和目录》(Applications Handbook and Catalog)，Pierce Biotechnology，Inc.，2003，Rockford，IL)。所述免疫原可通过表达或连接于支架而修饰，例如但不限于使一个或多个表位表达或连接在多肽框架或其它分子框架上(参见，例如全文纳入本文作为参考的Skerra，2000，J.Mol.Recognit.，13：167；Kamb等，美国专利6,025,485；Christman等，Protein Eng.，12：797；Abedi等，1998，Nucleic AcidsRes.，26：623；和Peelle等，2001，J.Protein Chem.，20：507)。可将该免疫原天然或重组表达在生物或颗粒的表面，例如将一个或多个表位表达在细胞上(参见，例如Goldberg等，(1992)，Proc.Nat’l.Acad.Sci，USA，89：10716-10720)或病毒上(参见，例如全文纳入本文作为参考的Staczek等，(1998)，Infect.Immun.，66：3990-3994；和Brennan等，(1999)，Microbiology，145：211-220)。
本发明第一种方法也包括用多免疫原制品免疫至少一种动物的方法。适合于免疫的动物是能产生本发明第一种方法适用抗体的脊椎动物。优选用于免疫的动物包括但不限于：鸡、小鼠、大鼠、家兔、绵羊、山羊、牛、马、非人灵长类动物和人。可用一种或多种的多免疫原制品来免疫所述至少一种动物。当所述至少一种动物包括两只或多只动物时，可用相同或不同的免疫原制品或免疫原制品的混合物来免疫每只动物。当用多免疫原制品免疫所述至少一种动物时，可同时或顺序给予免疫原制品。
免疫原制品给药的非限制性例子如下：可用基本上未修饰的免疫原制品作为免疫原给予，例如合成的或重组的线形或非线形肽免疫原，完整的球状蛋白质，与膜组分结合的蛋白质，或整个或裂解的细胞。免疫原制品可任选包含佐剂，例如但不限于：完全或不完全弗氏佐剂、无机或金属盐(例如铝盐)和免疫刺激分子(参见，例如Homer等，(1998)，Cell.Immunol.，190：77-82)。可用包含能在体内表达感兴趣免疫原的编码核酸的分子来免疫从而给予免疫原(参见，例如Prinz等，(2003)，Immunol.，110：242-249)。免疫原制品可任选包含辅助性刺激因子(Frauwirth和Thompson，2002，J.Clin.Invest.，109：295)。合适的辅助刺激因子包括，例如对被免疫动物而言是外来的细胞因子、促分裂原、抗体、抗原呈递细胞(Mayordomo等，1997，Stem Cells，15：94)和辅助性T-淋巴细胞表位的肽。辅助性刺激因子可与用于免疫的免疫原同时递送，例如与免疫原形成融合物；或者可分别递送，例如作为核酸分子所编码的肽。本段引用的所有参考文献全文纳入本文作为参考。
本发明第一种方法还包括选择至少一种被免疫动物产生的至少一种抗体的步骤。本发明第一种方法所选择的至少一种抗体可以是任何合适的抗体，包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体和抗体片段、本领域已知的制备物(参见例如全文纳入本文作为参考的《抗体：实验室手册》(Antibodies：A LaboratoryManual)，E.Harlow和D.Lane编，冷泉港实验室，1988，第726页；《单克隆抗体：实用方法》(Monoclonal Antibodies：A Practical Approach)，P.Shepherd和C.Dean编，牛津大学出版社，2000，第479页；和《鸡蛋黄抗体，产生与应用：IgY-技术，(Springer实验室手册)》(Chicken Egg Yolk Antibodies，Production andApplication：IgY-Technology，(Springer LabManual)，R.Schade等编，Springer-Verlag，2001，第255页)。抗体可以是天然的、修饰的或重组的。抗体片段包括但不限于：F(ab′)₂片段、Fab′片段、Fab片段、Fv片段和互补决定区(CDR)。重组抗体包括但不限于：单链抗体可变区片段(scFv)、小抗体(Muller等，(1998)，FEBS Lett.，432：45-49)、抗体融合蛋白等(参见，例如《抗体工程》(Antibody Engineering)，R.Kontermann和S.Dübel编，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg，第790页)。抗体可以是单价或多价，例如二价(Pluckthun和Pack，(1997)，Immunotechnology，3：83-105；Pack等，(1995)，J.Mol.Biol，246：28-34)。抗体可以是单特异性或多特异性，例如双特异性(Müller等，(1998)，FEBS Lett.，432：45-49)。本段引用的所有参考文献全文纳入本文作为参考。
