DNA阵列与单核苷酸多态性的检测方法.pdf

本发明提供了用于检测基因单核苷酸多态性的DNA阵列，其在固相基体上具有与基因多核苷酸杂交的序列部分是与基因第1多态型正确互补的1个以上的探针构成的第1探针点群、以及相同序列部分是与基因第2多态型正确互补的1个以上的探针构成的第2探针点群，其中，各自构成第1探针点群和第2探针点群的探针点为，每个探针点上的探针的长度不同。该DNA阵列能够更加正确地进行SNP检测。

1.  用于检测基因单核苷酸多态性的DNA阵列，其特征为，在固相基体上具有与基因多核苷酸杂交的序列部分是与基因第1多态型正确互补的1个以上的探针构成的第1探针点群、以及相同序列部分是与基因第2多态型正确互补的1个以上的探针构成的第2探针点群，其中，各自构成第1探针点群和第2探针点群的探针点为，每个探针点上的探针的长度不同。

2.  根据权利要求1所述的DNA阵列，其中，第1探针点群和第2探针点群各自由2～10个探针点构成。

3.  根据权利要求2所述的DNA阵列，其中，2～10的探针点是按照其探针长度的顺序排布的。

4.  用于检测基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征为，至少含有权利要求1至3的任一项所述的DNA阵列。

5.  使用权利要求1至3的任一项所述的DNA阵列检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征为，包括以下的步骤：
(a)由被检基因制备标记多核苷酸的步骤；
(b)使标记多核苷酸与带有探针的固相基体接触的步骤；
(c)对由与DNA阵列上探针杂交的标记多核苷酸得到的信号进行测定的步骤。

6.  根据权利要求5所述的单核苷酸多态性的检测方法，其中，将所述步骤(c)中测定的，所述第1探针点群和所述第2探针点的各自的信号进行比较。

7.  使用权利要求1至3的任一项所述的DNA阵列，确定用于检测基因单核苷酸多态性的适宜的探针长度的方法，其特征为，把满足以下步骤：
(a)由被检基因制备标记多核苷酸的步骤；
(b)使标记多核苷酸与DNA阵列接触的步骤；
(c)测定DNA阵列上的各探针结合的标记多核苷酸的标记信号，和以下标准：
(i)当被检基因为纯合第1多态型时，可在第1探针点群观察到标记信号，
ii)当被检基因为纯合第2多态型时，可在第2探针点群观察到标记信号，
(iii)当被检基因为杂合多态型时，可在第1探针点群和第2探针点观察到同等程度的标记信号，
的探针点的探针长度确定为用于检测其基因单核苷酸多态性的适宜的探针长度。

8.  用于检测基因单核苷酸多态性的DNA阵列，其特征为，在固相基体上具有与基因多核苷酸杂交的序列部分是与基因第1多态型正确互补的1个以上的探针构成的第1探针点、以及相同序列部分是与基因第2多态型正确互补的1个以上的探针构成的第2探针点，其中，构成第1及第2探针点的探针长度是用权利要求7所述的方法确定的长度。

DNA阵列与单核苷酸多态性的检测方法
技术领域
本发明涉及DNA阵列与单核苷酸多态性的检测方法。进一步详细讲，本发明涉及能够更加正确地检测出单核苷酸多态性的DNA阵列，和使用了该DNA阵列的单核苷酸多态性的检测方法。
背景技术
随着迎来后基因组时代，对正确、高效，进而低成本检测核苷酸序列中的碱基种类的新技术提出了要求。例如，SNP(Single Nucleotide Polymorphism：单核苷酸多态性)是以约0.1％(约1000个碱基中有1个)的比例存在于人类基因组的频率最高的多态性。即，所说的单核苷酸多态性的意思是，通过基因组基因的单个碱基置换为其他碱基，例如与野生型是G-C碱基对的情况相对，在多态型中变为A-T碱基对的状态。另外，存在着二倍体染色体的各自的等位基因为多态型的情况(纯合多态型)，以及一方为野生型、另一方为多态型的情况(杂合多态型)。