相对于只用感染性生物的一种免疫原免疫动物获得的抗体，发明第一种方法所选择的至少一种抗体优选对感兴趣的感染性生物的交叉反应活性提高。交叉反应活性指对感兴趣的感染性生物的一种以上免疫原类型具有免疫学活性。所选择的交叉反应活性提高的至少一种抗体优选对大多数感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性，更优选对基本上大多数感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性，最优选对所有或基本上所有感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性。此外，所选择的交叉反应活性提高的至少一种抗体优选不会与样品中除感兴趣的感染性生物以外的物质(例如其它生物)发生特异性结合。对所述至少一种抗体的质量(例如其对所述抗原的特异性和亲和力及结合动力学)的免疫学特征鉴定可采用任何合适的方法，包括但不限于：斑点印迹试验、ELISA测定、竞争性免疫测定、取代性免疫测定、放射性免疫度量测定(radioimmunometric assay)、凝集试验、表面等离振子共振检测和它们的组合。
在一些情况中，所述至少一种抗体可以是一种抗体，例如一种分离的多克隆抗体制备物(如包含通过特异性亲和纯化方法制备的血清免疫球蛋白或免疫球蛋白衍生物的混合物的一种多克隆抗体制备物)或通过杂交瘤单克隆产生的单克隆抗体。在一些情况中，所述至少一种抗体可以是几种抗体，例如约2到10种分离的多克隆抗体制备物或例如由约2到10种不同杂交瘤克隆产生的单克隆抗体。在一些情况中，所述至少一种抗体可以是几种抗体，例如约10种分离的多克隆抗体制备物或例如约10种以上不同的杂交瘤克隆产生的单克隆抗体。
选择交叉反应活性提高的所述至少一种抗体可包括任何合适的选择方法，包括但不限于：盐沉淀、过滤或离心进行分子大小选择、亲和分离技术(例如，亲和层析、亲和沉淀)、离子交换和其它层析方法、配体交换、亲硫吸附、利用免疫球蛋白结合物质(例如，A蛋白、G蛋白、L蛋白、波罗蜜凝集素和其它凝集素、和甘露聚糖结合蛋白)纯化。选择可利用淘选技术(参见，例如全文纳入本文作为参考的Coomber，(2001)，Methods Mol.Biol.，178：133-145；Zhou等，(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，99：5241-5246；Fehrsen和du Plessis，(1999)，Immunotechnology，4：175-184；Deng等，(1994)，J.Biol.Chem.，269：9533-9538；Burioni等，(1998)，Res.Virol.，149：327-330；Boel等，(1998)，Infect.Immun.，66：83-88；和Parsons等，(1996)，Protein Eng.，9：1043-1049)。
选择交叉反应活性提高的所述至少一种抗体可包括利用抗体或抗体片段的定向演化(参见，例如全文纳入本文作为参考的Barbas等，(1994)，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，USA，91：3809-3813)。选择交叉反应活性提高的所述至少一种抗体可包括利用免疫原，例如重组表达系统或组合系统中其表位或肽的定向演化。合适的免疫原定向演化技术包括但不限于：在多肽(Kamb等，美国专利6,025,485；Christmann等，1999，Protein Eng，12：797；Abedi等，1998，Nucleic Acids Res.，26：623；Peelle等，2001，J.Protein Chem.，20：507)、噬菌体(He，1999，J.Immunol.Methods，231：105；Smith，1985，Science，228：1315)、核糖体(Schaffitzel等，1999，J.Immunol.Methods，231：119；Roberts，1999，Curr.Opm.Chem.Biol.，3：268)、mRNA(Wilson等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.，98：3750)、酵母细胞表面(Yeung和Wittrup，2002，Biotechnol.Prog，18：212；Shusta等，1999，J.Mol.Biol.，292：949)、细菌细胞表面(Leenhouts等，1999，Antonie Van Leeuwenhoek，76：367；Christmann等，2001，J.Immunol.Methods，257：163)或细菌孢子表面(Wittrup，2001，Curr.Opin.Biotechnol.，12：395；Boder和Wittrup，1998，Biotechnol.Prog.，14：55)上展示。本段引用的所有参考文献全文纳入本文作为参考。
本发明第一种方法还可包括提高所选择抗体亲和力的任选步骤。可通过合适的方法来提高抗体亲和力，例如但不限于亲和分离和定向演化技术。亲和分离可利用抗体对原初抗原、原初免疫原、修饰的抗原、修饰的免疫原或抗原或免疫原的模拟物，例如模拟表位的亲和力(参见，例如Smith等，(2002)，J.Chromatogr.B Anallyt.Technol.Biomed.Life Sci.，766：13-26；Murray等，(1997)，J.Chromatogr.A，782：49-54)。定向演化技术包括展示方法，例如但不限于在噬菌体、核糖体和mRNA上展示。参见，例如全文纳入本文作为参考的Schaffitzel等，(1999)，J.Immunol.Methods，231：119-135；Proba等，(1998)，275：245-253；He和Taussig，(1997)，Nucleic Acids Res.，25：5132-5134；Xu等，(2002)，Chem.Biol.，9：933-942；Xu等，(2003)，Chem.Biol.，10：91-92；Boder等，(2000)，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，USA，97：10701-10705；Scheir等，(1996)，J.Mol.Biol.，263：551-567；Barbas和Burton，(1996)，Trends Biotechnol.，14：230-234；和Crameri等，(1996)，Nature Med.，2：100-102)。
本发明第一种方法所产生的抗体可用于任何所需目的，包括免疫化学诊断、抗原的免疫化学亲和分离、免疫化学标记、抗原变异、演化或流行病学的免疫化学研究、疫苗开发研究、作为对象的感染性疾病的预防或治疗方法等。本发明第一种方法所产生抗体的一种优选应用是对患者感染性疾病状态的免疫化学诊断。
在本发明第一种方法的一个非限制性例子中，感兴趣的感染性生物是未分型流感嗜血菌(NTHi)，它可根据主要外膜蛋白OMP2(一种表面抗原)的抗原性差异来测定免疫原类型(Haase等，(1994)，Infect.Immun.，62：3712-3722；Groeneveld等，(1989)，Infect.Immun.，57：3038-3044)。在一些情况中，由于不连续的表面暴露的OMP2环中氨基酸序列变异可导致抗原性差异；这种变异造成在一个环上或组合环中发现存在差别性OMP2表位。与膜至少基本上相结合的OMP2分子中多个部位的氨基酸变异也可导致抗原性差异。
可用合适的技术从OMP2获得多免疫原制品。完整的、破碎的、裂解的或提取的未分型流感嗜血菌细胞或细胞组分(例如细胞膜)可用作OMP2免疫原。与细胞膜或细胞膜组分相结合的，或者与细胞膜完全或基本上分离的OMP2蛋白可以完整形式或片段或修饰形式用作OMP2免疫原。OMP2免疫原制品可包含一种或多种蛋白质片段，例如但不限于表面暴露的序列(例如，可变的外环)、埋于膜中的序列(例如，跨膜共有序列)、胞质膜结合序列和它们的组合。其它合适的OMP2免疫原制品可包含OPM2衍生的线形或非线形天然、重组或合成的肽，OMP2衍生的重组蛋白或融合蛋白，模拟OMP2表位的模拟表位，和能结合OMP2的至少一种抗体的抗独特型抗体或抗体片段。
可采用适合于动物种类、多免疫原制品和产生所需抗体的免疫给药方法，用多OMP2免疫原制品免疫合适的动物。在一非限制性例子中，当多免疫原制品包含从免疫学性质不同的未分型流感嗜血菌菌株纯化的基本上完整的OMP2蛋白质，和需要多克隆交叉反应活性抗-OMP2家兔抗体时，合适免疫方法的非限制性例子包括：(i)免疫每组一只或多只家兔(例如，每组1到10只家兔)，其中用免疫原制品的相同混合物免疫一组中每只家兔，用免疫原制品的不同混合物免疫各组，每种免疫原组合物至少使用一次；(ii)免疫至少一只，优选几只家兔，用所有的多免疫原制品免疫每只家兔；和(iii)免疫每组一只或多只家兔(例如，每组1到10只家兔)，其中用免疫原制品之一免疫一组中的每只家兔，每种免疫原制品至少使用一次。在其它非限制性例子中，类似于上述的免疫方法可利用含有以下物质的多免疫原制品：衍生自免疫学性质不同的未分型流感嗜血菌菌株OPM2蛋白的线形或非线形肽，衍生自这种OMP2蛋白的重组蛋白或融合蛋白，或模拟这种OMP2蛋白表位的模拟表位。
II.检测感染性生物的方法
本发明也包括检测存在一种以上免疫原类型的感染性生物的方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型，所述方法包括以下步骤：(a)提供怀疑含有至少一种抗原变体的样品；(b)提供通过以上标题为“I.交叉反应活性提高的抗体制备方法”所述的本发明第一种方法所产生的至少一种抗体；(c)在允许所述至少一种抗体与所述至少一种抗原变体结合形成复合物的条件下使样品与所述至少一种抗体接触；和(d)检测所述复合物，其中如果样品中感染性生物的浓度大于或等于参比浓度，则检测为阳性，如果样品中感染性生物的浓度小于参比浓度，则检测为阴性。当术语和概念“免疫原类型”、“免疫原类型测定”、“免疫原类型变异”、“抗原变体”、“抗原”、“免疫原”、“免疫原制品”、“免疫原性修饰”、“免疫原给药”和“交叉反应活性”用于本发明的第二种方法时，它们的含义如以上标题为“I.交叉反应活性提高的抗体制备方法”中所述或定义。