这样的单个碱基的突变有时会导致例如密码子突变引起的突变氨基酸的合成(错义突变)、或终止密码子的生成引起的不完全蛋白质的合成(无义突变)。所以，SNP的有无与各种疾病也有关这一情况逐渐变得明确(例如与肺癌有关的p53基因的SNP：非专利文献1)，以诊断或遗传治疗方法等为目的正确判定SNP的有无(SNP分型)也变得越来越重要。另外，SNP也是探索与疾病罹患性或药物反应性有关的基因时的有用的多态性标记，并作为定制治疗(テ一ラ一メイド医療)的重要的基因信息引起了关注。
作为SNP分型的方法，已知“利用杂交效率的方法”、“利用酶识别效率的方法”、“利用电技术的方法”等，特别是利用杂交效率的方法，对其在DNA阵列(例如参考专利文献1-4，非专利文献2、3)方面的适用进行了各种研究，例如非专利文献4中报告了使用DNA阵列的BRCA1基因SNP的检测例子。
但是，该SNP检测用的DNA阵列为，例如，与目的基因的野生型序列互补的第1探针点和与该基因的单核苷酸多态性序列互补的第2探针点排布于固相基体上。这样，在进行SNP检测时，使通过使用荧光标记引物的PCR扩增等手段制备的目的基因cDNA与该DNA阵列接触。目的基因为野生型时，该标记cDNA与第1探针杂交，只从第1探针点得到荧光信号(纯合野生型)。另一方面，目的基因的双方的等位基因均为SNP时，只从第2探针点得到荧光信号(纯合SNP)；一方的等位基因为SNP时，从第1探针点和第2探针点的双方得到同等程度的荧光信号(杂合SNP)。
专利文献1：美国专利第5,474,796号说明书
专利文献2：美国专利第5,605,662号说明书
专利文献3：国际公开第95/251116号小册子
专利文献4：国际公开第95/35505号小册子
非专利文献1：Biros et al.Neoplasma 48(5)：407-11，2001
非专利文献2：Schena，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：10614-10619，1996
非专利文献3：Heller，R.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94：2150-2155，1997
非专利文献4：Hacia JG et al.Nat.Genet.14：441-447，1996
发明内容
在使用DNA阵列的SNP检测中，以各自探针点的荧光信号作为指标，区别野生型、纯合SNP、杂合SNP是并不容易的。即，各自来源于野生型基因和多态型基因的标记cDNA只有一个碱基不同。所以，野生型cDNA的大多数与与其完全互补的野生型探针(第1探针)杂交，但是一部分还与单个碱基不同的第2探针杂交。同样地，多态型cDNA也有一部分与第1探针杂交。因此，利用DNA阵列的SNP检测是通过比较第1探针点和第2探针点各自的荧光信号而进行的，但是也有两者的信号强度的比较很困难的情况，其结果存在着进行了错误SNP判定的不良情况。
因此，本申请的发明的课题是提供能够使SNP检测更加正确的DNA阵列和使用该DNA阵列的SNP检测方法。
进一步本申请的发明的课题是提供，在使用DNA阵列检测SNP时，确定能够使检测更加正确的探针长度的方法，和具有利用该方法确定的特定长度的探针的DNA阵列。
本申请的发明人等发现，对于每个作为SNP检测对象的被检基因来说，可以得到正确判定SNP形态的最适标记信号的探针长度是不同的，从而完成了本发明。
本申请中，作为解决所述课题的第1发明，提供了用于检测基因单核苷酸多态性的DNA阵列，其特征为，在固相基体上具有与基因多核苷酸杂交的序列部分是与基因第1多态型正确互补的1个以上的探针构成的第1探针点群、以及相同序列部分是与基因第2多态型正确互补的1个以上的探针构成的第2探针点群，其中，各自构成第1探针点群和第2探针点群的探针点为，每个探针点上的探针的长度不同。
该第1发明的DNA阵列中，优选的方式为，第1探针点群和第2探针点群各自由2～10个探针点构成。
另外，该第1发明的优选的方式为，所述方式中2～10的探针点是按照其探针长度的顺序排布的。
本申请中，作为第2发明提供了，至少含有所述第1发明的DNA阵列的、用于检测基因单核苷酸多态性的试剂盒(kit)。