本发明第二种方法可应用于任何存在一种以上免疫原类型的感染性生物，包括细菌(包括支原体)、病毒和真核病原体(包括病原性真菌和原生动物)。由于至少一种抗原变异，即感染性生物的至少一种抗原中发现的变异导致免疫原类型的变异。因此，所述至少一种抗原变异可导致至少两种可区分的免疫原类型。本发明的第二种方法更适宜应用于能感染脊椎动物、无脊椎动物或植物的病原体。该方法最适宜应用于感染人、哺乳动物、鸟类、鱼、昆虫或植物的病原体。具体感兴趣的人病原体的非限制性选择包括流感嗜血菌(包括未分型的流感嗜血菌)、肺炎链球菌、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、砂眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎枝原体(Mycoplasma pneumoniae)、百日咳博德特菌(Bordetella pertusssis)、军团菌(Legionella species)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、诺卡菌(Nocardia species)、多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)、鼻硬节克雷伯菌(Klebsiella rhinoscleromatis)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas pseudomallei)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetti)、布鲁菌(Brucella species)、沙门菌(Salmonella species)、荚膜组织胞浆菌(Histoplama capsulatum)、厌酷球孢子菌(Coccidiodes immitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、流感病毒、人免疫缺陷病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肠道病毒、疱疹病毒、副流感病毒、水痘带状疱疹病毒和真核病原体。当需要检测或监测感兴趣的感染性生物存在与否或水平，而无论该感染性生物群体的免疫原类型组成时，该方法特别有用。
本发明第二种方法包括提供怀疑含有至少一种抗原变体的样品的步骤。合适的样品是怀疑含有至少一种感兴趣的抗原变体的样品。抗原可包括但不限于肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、糖蛋白、糖脂、脂蛋白、脂多糖、核酸与它们的组合。抗原可包括完整的分子、分子片段和多个分子的复合物。抗原可以是天然产生的抗原，或需要经过化学、物理、生物学或酶修饰从而可(例如)用于和抗体相互作用的抗原。抗原可，例如通过化学或物理修饰，包括但不限于：用化学试剂或酶处理，氧化或还原，用可检测标记物来标记和使表位与不同的部分、分子、分子结构或表面共价或非共价连接。
样品可以是任何感兴趣的样品，包括但不限于：完全天然来源的样品、完全非天然来源的样品(例如合成来源)或天然和非天然来源的组合。合适的样品包括但不限于：临床样品、病理学样品、生物学样品、环境样品和实验研究样品。样品可包括细胞、组织或器官，它们的任一种或全部可以是完整的或破碎的或裂解的或其它(方式)修饰的。样品可包括生物材料(例如但不限于血液、血清、血浆、尿、粪便、精液、粘液、排泄物和脑脊液)、灌洗液、抽吸物或擦拭物(例如口咽、鼻咽灌洗液、抽吸物或擦拭物)、组织样品或它们的组合。样品可以是从生物材料，例如原核生物、细菌、真核生物、植物、真菌、多细胞生物或动物、无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物、非人哺乳类动物和人制备的提取物。样品可以是从完整的生物或部分生物、细胞、器官、组织、体液，完整的培养物或部分培养物，环境样品或其一部分制备。如需要，样品可包含提取液、缓冲液、溶剂或其它化学或生物学试剂。在一些情况中，合适的样品可以是在任何合适的条件下怀疑含有感兴趣的感染性生物的样品，例如但不限于整个或完整的生物、破碎或裂解的生物、通过物理、化学、生物或酶处理或组合处理修饰的生物。在一些情况中，合适的样品可以是怀疑含有抗原变体而基本上不存在感兴趣的感染性生物的样品，例如样品包含基本上分离的细胞组分(例如细胞膜或细胞壁)或基本上分离的抗原(例如分离或纯化的蛋白质或碳水化合物)。样品可包含粗制的或半纯化的或纯化的抗原，或抗原模拟物，例如模拟表位。用于本发明方法的样品只需作最简单的制备(例如，收集到合适的容器中)，或更广泛的制备(例如但不限于：用一种或多种试剂处理；除去、灭活或阻断不利的物质，如污染物、不利的组分或内源性酶；过滤、分子大小选择或亲和纯化；组织或细胞固定、包埋或切片；组织渗透或细胞裂解；或浓缩或稀释)。
本发明第二种方法也包括提供通过以上标题为“I.交叉反应活性提高的抗体制备方法”所述的本发明第一种方法所产生的至少一种抗体的步骤。相对于只用衍生自感染性生物的一种免疫原免疫动物所产生的抗体，优选所述至少一种抗体对感兴趣的感染性生物的交叉反应活性有所提高。所述至少一种抗体优选对大多数感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性，更优选对基本上大多数感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性，最优选对所有或基本上所有感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性。
所述至少一种抗体可包含至少一种多克隆抗体、至少一种单克隆抗体、至少一种抗体片段或它们的任何组合。合适的抗体可以是天然的、修饰的或重组的，可包括F(ab′)₂片段、Fab′片段、Fab片段、Fv片段、互补决定区(CDR)、单链抗体可变区片段(scFv)、小抗体、抗体融合蛋白和抗体的工程改造模拟物。抗体可以是单价或多价，可以是单特异性或多特异性。所述的至少一种抗体可以是一种抗体、几种抗体或多种抗体。所述的至少一种抗体可与能模拟天然衍生自感染性生物的模拟表位(例如肽)结合(参见，例如全文纳入本文作为参考的Kieber-Emmons，(1998)，Immunol.Res.，17：95-108；Shin等，(2001)，Infect.Immun.，69：3335-3342；Beenhouwer等，(2002)，J.Immunol.，169：6992-6999；Hou和Gu，(2003)，J.Immunol，170：4373-4379和Tang等，(2003)，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，10：1078-1084)。
所述的至少一种抗体可任选包含官能团(例如化学活性部分或交联部分)或可检测标记；将这种官能团或可检测标记引入的方法是本领域已知的(参见，例如全文纳入本文作为参考的R.P.Haugland，《荧光探针和研究产物手册》(Handbook of Fluorescent Probes and Research Products)，第9版，J Gregory(编)，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA，2002，第966页；Seitz和Kohler，(2001)，Chemistry，7：3911-3925；《皮尔斯技术手册》(Pierce TechnicalHandbook)，Pierce Biotechnology，Inc.，1994，Rockford，IL；和Pierce，2003-2004，《应用手册和目录》(Applications Handbook and Catalog)，Pierce Biotechnology，Inc.，2003，Rockford，IL)。所述的至少一种抗体可用于多种形式或类型的试验，例如夹心试验，该试验涉及所述至少一种抗体的一种形式来固定抗原和所述至少一种抗体的至少一种可检测标记形式来结合同一抗原。
所述的至少一种抗体可以是游离溶液，或者可以暂时或永久地直接或间接固定在不同的部分、分子、分子结构、基质或表面上。在直接固定的一个非限制性例子中，所述的至少一种抗体可通过干燥暂时固定到或其它方式瞬时结合到一表面或基质中，而加入液体可导致所述至少一种抗体变得可移动。在直接固定的另一非限制性例子中，可通过与一表面(例如膜、微板孔、试管、芯片或载玻片)共价或非共价连接而永久固定所述至少一种抗体。在间接固定的一个非限制性例子中，可通过共价或非共价方式(例如通过被动吸附或亲和素/生物素结合)将所述至少一种抗体固定在颗粒(例如，乳胶、金或其它金属，或磁性或顺磁性材料的珠或纤维或颗粒)上，将携带抗体的颗粒暂时或永久固定在表面上或基质中。在间接固定的另一非限制性例子中，可利用连接部分，例如交联分子或多价分子(如亲和素)将所述至少一种抗体固定在不同的部分、分子、分子结构、基质或表面。
本发明第二种方法也包括在允许所述至少一种抗体与所述至少一种抗原变体结合形成复合物的条件下，使样品与所述至少一种抗体接触的步骤。所述至少一种抗体优选与所述至少一种抗原变体结合形成足够稳定的复合物从而可检测。所述至少一种抗体优选能与大多数导致产生感兴趣免疫原类型的抗原变体结合，更优选与基本上大多数导致产生感兴趣免疫原类型的抗原变体结合，最优选与所有或基本上所有导致产生感兴趣免疫原类型的抗原变体结合。所述至少一种抗体优选以足够的特异性与至少一种抗原变体结合从而使所述至少一种抗体和除导致产生感兴趣免疫原类型的变体以外的抗原结合最少或不结合。