本申请中，作为第3发明提供了，使用所述第1发明的DNA阵列检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征为，包括以下的步骤：
(a)由被检基因制备标记多核苷酸的步骤；
(b)使标记多核苷酸与带有探针的固相基体接触的步骤；
(c)对由与DNA阵列上探针杂交的标记多核苷酸得到的信号进行测定的步骤。
该第3发明的方法中，进一步优选的方式为，将所述步骤(c)中测定的，所述第1探针点群和所述第2探针点群的各自的信号进行比较。
本申请中，作为第4发明提供了，使用所述第1发明的DNA阵列，确定用于检测基因单核苷酸多态性的适宜的探针长度的方法，其特征为，把满足以下步骤：
(a)由被检基因制备标记多核苷酸的步骤；
(b)使标记多核苷酸与DNA阵列接触的步骤；
(c)测定DNA阵列上的各探针结合的标记多核苷酸的标记信号，和以下标准：
(i)当被检基因为纯合第1多态型时，可在第1探针点群观察到标记信号，
(ii)当被检基因为纯合第2多态型时，可在第2探针点群观察到标记信号，
(iii)当被检基因为杂合多态型时，可在第1探针点群和第2探针点群观察到同等程度的标记信号，
的探针点的探针长度确定为用于检测其基因单核苷酸多态性的适宜的探针长度。
进一步，本申请中，作为第5发明提供了用于检测基因单核苷酸多态性的DNA阵列，其特征为，在固相基体上具有与基因多核苷酸杂交的序列部分是与基因第1多态型正确互补的1个以上的探针构成的第1探针点、以及相同序列部分是与基因第2多态型正确互补的1个以上的探针构成的第2探针点，构成第1及第2探针点的探针长度是用所述第4发明的方法确定的长度。
第1发明的DNA阵列，具有能够对各种单核苷酸多态性更加正确地进行杂交的由各种探针长度构成的探针点。所以，利用使用了该第1发明的DNA阵列的第3发明的方法，能够进行更加正确的SNP检测。
另外，利用第4发明的方法，对于作为SNP检测对象的每个基因，确定适宜的探针长度。接着，利用该方法，提供了含有由适于各基因的探针长度构成的探针点的第5发明的DNA阵列。
这里，在本申请的发明中，所说的“单核苷酸多态性”是指例如具有与基因数据库等中登记的基因序列不同的单个碱基突变的情况。所以，数据库等中登记的基因序列不一定就意味着是野生型(正常型)，另外，具有单个碱基突变的基因也不一定就是突变基因。但是，对于已知的单个碱基突变与疾病有关的基因，可以将“野生型”定义为“正常型”，将单核苷酸多态性定义为“突变型”。所以，本申请的发明中所说的基因“第1多态型”和“第2多态型”，基本上不是意味着“野生型”和“突变型”，而是定义为以下说明中的，第1多态型是数据库等中登记的基因序列的形态，第2多态型是第1多态型序列中的单个碱基被其它碱基取代而成的形态。
本申请的发明中所说的“基因多核苷酸”，具体是指作为SNP检测对象的基因的基因组DNA、由基因组DNA转录得到的mRNA、或由mRNA合成的cDNA。另外，该多核苷酸为多个核苷酸，优选30以上，更优选50以上的核苷酸结合形成的分子。
本申请的各发明的具体构成，在发明的实施方式说明或实施例中进行了详细说明。另外，本发明中的用语或概念，除特别规定外，均为在本技术领域中通常使用的范围内。进一步，实施本发明所使用的各种技术，除特别明示其出处的技术外，均为本领域技术人员基于公知文献等就能够容易且确切实施的。例如，基因工程学及分子生物学技术记载于Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，1989；Ausubel，F.M.et al，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等中。
附图说明
图1为表示本发明的DNA阵列的构成例的模式图。
图2为表示本发明的DNA阵列的其它构成例的模式图。
图3为表示使用本发明的DNA阵列，检测基因GNB3的SNP的例子的荧光图象。
图4为表示使用本发明的DNA阵列，检测基因MTHFR的SNP的例子的荧光图象。
图5为表示使用本发明的DNA阵列，检测基因CYP 2C19-2及CYP2C19-3各自的SNP的例子的荧光图象。