可修饰所述至少一种抗原变体，例如在结合发生前修饰。修饰抗原是令人感兴趣的，例如修饰可提高所述至少一种抗体对所述至少一种抗原变体的结合亲和力和选择性，或利用修饰将所述至少一种抗原变体与样品中的其它物质分开。当所述至少一种抗体所要结合的抗原是一种修饰抗原时(例如，通过物理或化学处理修饰的抗原)，所述至少一种抗体优选能特异性结合该修饰的抗原。在一非限制性例子中，可通过引入化学官能团(例如巯基、羟基、醛基、氨基、羧基或其它活性基团)、交联剂或其它部分(例如，生物素或亲和素)来修饰该抗原，这些物质可通过合适的化学反应将抗原固定在基质或表面上。在另一非限制性例子中，可利用一种或多种化学试剂或酶试剂(例如但不限于：洗涤剂、溶剂、离液剂、酯酶、蛋白酶、糖苷酶等)处理来修饰抗原从而提高抗体-抗原结合(作用)。
本发明第二种方法也包括检测所述至少一种抗体与所述至少一种抗原变体之间形成的复合物的步骤，其中如果样品中感染性生物的浓度大于或等于参比浓度，则检测为阳性，如果样品中感染性生物的浓度小于参比浓度，则检测为阴性。可直接检测复合物，例如检测所述至少一种抗体上的标记。或者，可用任何合适的方法间接检测复合物，所述方法包括但不限于利用二抗，例如携带可检测标记的二抗。有用的可检测标记包括但不限于：荧光团、发光团、共振能量转移对的成员、镧系元素、染料、色素、放射性同位素、磁性标记、自旋标记(spin label)、重原子、金属、颗粒(例如金颗粒或磁性颗粒)和酶。
如果样品中感染性生物的浓度大于或等于参比浓度，则复合物的检测为阳性。相反，如果样品中感染性生物的浓度小于参比浓度，则复合物的检测为阴性。某给定感染性生物所选择的参比浓度取决于几种因素，包括但不限于：感染性生物(种类)、所述至少一种抗体和所述至少一种抗原变体的性质、样品的类型和样品来源(可以是患者，例如成人或儿童)。可通过常规测试确定参比浓度。检测可以是线性的(例如酶反应可用分光光度计检测形成的产物)或非线性的(例如用金标记作目测病毒)。检测任选至少是半定量的，例如，判断是大于或等于还是小于参比值，或例如判断是远大于、适度大于或等于还是小于参比值。检测可任选是定量的，其中阳性检测信号可与感染性生物的浓度范围相关联。
在一些情况中，当对样品中感染性生物的存在或绝对不存在感兴趣时，参比值可以是0。然而，取决于分析的目的，参比值可以是任何合适的数值或数值范围。在本发明的一个实施方案，当对对象患病或未患病感兴趣时，所需的参比浓度优选可产生至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的阳性预测值(即，感染性生物导致对象样品产生患病阳性检测结果的概率)。在这样的实施方案中，所需的参比浓度优选可产生至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的阴性预测值(即，感染性生物未导致对象样品产生患病的阴性检测结果的概率)。在一些情况中，本发明的某些这种实施方案可根据阳性检测信号的强度来半定量估计感染性生物的浓度。在其它情况中，阳性检测信号与参比值以上的感染性生物的浓度范围呈定量相关。
在一些情况中，样品可得自感染性生物的“携带者”，即虽然健康但通常有较低浓度的感染性生物寄居，而感染性生物的较高浓度与该生物引起的疾病症状相关。在这种情况中，所需参比浓度可低于检测结果阴性的无所述感染性生物寄居或虽有感染性生物寄居但依然健康的对象的样品浓度。该同一参比浓度优选等于或高于检测结果阳性的有所述感染性生物寄居因而患病的对象的样品浓度。因此，在本发明的一个实施方案中，检测结果阳性表明样品是来自至少有感兴趣的感染性生物寄居或因该生物寄居而患病的对象。在本发明的另一实施方案中，检测结果阴性表明样品是来自感兴趣的感染性生物的寄居未达到该感染性生物所致疾病相关水平的对象。
本发明第二种方法可任选同时或平行应用于一种以上抗原变异(衍生自一种或多种感染性生物)，或一种以上感染性生物。在一些情况中，为区分疾病的病因和确定合适的治疗方案，检测能引起相似症状的一种或多种感染性生物的存在或水平是令人感兴趣的。在一非限制性例子中，该方法可用于区分一种感染性生物的不同菌株，例如致病性或对某给定的药物或抗生素(antibiologic)的易感性不同的各种菌株。在另一非限制性例子中，令人感兴趣的是区分导致呼吸道疾病相似症状的病毒病原体的种类或毒株(参见，例如Mackie，(2003)，Paediatr.Respir.Rev.，4：84-90)，或区分导致呼吸道或胃肠道或中枢神经系统疾病相似症状的病毒病原体和细菌或真菌病原体(参见，例如Murphy，(2003)，Curr.Opin.Infect.Dis.，16：129-134；Tan，(2002)，Semin.Respir.Infect.，17：3-9；Heikkinen和Chonmaitree，(2003)，Clin.Microbial Rev.，16：230-241；Leclerc等，(2002)，Crit.Rev.Microbiol.，28：371-409；Sferra和Pacini，(1988)，Pediatr.Infect.Dis.J.，7：552-556)，因此，有助于确定合适的治疗方案，例如合适的抗病毒药物和抗细菌药物(Fendrick等，(2001)，Clin.Ther.，23：1683-1708)。在另一非限制性例子中，本发明第二种方法可用于控制感染性疾病，例如确定是否需要隔离患病个体以防(疾病)爆发或流行。本段所引用的所有参考文献全文纳入本文作为参考。
III.检测感染性生物的试剂盒
本发明也包括利用本发明第二种方法检测存在一种以上免疫原类型的感染性生物的试剂盒。为方便起见，可根据所用的测定方法来设计合适的试剂盒以执行该方法。合适的测定法包括但不限于：浸渍条或测试条测定、流通测定、层析测定、亲和分离测定、侧流测定(lateral flow assay)、乳胶凝集测定(latexagglutination assay)、放射性免疫度量测定(radioimmunometric assay)、酶联免疫吸附测定、荧光测定和发光测定。这些测定可以任何合适的形式进行，包括但不限于膜、过滤器、微量滴定板、试管、芯片、载玻片和流通室。测定优选快速、最优选足够快从而可在较短时间内，例如在患者与医生或其它卫生保健人员咨询期间产生结果。在一些情况中，可设计使这些试剂盒与测定方法能同时测定一种或几种样品。在其它情况中，可设计这些试剂盒与测定方法能测定许多样品，例如以多孔形式或高通量筛选。
除了进行测定的装置外，试剂盒可装有收集并适当处理样品的装置(例如药签、针头和注射器、Vacutainer或Monovette、抽吸样品的装置、洗涤溶液或缓冲液、细胞解离或裂解试剂、化学或酶试剂、过滤器、离心试管等)。试剂盒可装有标准品，例如半定量或定量的标准品。试剂盒可装有对照品，例如阳性和/或阴性对照品。试剂盒可装有有助于安全操作可能有害的样品的工具(例如手套和其它个人安全装置，装生物有毒物的一次性容器或消毒材料)。试剂盒可装有说明使用该试剂盒的方法、问题解答或结果解释的说明书；例如这些说明书可以是小册子、散页、手册、目录单或视听材料。
IV.交叉反应活性提高的抗体另一种制备方法
本发明包括对存在一种以上免疫原类型的感染性生物的交叉反应活性提高的抗体的另一种选择方法，其中由于至少一种抗原变异导致所述免疫原类型，该方法包括以下步骤：(a)提供由至少一种抗原变异所产生的多免疫原制品；(b)免疫多组动物，其中每组包括至少一只动物，并用单免疫原制品免疫每只动物；(c)从每组选择至少一种抗体；和(d)混合所选择的抗体，其中所选择抗体的混合物对感染性生物的交叉反应活性提高。当术语和概念“免疫原类型”、“免疫原类型测定”、“免疫原类型变异”、“抗原变体”、“抗原”、“免疫原”、“免疫原制品”、“免疫原性修饰”、“免疫原给药”和“交叉反应活性”用于本发明第四种方法时，它们的含义如以上标题为“I.交叉反应活性提高的抗体制备方法”中所述或定义。本发明第四种方法可应用于任何存在一种以上免疫原类型的感染性生物，包括细菌(包括支原体)、病毒和真核病原体，最适宜感染人、哺乳动物、鸟类、鱼、昆虫或植物的病原体。
本发明第四种方法包括提供衍生自所述至少一种抗原变异的多免疫原制品的步骤。该多免疫原制品如以上标题为“I.交叉反应活性提高的抗体制备方法”中所述制备和给药。
本发明第四种方法也包括免疫多组动物的步骤，其中每组含有至少一只动物并用一种免疫原制品免疫每只动物。可用于免疫的动物包括但不限于：鸡、小鼠、大鼠、家兔、绵羊、山羊、牛、马、非人灵长类动物和人。当多免疫原制品的数目等于n时，优选免疫n组动物，至少免疫n只动物。
本发明第四种方法也包括从每组中选择至少一种抗体的步骤。选择(步骤)可采用如以上标题为“I.交叉反应活性提高的抗体制备方法”所述的任何选择方法。相对于只用一种衍生自感染性生物的免疫原免疫动物产生的抗体，从每组中选择的至少一种抗体的每一种优选(但不是必需)各自对感兴趣的感染性生物的交叉反应活性提高。
本发明第四种方法还包括混合所选择抗体的步骤，其中所选择抗体的混合物对感染性生物的交叉反应活性提高。相对于只用衍生自感染性生物的一种免疫原免疫动物产生的抗体，本发明第四种方法产生的所选抗体混合物优选对感兴趣的感染性生物的交叉反应活性提高。所选抗体的的混合物优选对大多数感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性，更优选对基本上大多数感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性，最优选对所有或基本上所有感兴趣的免疫原类型具有交叉反应活性。
本发明第四种方法产生的所选抗体混合物可用于任何所需目的，包括免疫化学诊断、抗原的免疫化学亲和分离、免疫化学标记、抗原变异、演化或流行病学的免疫化学研究、疫苗开发研究、作为对象感染性疾病的预防或治疗方法等。本发明第四种方法所选择抗体的一个优选应用是患者感染性疾病状态的免疫化学诊断。本发明第四种方法所选择抗体可用于以上标题为“II.检测感染性生物的方法”中所述的方法来检测存在一种衍生免疫原类型的感染性生物，以及用于以上标题为“III.检测感染性生物的试剂盒”中所述方法的试剂盒中。