具体实施方式
第1发明的DNA阵列，在固相基体上具有1个以上的探针构成的第1探针点群和同样由1个以上的探针构成的第2探针点群。构成第1探针点群的各探针为，与作为分析对象的基因多核苷酸杂交的序列部分是与相同基因的第1多态型正确互补；构成第2探针点群的各探针为，与相同基因多核苷酸杂交的序列部分是与相同基因的第2多态型正确互补。其中，各自构成第1探针点群和第2探针点群的探针点，由各自长度不同的探针构成。
进一步具体讲，所说的“探针点”是，1个以上，优选10³～10¹³个相同探针(相同序列、相同长度的探针)的集团与其它探针点分离存在的区域。所说的“探针点群”的意思是，相同序列、且不同长度的探针构成的探针点的集团。该集团的一个优选的方式为，由2～10探针点构成的集团。另外，这些探针点的优选的方式为，将构成它们的探针按照长度的顺序成列排布。以下，有时将这样成列排布的探针点群记载为“探针点列”。进一步，第1探针点列和第2探针点列也可以是，由相同探针长度构成的探针点彼此相对。
图1为第1发明的DNA阵列的构成例。该第1图的例子中，第1探针点(黑圈)的列和，第2探针点(白圈)的列，各自由8个探针点构成。另外，各探针点为，各自含有的探针按照长→短的顺序成列排布成第1～8段。即，分别构成第1段的第1探针点列和第2探针点列探针为n个核苷酸(nmer)，从以下第2段点的探针开始，依次为n-1mer，n-2mer，n-3mer，n-4mer，n-5mer，n-6mer，n-7mer。这时的“n”为10～100左右，优选20～50左右。
“长度的顺序”可以是长→短的顺序，也可以是短→长的顺序。另外，探针长度的不同可以是每差1个碱基的差别，或者也可以是每差2或3个碱基的差别。进一步，该图1的例子中的第1探针点列和第2探针点列各自的点是纵向(由上至下)排布的，但也可以横向(由右至左)排布。
又进一步，也可以使相同探针(相同序列、相同长度的探针)构成的探针点2～5个左右成列排布。例如，图2为，第1探针点列和第2探针点列的各段中，相同探针构成的3个探针点各自并排排布。即，由于相同探针构成的多个探针点的存在，可以排除各个探针点中包含的探针数有若干变动带来的影响。
第1发明的DNA阵列为，除排布了如上的探针点群(优选探针点列)外，可以与通常的DNA阵列同样地制作。作为DNA阵列的制作方法，已知在固相载体表面直接合成捕获探针的方法(在片法(on-chip法))和将预先制作的探针固定在固相载体表面的方法，本发明的DNA阵列优选使用后一方法进行制作。将预先制作的探针固定在固相载体表面时，合成引入了官能基的探针，将探针点附到进行了表面处理的固相载体表面上，使其共价结合(例如，Lamture，J.B.et al.Nucl.Acids Res.22：2121-2125，1994；Guo，Z.et al.Nucl.Acids Res.22：5456-5465，1994)。一般地，捕获探针是经由间隔基或交联剂共价结合到进行了表面处理的固相基体上。还已知使聚丙烯酰胺凝胶微片整齐排列在玻璃表面，使探针共价结合于此的方法(Yershov，G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4913，1996)，或者在披覆了聚L-赖氨酸的固相基体上结合探针的方法(特开2001-186880号公报)也是已知的。另外，还已知在二氧化硅微阵列上制作微小电极的阵列，在电极上设置含有链抗生物素蛋白的琼脂糖浸透层作为反应部位，通过使该部位成正电荷而固定生物素化探针，控制该部位的电荷，以高速严格地进行杂交的方法(Sosnowski，R.G.et al.Proc.Natl.Aead.Sci.USA 94：1119-1123，1997)。本发明的DNA阵列，可以利用以上的任一种方法制作。另外，使探针滴落在固相基体表面上进行点样时，可以采用点样针(ピン)方式(例如美国专利第5,807,5223号)进行，但是由于特开2001-116750号公报或特开2001-186881号公报中公开的喷墨方式可以形成均一的一定形状的点，因此是优选的。另外，该喷墨方式中，由于可以使各个探针点中包含的探针数相同，因此可以通过探针长度的不同正确测定杂交的不同。进一步，进行如特开2001-186880号公报中公开的反复点样，或者使用由WO 03/038089 A1号小册子中公开的组成构成的探针溶液(含有保湿性物质的溶液)，由于可以形成优选的点因此是推荐的。