                           实施例
实施例1：制备免疫原
本实施例描述的非限制性实施方案是制备由于至少一种抗原变异所产生的一种或多种免疫原的方法。在本实施例中，感兴趣的感染性生物是未分型流感嗜血菌，导致免疫原类型变异的抗原是外膜蛋白2(OMP2)。
未分型的流感嗜血菌(NTHi)菌株编号19418、35540、43163、49401、49766、51997和53600购自美国模式培养物保藏所(ATCC)(Manassas，VA)，培养在多块巧克力琼脂平板上或液体培养基中(嗜血杆菌肉汤，目录号M-6534，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA，补加了4.4％甘油、0.003％氯高铁血红素和0.001％β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。平板或液体培养24到48小时后，通过刮板或离心液体培养物分别收集NTHi菌株的细胞。用羟乙基哌嗪乙磺酸酯(HEPES)缓冲液(pH 7.4)或其它合适的洗涤缓冲液，例如磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞数次。细胞立即用于提取或将湿沉淀物在-20摄氏度冷冻保存，最长2周。
采用全文纳入本文作为参考的Murphy和Bartos，(1988)，Infect.Immun.，56：1084所述方法分离7种未分的流感嗜血菌(NTHi)菌株的外膜蛋白OMP2。简言之，通过用洗涤剂缓冲液和差异性EtOH沉淀连续处理细胞使细胞膜蛋白与其它细胞组分分离。收集NTHi细胞，用HEPES缓冲液(0.01摩尔，pH7.4)洗涤并离心。将细胞沉淀重悬在HEPES缓冲液中，转移至Oak Ridge离心管，于4-6摄氏度用Sorvall SA600转头(rotor)以每分钟8000转离心20分钟。弃去上清液，细胞沉淀重悬在不到1毫升的HEPES缓冲液中，转移至含有搅拌棒的50-毫升Erlenmeyer瓶中。向该瓶中加入含有0.001摩尔β-巯基乙醇的2毫升乙酸钠缓冲液(pH4.0)和9体积含有以下物质的溶液：5％两性洗涤剂3-14(目录号693017，Calbiochem，San Diego，CA，USA)、0.5摩尔氯化钙、1微克每毫升抑胃肽酶、0.4毫克每毫升EDTA、0.1毫克每毫升Pefabloc SC(Fluka目录号76307，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)。于室温搅拌该细胞溶液至少1小时。向细胞悬液中加入乙醇至最终体积浓度为20％。混合该悬液，转移至Oak Ridge离心管，4-6摄氏度用Sorvall SA600转头以每分钟11,000转离心10分钟除去核酸和大块细胞物质。弃去沉淀物。向上清液中加入乙醇至最终体积浓度为80％。混合该悬液，转移至Oak Ridge离心管，4-6摄氏度用Sorvall SA600转头以每分钟11,000转离心20分钟。弃去上清液，细胞沉淀重悬在含有1微克每毫升抑胃肽酶和0.1毫克每毫升Pefabloc SC的3-4毫升缓冲液Z中(0.05摩尔Tris、0.05％两性洗涤剂3-14、0.01摩尔EDTA、pH8.0)。将合并的细胞悬液转移至含有搅拌棒的Erlenmeyer瓶中并于室温至少搅拌1小时。悬液转移至Oak Ridge离心试管，4-6摄氏度用Sorvall SA600转头以每分钟9,000转离心10分钟。合并上清液并用菌株号标记作为S1。细胞沉淀物重悬在含有1微克每毫升的抑胃肽酶和0.1毫克每毫升的Pefabloc SC的1-2毫升缓冲液Z中(0.05摩尔Tris、0.05％两性洗涤剂3-14、0.01摩尔EDTA、pH8.0)并在室温至少搅拌1小时。悬液转移至Oak Ridge离心试管，于4-6摄氏度在Sorvall SA600离心机中以每分钟9,000转离心10分钟。合并上清液，标记为S2和菌株号。将该OMP2蛋白制备物-80摄氏度保存在加入2.5％蔗糖的缓冲液Z中(0.05摩尔Tris、0.05％两性洗涤剂3-14、0.01摩尔EDTA、pH8.0)。用合适的方法(例如，SDS-PAGE电泳分析、ELISA或HPLC)鉴定如此制备的蛋白制备物的特性。也可通过离子交换和/或体积排阻层析从其它膜组分(例如其它蛋白质、脂多糖和糖蛋白)中纯化OMP2蛋白。
通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和银染色鉴定所得分离的OMP2蛋白的纯度和条带模式，图1描述了代表性的例子。根据以前的工作，菌株条带模式之间有明显差异。测定了OMP2条带的分子量。从至少3次蛋白分离物和电泳分析结果的平均值计算OMP2的平均分子量并按照ATCC NTHi菌株编号列于表1。
               表1
所计算的NTHi OMP2分离物的平均分子量