点样后，经过冷却，对点赋予水分(在湿度～80％左右保持一定时间)，由烧成干燥进行固化处理等，将各点固定在固相基体上，就可以完成DNA阵列。
其中，DNA阵列的固相基体，除通常的DNA阵列中使用的玻璃(载玻片)外，还可以使用塑料、硅树脂、陶瓷等。
第2发明为，单核苷酸多态性检测用试剂盒，其特征为，包括所述的DNA阵列。该试剂盒，例如可以由DNA阵列、引物、PCR缓冲液、dNTP、MgCl₂、Taq DNA聚合酶等构成。
第3发明的方法为，使用所述第1发明的DNA阵列检测基因单核苷酸多态性的方法，其特征为，必须包括以下步骤：
(a)由被检基因制备标记多核苷酸的步骤；
(b)使标记多核苷酸与带有探针的固相基体接触的步骤；
(c)对由与DNA阵列上探针杂交的标记多核苷酸得到的信号进行测定的步骤。
步骤(a)的被检基因为已知存在SNP的基因，标记多核苷酸为，例如可以使用现存的SNP数据库(例如http://SNP.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)等中公开的引物组，作为从被检者分离的基因组基因或tRNA起始的PCR产物(cDNA)来制备。该PCR扩增时，引入标记引物(例如菁系有机色素；结合了Cy3、Cy5等的引物)，制成标记多核苷酸。
步骤(b)中，使目的核苷酸序列与DNA阵列接触，使其与DNA阵列的探针杂交。杂交可以通过将分注在96孔或384孔塑料盘上的标记多核苷酸水性液点附于DNA阵列上来实施。点附量可以是1～100nl左右。杂交优选在室温～70℃的温度范围、1～20小时的时间范围内实施。杂交结束后，使用表面活性剂和缓冲液的混合溶液进行清洗，除去未反应的标记多核苷酸。作为表面活性剂，优选使用十二烷基硫酸钠(SDS)。作为缓冲液，可以使用柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、tris缓冲液、两性离子缓冲液等，优选使用柠檬酸缓冲液。
步骤(c)中，测定从探针杂交的标记多核苷酸得到的信号。接着，由得到的信号，例如如下检测SNP。
首先，以20,000作为得到的信号的截断值，算出第1探针点群和第2探针点群的至少任一方的信号在20,000以上的部分的第1探针点群和第2探针点群的信号比(第1/第2)，
(1)信号比＞5时，判定被检基因为纯合第1多态型；
(2)信号比＜0.2时，判定被检基因为纯合第2多态型；
(3)进一步，信号比为0.2以上5以下时，判定被检基因为杂合多态型。
作为进一步的其它判定方法，使用图1例示的DNA阵列的情况下，在构成第1探针点列的8个点上全部观察到信号，在构成第2探针点列的4个点上观察到信号时，符合所述(1)，判定该被检基因为纯合多态型。或者另外，即使是在从第1探针点列和第2探针点列各自得到相同数量的信号点的情况下，当第1探针点列的信号点的信号强度的总和比第2探针点列多时，也符合所述(1)，判定该被检基因为纯合第1多态型。
另外，所述(3)的判定基准也可以是，信号点的数量相同，使各自的信号强度的总和为30％以下，优选20％以下，更优选10％以下的情况。
即，与以前的方法中，比较单一的第1探针点和第2探针点的信号强度的多寡相对，该第3发明的方法中，从各自由多个点构成的探针点群中测定到更多发出信号的点数，将其进行比较。因此，能够以比以前方法高得多的高精度检测SNP。
其中，第3发明的标记多核苷酸的制备或杂交程序等，例如记载于特开2001-095574号公报等很多专利文献、非专利文献中，可以适当采用这些文献记载的方法进行。
第4发明的方法为，使用所述第1发明的DNA阵列，确定用于检测各基因单核苷酸多态性的适宜的探针长度的方法。具体地，按照所述第3发明的方法检测SNP时的最适探针长度，也就是能够最正确地反映各自单核苷酸多态性的探针长度，即为在该第4发明中确定的探针长度。所以，从利用以检测被检者SNP为目的的第3发明的方法得到的数据，可以得到适宜的探针长度。
接着，提供了第5发明的DNA阵列，其针对各基因分别具有由适宜探针长度构成的探针点。该第5发明的DNA阵列为，针对一个被检基因，分别具有“一个”第1探针点和第2探针点。构成各自探针点的探针为，用于检测其基因的SNP的最适长度。所以，该第5发明的DNA阵列可以具有，比第1发明的DNA阵列多得多的以基因SNP检测为对象的探针点，而且SNP的检测规则与第1发明的DNA阵列在实质上是相同的。
实施例
以下，列举实施例对于本发明进行进一步详细具体的说明，但本发明不被以下的例子限定。
实施例1
(1)DNA阵列的制作
以各自相差1碱基的长度，分别合成与基因GNB3、MTHFR的各自多核苷酸(cDNA)杂交的序列部分与各自基因的第1多态型正确互补的第1探针，以及相同序列部分与第2多态型正确互补的第2探针。各探针的碱基序列为，基因GNB3用的第1探针(GNB3C-01～08)为SEQ ID No.1-8，第2探针(GNB3T-01～08)为SEQ ID No.9-16，基因MTHFR用的第1探针(MTHFRC-01～08)为SEQ ID No.17-24，第2探针(MTHFRT-01～08)为SEQ ID No.25-32。另外，SEQ ID Nos.1-32的各碱基序列的5′端上连结有碱基序列“TTTTT”。
用氨基修饰这些探针的5′，在寡DNA固定化用环氧玻璃基板上，以每1点200pL的量点样50pmol/μL的溶液。另外，第1探针点列和第2探针点列的构成为，如图2所示，将相同探针构成的探针点并排排布各3个。
点样后，在42℃、且相对湿度50％的条件下孵育一夜。接下来，于室温用0.2％的SDS水溶液清洗2分钟，进一步于室温用灭菌水清洗2次，每次1分钟。最后，在50℃的灭菌水中孵育20分钟后，在离心机中进行1000rpm×5分钟的离心，干燥。
(2)标记多核苷酸的制备
从基因型明确的被检者血液中提取的DNA作为模板，在以下的PCR条件下进行扩增，制备标记多核苷酸。
·引物1：5pmol(5′末端Cy3标记)
·引物2：5pmol
·×10缓冲液：2.5μl
·2mM dNTP：2.5μl
·25mM MgCl₂：2.5μl
·Taq DNA聚合酶：1U
·提取DNA溶液：20ng
扩增条件
94℃/5分种
94℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒(35个循环)
72℃/2分种
(3)杂交
将所述(2)中制备的标记多核苷酸与0.3N NaOH(终浓度)混合，变性为单链后，添加200mM柠檬酸-磷酸缓冲液(pH6.0)、2％SDS、750mMNaCl、0.1％NaN₃(均为终浓度)，混合，制成样品。
接着，将杂交样品滴在所述(1)中制作的DNA阵列上，盖上盖玻片，在55℃且相对湿度100％的潮湿箱(モイスチヤ一チヤンバ一)内孵育一夜。反应后，取下盖玻片，于55℃在预先加温至55℃的2×SSC、1％SDS水溶液中浸渍20分钟。接着，在50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.025％Tween20水溶液中浸渍15分钟后，在离心机中以1000rpm离心5分钟，干燥。
(4)信号测定
利用Scan Array(Packard BioScience社制)，以激光功率100％、光电倍增100％测定荧光图象。得到的荧光图像如图3、4所示。另外，利用GenePixPro(Axon社制)将得到的图像信号数值化(表1-3)。
以20,000作为得到的信号的截断值，算出第1探针点和第2探针点的至少任一方的信号在20,000以上的部分的第1探针点和第2探针点的荧光信号比(第1/第2)。荧光信号比＞5时判定为纯合第1多态型，＜0.2时判定为纯合第2多态型，在0.2以上5以下时判定为杂合多态型，可以确认其与事实一致。
表1